蛋白質(zhì)含量測定方法匯總

1、實驗七  蛋白質(zhì)含量測定 測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮脲(Biuret)法，酚試劑法(Lowry)法及紫外吸收法。目的要求1掌握測定蛋白質(zhì)的含量基本方法。2了解染料法、雙縮脲法、Lowry法和紫外吸收法測定原理。 一、染料法實驗原理在酸性溶液中染料考馬斯亮藍G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合，此時考馬斯亮藍G-250顏色從紅色變?yōu)樗{色，吸收高峰從460nm移至595nm。利用這個原理可以測定蛋白質(zhì)含量。該法近年在某些方面有取代經(jīng)典的Lowry法趨勢，因為它操作簡單，反應(yīng)時間短，染料-蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定，抗干擾性強。本法的缺點是：對于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白

2、氨基酸組成有較大差異的蛋白質(zhì)，有一定誤差，因為不同的蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合是不同的，故該法適合測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相近的蛋白質(zhì)。器材吸量管； 試管；721型分光光度計試劑1.標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。2.待測蛋白質(zhì)溶液。3.染料溶液：稱取考馬斯亮藍G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的濃磷酸100ml，用水稀釋至1000ml,混勻備用。操作步驟1  標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：試劑(ml)管號012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0

3、A595nm      按上表分別向各支試管內(nèi)加入各種試劑，充分混勻，5min后在595nm波長處以0號管調(diào)零,測定各管吸光度值（A）。以吸光度值為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2樣品測定：取1ml樣品溶液（約含25250微克蛋白質(zhì)），加入染料溶液5ml混勻，5min后測定其595nm吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)濃度。 二、雙縮脲(Biuret)法測定蛋白質(zhì)含量 實驗原理在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個或二

4、個以上酰胺基(CO-NH2)，或與此相似的基團如CH2-NH2，CS-NH2，C(NH)NH2的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(CO-NH)，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且呈色強度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。測定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。試劑1雙縮脲試劑： 取CuSO4·5

5、H20(c.P.)1.5g和酒石酸鉀鈉(c.P.)6.0g以少量蒸餾水溶解，再加2.5molL NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液： 用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10g/L的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1g/L的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L

6、0;NaOH配制。器材 1試管：15×150mm 試管7只 ；     21ml，5ml移液管；3坐標(biāo)紙 ；                           4721分光光度計。操作步驟     

7、取試管7支，編號，按下表操作：試劑(ml)管號空白管12345測定管蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（10g/L）-0.10.20.30.40.5-生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測樣品-0.1雙縮脲試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)（g/L）01020304050 混勻，37水浴20分鐘，冷卻至室溫，在分光光度計波長540nm處，用空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值。15為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測定管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)濃度。注意事項1雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止Cu

8、SO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比不低于31，加入KI作為抗氧化試劑。2雙縮脲試劑要封閉貯存，防止吸收空氣中的二氧化碳。3本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點是靈敏度較低。4黃疸血清、嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾。思考題   1雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的原理是什么?其它還有什么方法測定蛋白質(zhì)的含量?2請用雙縮脲法，設(shè)計一個測定蛋白質(zhì)含量的定量方法(除標(biāo)準(zhǔn)曲線法外)。 三、酚試劑法測定血清蛋白質(zhì)含量（改良Lowry法）實驗原理蛋白質(zhì)分子中所含肽鍵在堿性條件下與銅絡(luò)合

9、生成復(fù)合物產(chǎn)生紫紅色化合物（雙縮脲反應(yīng)），同時使肽鏈展開，蛋白質(zhì)中半胱氨酸、絡(luò)氨酸、色氨酸和組氨酸均能使鎢酸、鉬酸同時失去1個，2個或者3個氧原子，還原成多種還原型的混合酸，并且有特殊的藍顏色（最大吸收峰波長為745750nm,反應(yīng)式一）其藍色深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)成正比，由此可測出樣品中蛋白質(zhì)的含量。同時蛋白質(zhì)肽鍵發(fā)生烯醇化反應(yīng)（反應(yīng)式二）能使鉬離子在pH10時螯合在肽結(jié)構(gòu)中，形成復(fù)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混合酸的顯色劑上，大大增加了酚試劑對蛋白質(zhì)的敏感性。 反應(yīng)式一         &#

