熒光實(shí)時(shí)定量PCR2014

1、熒光實(shí)時(shí)定量熒光實(shí)時(shí)定量PCRPCR4 4 基本概念基本概念化學(xué)原理化學(xué)原理1 12 23 3等位基因鑒定原理等位基因鑒定原理數(shù)學(xué)原理數(shù)學(xué)原理 基本概念基本概念1 1PCR典型的典型的PCRPCR四階段四階段實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量和定性分析在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比增加。通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，我們就可以得到熒光擴(kuò)增曲線R REALEAL- -TIMETIME PCR VS PCR PCR VS PCR1. 1.熒光染料摻入的原理？熒光

2、染料摻入的原理？ 熒光強(qiáng)度與模板的數(shù)量成正比熒光強(qiáng)度與模板的數(shù)量成正比2. 2.如何根據(jù)擴(kuò)增曲線來進(jìn)行模板的定量分析？如何根據(jù)擴(kuò)增曲線來進(jìn)行模板的定量分析？化學(xué)原理化學(xué)原理2 2熒光實(shí)時(shí)定量熒光實(shí)時(shí)定量PCRPCR技術(shù)的產(chǎn)生技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報(bào)告：使用EBEB加入PCR反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度核酸 染料熒光后來用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBR Green ISYBR Green I 取代 EB.EB.熒光探針熒光探針雜交技術(shù)兩種定量化學(xué)兩種定量化學(xué)染料染色SYBR Green IEB探針標(biāo)記Tagman分子信標(biāo)染料染色染料染色S

3、YBR Green I 是一種DNA小溝結(jié)合染料PCR過程中染料的摻入：信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA分子數(shù)正比擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線存在的問題存在的問題引物擴(kuò)增的是否是引物擴(kuò)增的是否是單一單一的的目的基因目的基因？通過擴(kuò)增曲線進(jìn)行目的基因的定量分析通過擴(kuò)增曲線進(jìn)行目的基因的定量分析檢驗(yàn)方法：熔解曲線檢驗(yàn)方法：熔解曲線熔解曲線熔解曲線PCR過程中，可控制溫度緩慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec)dsDNA解鏈成為ssDNASYBR Green I被釋放，熒光信號(hào)消失對(duì)熔解曲線求一階導(dǎo)數(shù)，峰值代表斜率改變最大值，即TmTm值：50%DNA變成單鏈時(shí)的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長度、

4、GC含量有關(guān)，可部分代表序列的特異性融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確擴(kuò)增曲線有效融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確擴(kuò)增曲線無效熔解曲線熔解曲線染料的特點(diǎn)染料的特點(diǎn)探針標(biāo)記探針標(biāo)記TaqmanTaqman探針探針一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增有關(guān)。探針5端連接熒光基團(tuán)，3端連接淬滅基團(tuán)。利用了PCR延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5外切酶活性，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離。熱變性，配對(duì)熱變性，配對(duì)聚合酶，延伸聚合酶，延伸信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNADNA分子數(shù)成正比分子數(shù)成正比熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)(FRET)Oligo

5、1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer10nm探針的特點(diǎn)探針的特點(diǎn)方法方法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍適用范圍SYBR Green I SYBR Green I 方法方法適用性廣適用性廣靈敏靈敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶易出現(xiàn)非特異性帶不能進(jìn)行多重定量不能進(jìn)行多重定量適合科研中對(duì)各種目的適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研究組動(dòng)植物的研究TaqMan TaqMan 方法方法特異性高特異性高重復(fù)性好重復(fù)性好多重定量多重定

6、量價(jià)格高價(jià)格高只適合特定目標(biāo)只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐藥病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究基因研究, ,藥物療效考核藥物療效考核遺傳疾病的診斷遺傳疾病的診斷不同定量方法的比較不同定量方法的比較數(shù)學(xué)原理數(shù)學(xué)原理3 3 橫坐標(biāo)：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（CycleCycle） 縱坐標(biāo)：縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 每個(gè)每個(gè)循環(huán)延伸步驟進(jìn)行循環(huán)延伸步驟進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集一次熒光信號(hào)的收集擴(kuò)增曲線圖擴(kuò)增曲線圖理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到定值M時(shí):M= X0 *2 Clog2 M=log2 (X0 *2 C) log2

7、 M=log2 X0 +log22 Clog2 M=log2 X0 +C整理得:= - + log MC：產(chǎn)物到M值的循環(huán)數(shù)= - + log MM:閾值 C(Cq/Ct)：產(chǎn)物到閾值的循環(huán)數(shù)Log XLog X0 0（初始模板量）與（初始模板量）與 CtCt呈反比的線性關(guān)系。呈反比的線性關(guān)系。公式的成立條件理想的PCR X=X0*2n 非理想 X=X0*（1+Ex）n 指數(shù)增長期（起飛階段）設(shè)定閾值指數(shù)增長期（起飛階段）設(shè)定閾值1)不同樣品間擴(kuò)增效率的相對(duì)差異小2)同一樣品不同次的擴(kuò)增效率的相對(duì)差異小 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定，對(duì)數(shù)期 Ct值則極具重現(xiàn)性2 2種定量目標(biāo)種定

8、量目標(biāo)檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法病毒感染的定量監(jiān)測(cè) HIV RNA，HCV RNA不同處理的樣本之間基因的表達(dá)差異2 - Ct 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法藥物處理對(duì)目的基因表達(dá)的影響病人和正常人目的基因的差異絕對(duì)定量絕對(duì)定量相對(duì)定量相對(duì)定量絕對(duì)定量絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線LogX0與Ct呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量相對(duì)定量內(nèi)參相對(duì)定量內(nèi)參u在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異u穩(wěn)定內(nèi)參 18S，b-Actin，GAPDHp在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影

9、響小p內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線 待測(cè)樣品目的基因的濃度 待測(cè)樣品內(nèi)參基因的濃度 . 對(duì)照樣品目的基因的濃度 對(duì)照樣品內(nèi)參基因的濃度 考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正擴(kuò)增效率目的基因處理前后變化=1. 1.熒光染料摻入的原理？熒光染料摻入的原理？ 熒光強(qiáng)度與模板的數(shù)量成正比熒光強(qiáng)度與模板的數(shù)量成正比2. 2.如何根據(jù)擴(kuò)增曲線來進(jìn)行模板的定量分析？如何根據(jù)擴(kuò)增曲線來進(jìn)行模板的定量分析？等位基因鑒定原理等位基因鑒定原理4 4雙探針法雙探針法分析應(yīng)用分析應(yīng)用基因表達(dá)的絕對(duì)定量分析病原微生物或病毒含量的檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物基因拷貝數(shù)檢測(cè)基因表達(dá)的相對(duì)定量分析不同處理樣本間特定基因表達(dá)差異，特定基