ELISA實驗中本底及假陽性產生的原因分析

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上ELISA實驗中本底及假陽性產生的原因分析？1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別1.1 基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：a.分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產物包含更多的抗原決定簇，可提高試

2、劑盒的靈敏度，提高檢出率。d.純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g難度較大。1.2 合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：a.分子量太小b.一般只含有一個抗原決定簇c.純度高d.穩(wěn)定性差由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性，ELISA 診斷試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產品基本上采用了基因工程抗原，而且這

3、些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量ELISA 反應試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。值得欣慰的是也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學得對待反應結果。2假陽性本底產生的原因2. 1 抗原因素2.1. 1 融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應而產生了可疑標本。2.1.2 錯誤排序的

4、影響。合成肽在制備過程中，如果某些肽序列錯誤，會導致合成肽特異性改變而產生假陽性。另外，在構建基因工程表達載體時引入的HCV 核苷酸發(fā)生相位改變或點突變也會對抗原的特異性產生不利的影響，但由于基因工程技術的不斷進步，由工藝原因造成的抗原特異性降低會逐漸被克服。2.2. 3 抗原純度對特異性的影響。以HCV 抗原為例，利用大腸桿菌大規(guī)模表達后需經破碎細胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能最后的到一定純度的HCV 抗原。目前的工藝還不能做到抗原純度為100，因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過大腸桿菌感染的人，血清中的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產生反應而引起假陽性。2.2 人血清中的正常

5、IgG人血清中IgG 的濃度對HCV 試劑盒有較大的影響。HCV 試劑盒采用的間接法，酶標抗抗體能與人所有IgG 結合，而IgG 吸附于板孔的能力很強，因此我們采用100 微升樣稀加10 微升血清來將其稀釋以降低本底。到成人時，據統(tǒng)計學調查，成人的IgG 為12mg/ml，而有些人的IgG 濃度會遠遠高于此，這部分人的血清經ELISA 反應后往往會顯色。2.3 人血情中異常的IgG結締組織?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤等）等病癥時，血清中的風濕小體和其它異常IgG（IgG 濃度達到50mg/ml）會引起本底升高或假陽性。2.4 溶血的影響當溶血時，紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有

6、過氧化物酶的性質，當其通過吸附或“PP 效應”（蛋白質間相互吸附的現(xiàn)象）結合后，可催化A、B 液顯色而造成假陽性。2.5 操作不當引起任何操作不當都會影響結果，因此在操作過程中保證操作的規(guī)范，嚴格按照說明書進行是得到準確結果的關鍵和基礎。2.5.1 加樣2.5.1.1 樣品稀釋液少加，或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG 只占總IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很強，非特異IgG 可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的IgG均可以和酶標二抗發(fā)生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)

7、定的稀釋倍數，必將帶來陰性高值。2.5.1.2 酶結合物的不正確加入。一般來講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯(lián)板再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為120l。如果加入的酶多于120l 或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。2.5.2 溫育5.2.1 由于試劑盒確定的一定溫度下的反應時間并不是反應的終點，升高反應的溫度，會加快反應，同樣增加時間會延長反應，這樣得到的反應程度會比試劑盒確定的反應程度多，也會引起陰性高值或假陽性。5.2.2 由于試劑盒通常設定的反應溫度為37 度，在這個溫度下放置30 分鐘，蒸發(fā)的水分會很多，對于整個反應體系來講，各種

8、反應物的濃度會不斷增加，這樣必會導致反應最后的值升高。因此溫育時應蓋上膠貼。5.2.3 試劑盒在設計時，反應是在靜置條件下完成的，如果反應改變?yōu)檎駝訔l件，會加快分子的熱運動，增加反應的機會。5.2.4 試劑盒的溫育過程是在培養(yǎng)箱中進行，這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯(lián)板迅速升溫，但較難將溫度控制在較穩(wěn)定的溫度，往往高于37 度，同樣會引起高值陰性。2.5.3.洗板2.5.3.1 各個廠家使用的洗液配方是不同的，是根據各自試劑的條件配制的，采用不配套的洗液常會得到不正常的反應結果，包括本底過高。本公司的洗液采用獨特的洗滌系統(tǒng)不能和其它公司的試劑盒混用。2.5.3.2 試劑盒中提供的洗液是濃縮的

9、，應該稀釋到規(guī)定的倍數使用，過多稀釋洗液，會影響洗液的效果，而使反應的本底過高。2.5.3.3 稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水，電導率小于1.2s。如果水中含有過多的Ca2+、Mg2+，這些離子會占用表面活性劑，影響洗滌效果。2.5.3.4 洗板時，應每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對洗滌的效果影響也是很大的。本公司的酶聯(lián)板板孔為400l，比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時調整液量，以避免加液量不滿。2.5.3.5 洗板的次數不夠孔內多余的抗原（抗體）或酶結合物不能徹底去除，也會因此本底升高。2.5.3.6 洗板的強度和洗板的浸泡時間是密切相關的。洗板機不同，使用的泵不同，液

