基因工程的基本操作程序

1、1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基本步驟基本步驟 一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取 二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取( (一一) )、目的基因、目的基因 目的基因主要指能編碼蛋白質(zhì)的基因，例如，與生物抗逆目的基因主要指能編碼蛋白質(zhì)的基因，例如，與生物抗逆性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因等，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。的基因等，也可

2、以是一些具有調(diào)控作用的因子。 基因結(jié)構(gòu)：原核生物基因與真核生物基因在結(jié)構(gòu)上都有編基因結(jié)構(gòu)：原核生物基因與真核生物基因在結(jié)構(gòu)上都有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。碼區(qū)和非編碼區(qū)。 編碼區(qū)：是編碼具有一定氨基酸序列的蛋白質(zhì)的序列。編碼區(qū)：是編碼具有一定氨基酸序列的蛋白質(zhì)的序列。 非編碼區(qū)：分布于編碼區(qū)兩側(cè)，對(duì)于編碼區(qū)編碼蛋白質(zhì)具非編碼區(qū)：分布于編碼區(qū)兩側(cè)，對(duì)于編碼區(qū)編碼蛋白質(zhì)具有有 調(diào)控作用。調(diào)控作用。原核生物基因原核生物基因-編碼區(qū)連續(xù)編碼區(qū)連續(xù) 真核生物基因真核生物基因-編碼區(qū)不連續(xù)編碼區(qū)不連續(xù)外顯子與內(nèi)含子的認(rèn)識(shí)：外顯子與內(nèi)含子的認(rèn)識(shí)：( (二二) )、獲取目的基因的方法、獲取目的基因的方法1.1.從基因

3、文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因 (1)(1)基因文庫：基因文庫：將某種生物全部將某種生物全部DNADNA提取出來，選用適當(dāng)?shù)南拗泼?，將提取出來，選用適當(dāng)?shù)南拗泼?，將DNADNA切成一定范圍大小的切成一定范圍大小的DNADNA片段，分別與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各片段，分別與載體連接，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。 (2)種類：種類：基因組文庫：這個(gè)受體菌的群體包含了這種生物的所有基因，稱基因組文庫：這個(gè)受體菌的群體包含了這種生物的所有基因，稱 為基因組文庫。為基因組文庫。 部分基

4、因文庫：部分受體菌所含有的基因只是該種生物的部分基部分基因文庫：部分受體菌所含有的基因只是該種生物的部分基 因，稱為基因組文庫。如因，稱為基因組文庫。如cDNA文庫。文庫。兩種文庫的比較兩種文庫的比較基因文庫類型基因文庫類型 部分部分(cDNA)文庫文庫基因組文庫基因組文庫構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫的過程的過程某種生物某個(gè)時(shí)期的某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 與載體連接導(dǎo)入與載體連接導(dǎo)入 受體菌群體受體菌群體某生物內(nèi)部全部某生物內(nèi)部全部DNA 限制酶限制酶許多許多DNA片段片段與載體連接導(dǎo)入與載體連接導(dǎo)入受體菌群體受體菌群體文庫大小文庫大小小小大大基因中啟動(dòng)子基因中啟動(dòng)子無無

5、有有基因中內(nèi)含子基因中內(nèi)含子無無有有基因多少基因多少某種生物的部分基因某種生物的部分基因某種生物的全部基因某種生物的全部基因物種間的基因交流物種間的基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以(3)(3)從基因文庫中獲取目的基因的主要依據(jù)從基因文庫中獲取目的基因的主要依據(jù) 可根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體可根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA、基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性、基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。來獲取目的基因。獲取目的基因的途徑獲取目的基因的途徑從供體細(xì)胞的從供體細(xì)胞的DNA中直接分離。方法

