瘧原蟲鏡檢技術(shù)

1、瘧原蟲鏡檢技術(shù)l瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲的基本形態(tài)特征l瘧原蟲計數(shù)瘧原蟲計數(shù)l顯微鏡的維護與保養(yǎng)顯微鏡的維護與保養(yǎng) 瘧疾是由蚊子傳播的寄生蟲病，它的病原體是瘧瘧疾是由蚊子傳播的寄生蟲病，它的病原體是瘧原蟲。原蟲。 寄生于人體的瘧原蟲有寄生于人體的瘧原蟲有4 4 種種瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)n瘧原蟲基本構(gòu)造為核、細胞質(zhì)（胞漿）和瘧色素。瘧原蟲基本構(gòu)造為核、細胞質(zhì)（胞漿）和瘧色素。n原蟲經(jīng)姬氏原蟲經(jīng)姬氏GiemsaGiemsa或瑞氏或瑞氏WrightWright染色：染色： 核呈紅色核呈紅色, ,胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色胞漿胞漿瘧色素瘧色素核核瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)瘧原蟲基本

2、結(jié)構(gòu)2.2.細胞漿細胞漿 藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，細胞漿逐漸增多。細胞漿逐漸增多。瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)胞漿胞漿瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)n不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團塊。色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團塊。n間日瘧原蟲呈短棒狀，黃褐色；間日瘧原蟲呈短棒狀，黃褐色；n惡性瘧原蟲呈細砂狀，黑褐色；惡性瘧原蟲呈細砂狀，黑褐色；n三日瘧原蟲呈砂粒狀，深褐色；三日瘧原蟲呈砂粒狀，深褐色；n卵形瘧原蟲與間日瘧原蟲相似。卵形瘧原蟲與間日瘧原蟲相似。3.3.瘧色素瘧色素

3、滋養(yǎng)體期：滋養(yǎng)體期：早期、晚期滋養(yǎng)體早期、晚期滋養(yǎng)體裂殖體期：裂殖體期：未成熟、成熟裂殖體未成熟、成熟裂殖體配子體期：配子體期：雌、雄配子體雌、雄配子體瘧原蟲在瘧原蟲在RBCRBC內(nèi)各期形態(tài)各不相同內(nèi)各期形態(tài)各不相同瘧原蟲在紅細胞內(nèi)按照生長發(fā)育繁殖的階段不同瘧原蟲在紅細胞內(nèi)按照生長發(fā)育繁殖的階段不同瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)瘧原蟲基本結(jié)構(gòu)紅細胞不漲大紅細胞不漲大1 1個個RBCRBC內(nèi)內(nèi)2 2個以上原蟲常見個以上原蟲常見，環(huán)狀體內(nèi)可有，環(huán)狀體內(nèi)可有2 2個核個核 環(huán)狀體可貼在紅細胞邊緣環(huán)狀體可貼在紅細胞邊緣 血片中除血片中除R R、G G外沒有其外沒有其他發(fā)育期他發(fā)育期配子體呈新月形或臘腸形配子體呈新月形

4、或臘腸形成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含16-3216-32個個裂殖子，排列不規(guī)則裂殖子，排列不規(guī)則可出現(xiàn)茂氏點可出現(xiàn)茂氏點惡性瘧（惡性瘧（P.falciparumP.falciparum） 鑒定要點鑒定要點紅細胞通常漲大紅細胞通常漲大 薛氏點明顯薛氏點明顯 環(huán)狀體較粗大環(huán)狀體較粗大滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足偽足血片中可見各期的原蟲形血片中可見各期的原蟲形態(tài)態(tài)成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含12-2412-24個裂個裂殖子，排列不規(guī)則殖子，排列不規(guī)則 間日瘧（間日瘧（P. vivax P. vivax ） 鑒定要點鑒定要點紅細胞不漲大或略小紅細胞不漲大或略小環(huán)狀體環(huán)狀體中等大小，核較

