HPLC色譜方法開發(fā)中保留因子k的深度剖析

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上HPLC色譜方法開發(fā)中保留因子k的深度剖析Voyager88昨天作者：Luffy前言：保留因子作為化合物在液相上保留最重要的參數(shù)，同時它在分離度公式中占據(jù)重要的一席，因此理解好保留因子對于液相色譜方法開發(fā)具有重要意義，下面小編和大家一起剖析下保留因子k。1. 1.k的定義保留因子（k）：固定相中的溶質(zhì)分子總量（s）除以流動相（m）中的溶質(zhì)分子總量得到。當化合物在固定相中溶質(zhì)分子越多，K值越大，保留時間越長。2. k的計算（1）等度洗脫中，運用公式k=（tR-t0）/t0進行計算，其中t0約等于5x10-4Ldc2/F。式中L是色譜柱的長度，以mm為單位；dc是色譜柱的

2、內(nèi)徑，也以mm為單位；F是流動相流速，以ml/min為單位；t0以分鐘為單位；其中5x10-4Ldc2為色譜柱的死體積Vm。舉例來說，對于4.6mm內(nèi)徑的色譜柱，其死體積Vm近似為0.01L，因此對于一根150x4.6mm的色譜柱，如果使用流速為0.5ml/min，那么t0=Vm/F=1.5/0.5=3分鐘；然后根據(jù)待測樣品的保留時間tR就可以計算出該色譜峰的k值了。（2）在梯度洗脫中，條件比較復雜，k值計算公式為0.87tGf/vms。其中tG為梯度時間，F(xiàn)為流速，Vm為色譜柱的死體積，為梯度范圍，一般分子量為100-500Da的化合物S大約為4，根據(jù)此公式我們同樣可以計算出梯度洗脫中化合物

3、的k值。1. 3.k的使用原則在進行HPLC方法開發(fā)時一般要求k為1到10，最大容許范圍為2-20。在這個范圍內(nèi)我們可以得到又窄又高的色譜峰，同時化合物的分離能夠達到最佳。如果k小于1時，化合物的分離就會很差；當化合物的k大于20時候，繼續(xù)提高k值，化合物的分離度變化十分微小，但是保留時間卻增加明顯。1. 4.k的主要影響因素（1）有機相的比例：這個是改變k值的主要首選因素，通常有機相增加10%，會導致樣品的色譜峰k值下降大約2.5倍。（2）流動相pH這個主要是針對酸堿等離子化合物，比如酸性化合物一般在酸性條件下k值高，在堿性條件下k值低。（3）離子對試劑加入離子對試劑也可以改變化合物的k值的

4、保留。1. 5.k在方法開發(fā)中的應用k值的計算主要應用于初始方法開發(fā)中，先通過調(diào)整流動相中的有機相，使得所測定的化合物的k值在1-10以內(nèi)。注意這里設(shè)定值是1-10，而不是到20，確定這個范圍是為了后面方法進行優(yōu)化的時候能夠留有余地；當遇到化合物的分離度不好時，可以犧牲一部分k值進行提高化合物的分離度。但是注意k值不要到達20以上。如果k值在20時化合物的分離度還不符合要求，此時就需要更改一些其他的色譜條件了，不要再一味的進行延長化合物的保留時間了，因為此時延長保留時間對于化合物的分離度已經(jīng)幾乎沒有影響了，而且會導致峰型變寬。同時在方法開發(fā)選擇色譜柱的時候也要注意下化合物的k值，當比較不同的色譜柱對化合物分離的影響，一定要使所有的化合物能在一個同一個k值上來進行比較（此時需進行調(diào)節(jié)有機相的比例來實現(xiàn)），這樣才能獲得分離化合物最優(yōu)的色譜柱。舉例說明分離化合物A和B（B出峰在后），使用氨基柱、氰基柱、C18柱，首