6、：鳥槍法。中直接分離。方法：鳥槍法。 鳥槍法：供體的鳥槍法：供體的DNA切成許多切成許多DNA片段，連入載片段，連入載 體導(dǎo)入受體細(xì)胞，根據(jù)性狀篩選目的基體導(dǎo)入受體細(xì)胞，根據(jù)性狀篩選目的基因因人工合成人工合成(真核細(xì)胞真核細(xì)胞)反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：mRNA單鏈單鏈DNA雙鏈雙鏈DNA根據(jù)已知氨基酸序列合成根據(jù)已知氨基酸序列合成DNA 方法：氨基酸序列推測(cè)方法：氨基酸序列推測(cè)mRNA序列，序列，mRNA序序 列推測(cè)基因序列，化學(xué)合成目的基因。列推測(cè)基因序列，化學(xué)合成目的基因。2.2.利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因 (1)PCR(1)PCR：PCRPCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫

7、，它是一項(xiàng)在生物體外是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定復(fù)制特定DNADNA片段的核酸合成技術(shù)。通過這一技術(shù)，可以獲得大量片段的核酸合成技術(shù)。通過這一技術(shù)，可以獲得大量的目的基因。的目的基因。 (2)(2)原理：利用原理：利用DNADNA雙鏈復(fù)制的原理。雙鏈復(fù)制的原理。 (3)(3)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列( (以便根據(jù)這一以便根據(jù)這一段序列合成引物段序列合成引物) )。 (4) (4)需要條件：模板需要條件：模板DNADNA、引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定、引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶)

8、)、PCRPCR擴(kuò)增儀。擴(kuò)增儀。 (5) (5)特點(diǎn)：呈指數(shù)式擴(kuò)增特點(diǎn)：呈指數(shù)式擴(kuò)增(6)(6)過程：過程： 引物結(jié)合到互補(bǔ)引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈鏈Taq酶從引物起始酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成53355533延伸方向：從延伸方向：從5端向端向3端延伸端延伸 (7)(7)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNADNA復(fù)制與復(fù)制與PCRPCR技術(shù)的比較技術(shù)的比較細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制復(fù)制PCR技術(shù)技術(shù)不不同同點(diǎn)點(diǎn)場(chǎng)所場(chǎng)所主要在細(xì)胞核內(nèi)主要在細(xì)胞核內(nèi)生物體外生物體外解旋解旋在解旋酶作用下，邊解旋邊復(fù)制在解旋酶作用下，邊解旋邊復(fù)制 不需解旋酶。高溫不需解旋酶。高溫(9095)解旋，解旋，雙鏈完全分開雙鏈完

9、全分開酶酶DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶Taq酶酶引物引物不需要不需要需要需要溫度溫度體內(nèi)溫和條件體內(nèi)溫和條件高溫高溫相相同同點(diǎn)點(diǎn)需提供需提供DNA復(fù)制的模板；復(fù)制的模板；四種脫氧核苷酸為原料；四種脫氧核苷酸為原料；子鏈延伸的方向都是從子鏈延伸的方向都是從5端到端到3端端3.3.人工合成人工合成 如果基因較小，核苷酸序列又已知，也可以通過如果基因較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNADNA合成儀合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。用化學(xué)方法直接人工合成。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的第二步，也是基因工程的核基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的第二步

10、，也是基因工程的核心。心。 1.目的：是目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下目的：是目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 2.組成：組成： 目的基因目的基因+啟動(dòng)子啟動(dòng)子+終止子終止子 +標(biāo)記基因。標(biāo)記基因。表達(dá)載體表達(dá)載體啟動(dòng)子啟動(dòng)子插入基因插入基因終止子終止子復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)抗生素抗性基因抗生素抗性基因 2.組成組成(1)啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)

11、動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。終獲得所需要的蛋白質(zhì)。(2)終止子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的終止子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，能片段，位于基因的尾端，能使轉(zhuǎn)錄在所需位置停下來。使轉(zhuǎn)錄在所需位置停下來。(3)標(biāo)記基因的作用：為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從標(biāo)記基因的作用：為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因?；颉?3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程 以質(zhì)粒作為運(yùn)載體：以質(zhì)粒作為運(yùn)載體： 兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因 載