5、中等大小，核較大，胞漿粗厚大，胞漿粗厚胞漿不活躍呈帶狀形胞漿不活躍呈帶狀形 成熟裂殖體呈菊花狀成熟裂殖體呈菊花狀, ,內(nèi)內(nèi)含含6-126-12個裂殖子個裂殖子 5. 雌雄配子體小于雌雄配子體小于 正正 常常 紅細胞，瘧色紅細胞，瘧色 素呈深褐色素呈深褐色 6. ?？刹橐姼麟A段常可查見各階段 的瘧原蟲的瘧原蟲三日瘧（三日瘧（P.malariaeP.malariae） 診斷要點診斷要點卵形瘧（卵形瘧（P. ovaleP. ovale） 診斷要點診斷要點紅細胞略漲大或正常，紅細胞略漲大或正常，卵圓形或邊緣呈鋸齒狀卵圓形或邊緣呈鋸齒狀環(huán)狀體中等大小，核環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚較大，胞漿粗厚薛氏

6、點出現(xiàn)較早粗大薛氏點出現(xiàn)較早粗大，量多，量多成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含6-126-12個裂殖子個裂殖子 5. 5. ?？刹橐姼麟A段的常可查見各階段的 瘧原蟲瘧原蟲 厚血膜由于用血量多，血膜小，細胞重迭，厚血膜由于用血量多，血膜小，細胞重迭，干燥緩慢，各期瘧原蟲的體積都略為縮小，其干燥緩慢，各期瘧原蟲的體積都略為縮小，其中大、小滋養(yǎng)體的形態(tài)有較大改變，裂殖體和中大、小滋養(yǎng)體的形態(tài)有較大改變，裂殖體和配子體的形態(tài)則變化不大。配子體的形態(tài)則變化不大。厚血膜中瘧原蟲的形態(tài)：厚血膜中瘧原蟲的形態(tài)：厚血膜惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲厚血膜RingsGametocytes間日瘧原蟲間日瘧原蟲 厚血膜厚血膜環(huán)狀體環(huán)

7、狀體配子體配子體滋養(yǎng)體滋養(yǎng)體裂殖體裂殖體 由于在血膜制備過程中紅細胞溶解，因而其原形態(tài)消由于在血膜制備過程中紅細胞溶解，因而其原形態(tài)消失，且染液和玻片上可能存在雜質(zhì)等，失，且染液和玻片上可能存在雜質(zhì)等，要根據(jù)瘧原要根據(jù)瘧原蟲的三個基本要素仔細加以鑒別。蟲的三個基本要素仔細加以鑒別。n（1)1)疑似瘧色素疑似瘧色素n（2 2）疑似瘧原蟲核）疑似瘧原蟲核n（3）疑似瘧原蟲胞漿）疑似瘧原蟲胞漿瘧原蟲與其他異物的鑒別瘧原蟲與其他異物的鑒別（4）血液成份與分析）血液成份與分析（5）雜質(zhì)）雜質(zhì)-類似瘧原蟲的物質(zhì)類似瘧原蟲的物質(zhì)（6） 形態(tài)失常形態(tài)失常 瘧原蟲成份丟失。瘧原蟲成份丟失。 成份增加。成份增加。

8、 形態(tài)改變。形態(tài)改變。 藥物影響。藥物影響。 血片的制作與染色血片的制作與染色 n載玻片的清洗：載玻片的清洗：n新玻片的清洗方法新玻片的清洗方法 用加有洗潔精或洗衣用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，浸于粉的熱水洗滌，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小時以小時以上上n已用過的玻片：用加有洗衣粉的熱水洗滌，已用過的玻片：用加有洗衣粉的熱水洗滌，浸于浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小時以上小時以上 載玻片載玻片 每張載玻片上分別做每張載玻片上分別做1 1個薄血膜，個薄血膜，1 1個厚血膜。個厚血膜。標準血膜的位置如下圖所示。標準血膜的位置如下圖所示。血片制作血片制作 取血液取血液4

9、-5l4-5l 血滴置于載片的中央偏右血滴置于載片的中央偏右1/31/3， 由里向外劃圈涂成直徑為由里向外劃圈涂成直徑為0.8-10.8-1厘米厘米 厚薄均勻、圓形厚血膜厚薄均勻、圓形厚血膜. .血片制作血片制作厚血膜的涂制：厚血膜的涂制：標準的推片姿勢標準的推片姿勢薄血膜的涂制：薄血膜的涂制：取血液取血液1-1.5l1-1.5l血滴置于載玻片的中央，血滴置于載玻片的中央，將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻片與推片將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻片與推片之間向兩側(cè)擴展至約之間向兩側(cè)擴展至約2cm2cm寬時，兩玻片保持寬時，兩玻片保持20-3020-30角，角，推成舌狀薄血膜，長約推成