10、160;3H2OP2O513WO35MoO310H2O                   3H2OP2O514WO34MoO310H2O                      

11、0;         反應(yīng)式二          3H2OP2O513WO25MoO310H2O                   3H2OP2O514WO24MoO210H2O 烯醇化反應(yīng) 烯醇化

12、反應(yīng)后，可與Cu2+絡(luò)合，絡(luò)合后，易于使肽釋放電子，使酚試劑還原。試劑器材1堿性銅試劑：甲液：稱取無水碳酸鈉2.0g，溶于0.1mol/L NaOH溶液100ml中。乙液：取硫酸銅（CuSO4 5H2O ）0.5g，溶于1%酒石酸鉀溶液100ml中。臨用前取甲液50ml，乙液1ml混合，即為堿性銅試劑。此液需現(xiàn)用現(xiàn)配。2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（250 mg/ml）：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白25mg，溶于0.9%NaCl溶液中，以容量瓶定容至100ml。3樣品：取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度處，混勻，為待測血清樣品。4.酚

13、試劑：取鎢酸鈉（Na2WO42H2O）100g和鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）25g,溶于700ml蒸餾水中，再加入85%磷酸50ml和濃硫酸100ml充分混勻，置于1500ml圓底燒瓶中溫和地回流10小時，冷卻，取下冷凝裝置，再加入硫酸鋰（Li2SO42H2O）150g,水50ml,溴34滴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，驅(qū)除過量的溴，冷卻后稀釋至1000ml，過濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色（如帶綠色不能使用，應(yīng)繼續(xù)加溴煮沸），置于棕色瓶中保存。使用前，以酚酞為指示劑，用0.1mol/LNaOH溶液滴定，求出酚試劑的摩爾濃度。然后根據(jù)此濃度，將酚試劑用蒸餾水稀釋至最后酸度為1mol/L。（滴定時可將酚

14、試劑稀釋，以免顏色影響）。試劑放置過久，變成綠色時，可再加溴數(shù)滴煮15分鐘，如能恢復(fù)原有的金黃色仍可使用。5721分光光度計；旋渦混合器；秒表；試管。操作步驟取試管7支，編號，按下表操作：試劑（ml）管號O12345測定管標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（250g/ml）0.20.40.60.81.0稀釋血清1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.2堿性銅試劑5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置20min酚試劑0.50.50.50.50.50.50.5 混勻，室溫放置30min后，以0管調(diào)零點，在波長650nm比色，分別讀取各管吸光度值。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐

15、標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以測定管吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清蛋白質(zhì)含量。臨床意義1.血清總蛋白濃度增高：（1）血清中水分減少，而使蛋白濃度相對增高。如急性失水時（嘔吐、腹瀉、高熱）；休克時，由于毛細管通透性的變化，血漿也發(fā)生濃縮等。（2）蛋白合成增加，大多數(shù)發(fā)生多發(fā)性骨髓瘤患者中，主要是血清球蛋白增加。2血清蛋白合成降低：（1）合成障礙，主要為肝功能障礙，肝臟是合成蛋白質(zhì)的場所，肝功嚴(yán)重?fù)p害時，蛋白質(zhì)的合成減少，以白蛋白最為顯著。（2）蛋白質(zhì)丟失，如嚴(yán)重灼傷時，大量血漿滲出；腎病綜合癥時，尿液中長期丟失蛋白質(zhì)等。（3）營養(yǎng)不良或長期消耗性疾病，如嚴(yán)重結(jié)核或長期消耗性疾病。（4）血液中水分增加，血漿被