12、體載體(質(zhì)粒質(zhì)粒)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA分子分子限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端重組重組DNA分子分子(重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒)DNA連接酶連接酶 結(jié)果：結(jié)果：目的基因兩端結(jié)合呈環(huán)狀目的基因兩端結(jié)合呈環(huán)狀DNA 載體的兩端重新結(jié)合成環(huán)狀載體的兩端重新結(jié)合成環(huán)狀DNA 目的基因與載體的黏性末端結(jié)合形成基因表達(dá)載體目的基因與載體的黏性末端結(jié)合形成基因表達(dá)載體4.基因表達(dá)載體的功能基因表達(dá)載體的功能 (1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。 (2)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作

13、用。使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 1.轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定的表達(dá)的過程，目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定的表達(dá)的過程，成為轉(zhuǎn)化。成為轉(zhuǎn)化。 2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 (1)方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；基因槍法；花粉管通道法。方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；基因槍法；花粉管通道法。 (2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)： (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程： 目的基因目的基因插入插入Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA上上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受整合到受體細(xì)

14、胞染色體的體細(xì)胞染色體的DNA上上維持穩(wěn)定和表達(dá)維持穩(wěn)定和表達(dá) 3.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 (1)常用方法：顯微注射技術(shù)。常用方法：顯微注射技術(shù)。 (2)操作程序：將含有目的基因的表達(dá)載體提純操作程序：將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷讶÷?受精受精卵卵)顯微注射顯微注射移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)發(fā)育移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)發(fā)育獲獲得具有新性狀的動(dòng)物得具有新性狀的動(dòng)物 4.將目的基因?qū)胛⑸飳⒛康幕驅(qū)胛⑸?(1)原核生物的特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少等。原核生物的特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少等。 (2)轉(zhuǎn)化過程：轉(zhuǎn)化過程：Ca2+處理細(xì)胞處

15、理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合分子與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子分子 (3)實(shí)例：早期的基因工程操作都用原核生物作為受體細(xì)胞，其實(shí)例：早期的基因工程操作都用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最為常見。中以大腸桿菌最為常見。 5.目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的比較目的基因?qū)氩煌荏w細(xì)胞的比較生物種類生物種類植物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物微生物轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞受體細(xì)胞卵細(xì)胞、受精卵、卵細(xì)胞、受精卵、體細(xì)

16、胞體細(xì)胞受精卵、卵細(xì)胞受精卵、卵細(xì)胞常用大腸桿菌常用大腸桿菌目的目的形成具有新性狀形成具有新性狀的植株的植株形成具有新性狀形成具有新性狀的動(dòng)物的動(dòng)物生產(chǎn)人們所需要生產(chǎn)人們所需要的基因產(chǎn)品的基因產(chǎn)品四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測(cè)和鑒定才能知道。這是基因工程的第四步特性，只有通過檢測(cè)和鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作。工作。 1.操作目的操作目的 檢測(cè)和鑒定目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和檢測(cè)和鑒定目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表

17、達(dá)起遺傳特性。表達(dá)起遺傳特性。 2.檢測(cè)和鑒定水平檢測(cè)和鑒定水平目的基因是目的基因是否插入否插入mRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)個(gè)體個(gè)體DNA分子分子雜交雜交是否出現(xiàn)是否出現(xiàn)雜交帶雜交帶分子雜交分子雜交是否出現(xiàn)是否出現(xiàn)雜交帶雜交帶抗原抗原-抗體抗體雜交雜交是否出現(xiàn)是否出現(xiàn)雜交帶雜交帶抗蟲、抗病抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)是否抗蟲；是否抗蟲；是否抗病是否抗病個(gè)體水平檢測(cè)個(gè)體水平檢測(cè)分子水平檢測(cè)分子水平檢測(cè)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯檢測(cè)檢測(cè)檢測(cè)檢測(cè)檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定現(xiàn)象現(xiàn)象現(xiàn)象現(xiàn)象現(xiàn)象現(xiàn)象現(xiàn)象現(xiàn)象DNA探針及其應(yīng)用探針及其應(yīng)用 1.DNA探針的應(yīng)用所依據(jù)的原理是探針的應(yīng)用所依據(jù)的原理是DNA雜交雜交。 DNA雜交是指雜交是指DNA片段在適合的條件下能和與之互補(bǔ)的另一個(gè)片段結(jié)合