10、舌狀薄血膜，長約2-2.5CM2-2.5CM。血片制作血片制作血片染色血片染色兩種染色方法兩種染色方法: :n吉氏染色法吉氏染色法n瑞氏染色法瑞氏染色法n常用吉氏染色法常用吉氏染色法血片的染色血片的染色n待血片完全干燥后才可染色待血片完全干燥后才可染色n1 1血膜的固定血膜的固定-甲醇甲醇 吉氏染液：染色方法吉氏染液：染色方法薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用的磷酸緩沖液或薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用的磷酸緩沖液或蒸餾水將吉氏原液稀釋，原液與緩沖液為蒸餾水將吉氏原液稀釋，原液與緩沖液為1:201:20?；靹颉；靹蛉旧旧?0-3020-30分鐘，晾干鏡檢。分鐘，晾干鏡檢。厚血膜溶血染色厚血膜溶血染色 放

11、置多時未染色的血片（放置多時未染色的血片（2 2天以上，薄片天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，須在厚血膜已用甲醇固定），在染色之前，須在厚血膜上用清水進行溶血，待血膜全部溶解后倒掉上用清水進行溶血，待血膜全部溶解后倒掉，用吉氏染液染色，用吉氏染液染色, ,清水漂洗干凈清水漂洗干凈, ,晾干。晾干。n 染色用水和沖洗用水染色用水和沖洗用水npH7.0pH7.0pH7.2pH7.2緩沖蒸餾水效果最佳。緩沖蒸餾水效果最佳。n先制備好兩種貯備液先制備好兩種貯備液n貯備液貯備液I 1/15MI 1/15M磷酸氫二鈉（磷酸氫二鈉（NaNa2 2HPOHPO4 4）溶液）溶液 n NaNa2 2HPO

12、HPO4 4 9.5 g9.5 gn 蒸餾水蒸餾水 1000 ml1000 mln貯備液貯備液 1/15M 1/15M磷酸二氫鉀磷酸二氫鉀 （KHKH2 2POPO4 4 ）溶液）溶液 n KHKH2 2POPO4 4 9.07 g 9.07 gn 蒸餾水蒸餾水 1000 ml1000 mln緩沖蒸餾水配制緩沖蒸餾水配制nPH M/15 NaPH M/15 Na2 2HPOHPO4 4 M/15 KH M/15 KH2 2POPO4 4 DW DW n (ml) ( ml) (ml)n7.0 63 37 900n7.1 68 32 900n7.2 73 27 900n緩沖蒸餾水宜用時新鮮配制為

13、好。緩沖蒸餾水宜用時新鮮配制為好。血片制作注意事項血片制作注意事項（1 1）在制作血片前，首先要核對患者的）在制作血片前，首先要核對患者的 姓名、年齡和住址姓名、年齡和住址（2 2）載玻片必須清潔無油污，理想的?。┹d玻片必須清潔無油污，理想的薄 血膜是一層血細胞均勻分布不重血膜是一層血細胞均勻分布不重 疊和空泡，血膜末端呈舌狀。疊和空泡，血膜末端呈舌狀。（3 3）厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見）厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見5-105-10個個白細胞為宜。白細胞為宜。（4 4）制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其）制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，自然干

14、燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果影響鏡檢結(jié)果血片制作注意事項血片制作注意事項（1 1）染料溶劑的質(zhì)量）染料溶劑的質(zhì)量 （2）染液的新舊）染液的新舊（3）染液稀釋后使用時間）染液稀釋后使用時間原液必須臨用時稀釋，隨配隨用。原液必須臨用時稀釋，隨配隨用。（4）染液的稀釋濃度）染液的稀釋濃度（5）染色時間）染色時間 (6) 染色稀釋用水染色稀釋用水 染色質(zhì)量影響因素染色質(zhì)量影響因素n（7 7）血膜在制備后應盡量能在當天染）血膜在制備后應盡量能在當天染色，一般夏天不超過色，一般夏天不超過4848小時，冬天也小時，冬天也不能超過不能超過7272小時。小時。n新制血片染色時厚血膜無需溶血新制血