16、稀釋，因各種原因引起的水鈉潴留或輸注過多低滲溶液。注意事項1.酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)相互作用，所以當(dāng)加入酚試劑后，應(yīng)迅速搖勻（加一管搖一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。2.堿性銅試劑必須臨用前配制。3.磷鉬酸、磷鎢酸的顯色反應(yīng)是由于和還原物質(zhì)的還原反應(yīng)而引起的，因此本法可受很多還原性物質(zhì)的干擾，如帶有-SH的化合物，糖類、酚類等甚至有些緩沖劑（如Tris）也能干擾測定。但如控制在低濃度范圍內(nèi)，則不影響測定，Lowry法很靈敏，可以對5100g蛋白質(zhì)樣品進行很好的顯色反應(yīng)，而如此低的蛋白質(zhì)濃度常常已把干擾物質(zhì)的濃度稀釋到一個不起作用的水平

17、。4.所有器材必須清洗干凈，否則影響實驗結(jié)果。5.血清稀釋的倍數(shù)應(yīng)使蛋白質(zhì)含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，若超過此范圍需要將血清酌情稀釋。6.本法操作簡便、靈敏度高，缺點是試劑只與蛋白質(zhì)中半胱氨酸、色氨酸等起反應(yīng)，因此可因各種蛋白質(zhì)中含這幾種氨基酸的量不同使顯色強度稍有不同。思考題1.用酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量有哪些優(yōu)點？2.用酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量有哪些干擾作用？應(yīng)如何注意？ 四、紫外吸收法實驗原理    蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量

18、成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。     此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適

19、于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。試劑器材1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）： 準(zhǔn)確稱量經(jīng)微量凱氏定氮法校正的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制。2紫外分光光度計。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8支試管，按下表編號并加入試劑：試劑（ml）管號012345

20、67蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）蒸餾水04.00.53.51.03.01.52.52.02.02.51.53.01.04.00  混勻。在280nm處測定各管溶液的吸光度值。以0號管調(diào)零，以蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.蛋白質(zhì)樣品溶液，在280nm處測得吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。注意事項1.蛋白質(zhì)的最高吸收峰可因pH的改變而發(fā)生變化，因此要注意保持待測蛋白質(zhì)溶液的pH值與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液一致。2. 測定液必須澄清，以免造成結(jié)果誤差。3本法需用石英比色杯。思考題1為什么紫外吸收法可作為蛋白質(zhì)定量測定方法？其理論依據(jù)是什么？

21、2此法測定蛋白質(zhì)具有什么特點？實驗二十一 紫外光吸收法測定蛋白質(zhì)濃度目的和要求了解紫外吸收法測定蛋白質(zhì)濃度的原理。熟悉紫外分光光度計的使用。原理蛋白質(zhì)組成中長含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波長處有最大吸收峰，一定濃度范圍內(nèi)其濃度與吸光度成正比，故可用紫外分光光度計通過比色來測定蛋白質(zhì)的含量。由于核酸在280nm波長處也有光吸收，對蛋白質(zhì)測定有一定的干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm處。如同時測定260nm的光吸收，通過計算可以消除其對蛋白質(zhì)測定的影響。因此如溶中存在核酸時必須同時測定280nm及260nm的吸光度，方可通過計算測得溶液中的蛋白質(zhì)濃度。操作步驟一.直接測定法在紫外分光光度計上，將未知的蛋白質(zhì)溶液小心盛于石英比色皿中，以生理鹽水為對照，測得280nm和260nm兩種波長的吸光度（A280nm及A260nm）。將A280nm及A260nm波長處測得的吸光度按下列公式計算蛋白質(zhì)濃度。C = 1.45A280nm 0.74A260nm式中C：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/ml）；A280nm：蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度；A260nm：蛋白質(zhì)溶液在260nm處測得的吸光本法對微量蛋白質(zhì)的測定既快又方便，它還適用于硫酸銨或其他鹽類混雜的情況，這時用其他方法測定往往較困難。為方便起見對于混合