15、片染色時厚血膜無需溶血n放置多時的血片，在染色之前先用清放置多時的血片，在染色之前先用清水滴加在厚血膜上進行溶血水滴加在厚血膜上進行溶血. .瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算 計算瘧原蟲密度的三種方法：計算瘧原蟲密度的三種方法： 白細胞原蟲密度計數(shù)法白細胞原蟲密度計數(shù)法 ( (厚血膜厚血膜 WHO)WHO) 半定量計數(shù)法半定量計數(shù)法 ( (厚血膜厚血膜) ) 紅細胞感染密度計算法紅細胞感染密度計算法( (薄血膜薄血膜) )白細胞原蟲密度計數(shù)法白細胞原蟲密度計數(shù)法n鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200200個白細胞中的瘧原個白細胞中的瘧原蟲數(shù)，如

16、果原蟲密度較低，可增加白細胞，計數(shù)蟲數(shù)，如果原蟲密度較低，可增加白細胞，計數(shù)500-1000 500-1000 個。個。n密度單位密度單位: :原蟲數(shù)原蟲數(shù)/l/ln計算公式：瘧原蟲數(shù)計算公式：瘧原蟲數(shù) 計數(shù)的白細胞數(shù)計數(shù)的白細胞數(shù) 患者每微患者每微升血白細胞數(shù)升血白細胞數(shù) = = 瘧原蟲數(shù)瘧原蟲數(shù)/l/l血。血。n如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以80008000個白細胞個白細胞計數(shù)計數(shù)( (國際標準國際標準) ) 。瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算厚血膜的瘧原蟲計數(shù)厚血膜的瘧原蟲計數(shù)n從血膜的左上角開始，橫向。從血膜的左上角開始，橫向。n計數(shù)計數(shù)1 1個視

17、野后，每次間隔個視野后，每次間隔5 5個視野個視野, ,再計數(shù)再計數(shù)。厚血膜厚血膜瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算顯微鏡的使用與維護顯微鏡的使用與維護1.1.學習鏡檢瘧原蟲之前，必須熟悉顯微鏡的基本學習鏡檢瘧原蟲之前，必須熟悉顯微鏡的基本構(gòu)造，使用方法和維修與保養(yǎng)。防止油鏡進灰、構(gòu)造，使用方法和維修與保養(yǎng)。防止油鏡進灰、進油和發(fā)霉。進油和發(fā)霉。2.2.瘧原蟲的厚薄血片都必須在油鏡下觀察瘧原蟲的厚薄血片都必須在油鏡下觀察，顯微顯微鏡用光要充足。包括反光鏡、光圈、聚光器要達到鏡用光要充足。包括反光鏡、光圈、聚光器要達到油鏡使用的最佳限度。油鏡使用的最佳限度。顯微鏡檢查注意事項顯微鏡檢查注意事項n3.

18、玻片未加油時觀察標本應按：低玻片未加油時觀察標本應按：低倍倍高倍高倍油鏡程序。如在加油區(qū)油鏡程序。如在加油區(qū)內(nèi)重找目標應按照：低倍內(nèi)重找目標應按照：低倍油鏡程油鏡程序，不要經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡序，不要經(jīng)高倍鏡，以免油沾污鏡頭。頭。n注意保護鏡頭，切不可壓碎標本被注意保護鏡頭，切不可壓碎標本被片，損壞鏡頭。片，損壞鏡頭。 顯微鏡檢查注意事項顯微鏡檢查注意事項4.4.視野模糊不清視野模糊不清 顯微鏡問題：顯微鏡問題： 鏡頭鏡油用量、沾污灰塵或含有氣泡；鏡頭鏡油用量、沾污灰塵或含有氣泡； 油鏡頭破損、進油或有霉斑、灰塵；油鏡頭破損、進油或有霉斑、灰塵； 顯微鏡用光調(diào)整不足。顯微鏡用光調(diào)整不足。 血片問題：血片問題： 載玻片不潔、毛玻璃樣