10、體加入時的沖力不同。如果加入洗液的沖力不大，也沒有設定浸泡時間，同樣會使結果的A 值偏高。2.5.3.7 洗板完畢后，要進行拍板，盡量采用質量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，紙屑會留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。2.5.4 顯色。加A、B 液準確，順序不能顛倒，要及時終止顯色。終止后要在3 分鐘內讀數，否則強陽性會變低。2.5.5.槍頭、加樣槽或其它來源的污染如果使用的槍頭、加樣槽是反復使用的，必須肯定其沒有來自酶或陽性的污染。酶作為反應的催化劑，及其微量也會很明顯影響反應。反復使用的槍頭、加樣槽清洗不當，也會干擾反應。如將槍頭使用84 消毒液浸泡而沒有沖洗干凈，因為84 是

11、強氧化劑，加入AB 液后就會顯色。同樣槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的PH 值，反應的結果也會不正常。常常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會將紙上的強氧化劑留在槽中而影響反應。2.5.6.測A 值時，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起A 值的升高。酶聯(lián)免疫吸附試驗；影響因素；控制方法 論文摘要：酶聯(lián)免疫吸附試驗(enayme liked immunosorbent assay，ELISA)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種檢測技術，因其具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于各種抗原和抗體的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動

12、作用。但ELISA測定中影響因素較多，操作過程中每個環(huán)節(jié)都會對試驗結果產生影響，出現(xiàn)錯誤的結果?，F(xiàn)筆者對影響實驗結果的常見因素及相應的控制方法分析探討1 試劑的因素 1.1 試劑的選擇 試劑的選擇是保證血液檢測質量的關鍵要素。雖然國家采用批批檢定的形式對ELISA 試劑嚴格把關，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購知名度相對高、具有“三證”的試劑，不要用無批號的試劑，最好選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。 1.2 試劑的準備 在臨床實驗室，對試劑的準備一般不太注意，通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面時間不夠的問

13、題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此，在ELISA 測定中試劑的準備最為關鍵的是，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置2030 min后，再進行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的目的能使反應微孔內的溫度較快地達到所需的溫度，以滿足后面的測定需求。2 樣本的因素 2.1 內源性干擾因素 包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等1。 1.1 類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同濃度的類風濕因子(RF)，其一般為IgM 型，亦有IgG和IgA型，具有與變性IgG產生非特異結合的特點，因為在ELISA測定中，其可與固相上

14、包被的特異抗體IgG 以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結合，從而出現(xiàn)假陽性結果。避免其發(fā)生的方法有：用F(ab)2替代完整的IgG。標本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理。檢測抗原時，可用2-巰基乙醇加入到標本稀釋液中使RF降解。 1.2 補體在固相酶免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有激活人補體系統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結合過程中抗體分子發(fā)生變構，使Fc段的補體C1q結合點暴露出來，使C1q成為一個中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結果。另一方面，固相抗體也會因為活化補體的結合，封閉抗體和抗原的表位結合能力而引起假陰性。解決的辦法是：用EDTA稀釋標本。56

15、 30 min 加熱血清使C1q滅活1，2。 2.2 外源性干擾因素 包括標本溶血、標本被細菌污染、標本保存時間過長和標本凝固不全等。 2.1 標本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物酶(HRP)為標志的ELISA 測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP 底物反應顯色。所以在采血時應注意手法，采集的血液勿用力振蕩，嚴防標本溶血。 2.2 標本的污染菌體可能含有內源性辣根過氧化物酶，可使實驗出現(xiàn)非特異性顯色。因此，ELISA檢測宜采集新鮮標本，如不能當時測定，5 d之內應4保存，1周后檢測應低溫凍存；同時，收

16、集標本采用無菌試管，可防止標本的污染。 2.3 標本的保存標本在冰箱中保存過久，血清中IgG可聚合成多聚體，AFP 可形成二聚體，在用間接法測定中會導致本底過深，甚至造成假陽性。 冰凍保存的標本反復凍融產生機械剪切力對標本中的蛋白等分子有破壞作用，可引起假陰性結果。因此，ELISA檢測盡量采用新鮮標本，長時凍存的樣本避免反復融凍。2.4 標本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原，可使結果呈假陽性。解決的方法有：于采血管中加入適當的抗凝劑；將采集后的血液放在架子上再放入37水浴中1 h，待充分凝固后再離心分離血清。 3 操作中的因素 3.1加樣 孵育前加樣時間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶

17、滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準，都可導致試驗結果不準確?？刂品椒ǎ簩嶒灅颖具^多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；作定量試驗時，使用加樣器加注試劑，并經常校正其準確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。 3.2 溫育 溫育是ELISA測定最為關鍵、最容易出現(xiàn)問題的步驟。最為常見的溫育溫度有37和室溫，其次是43和28。目前國內售ELISA 試劑盒溫育時間為37，30 min1 h，進口ELISA試劑盒則通常為37，12 h 能有較完全的結合。 2.1溫育時間、溫度的選擇一般根據試劑盒的說明書選擇溫育的時

18、間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37需要一定時間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠，易致弱陽性標本測不出來?？刂品椒ǎ喝缬袃煞N溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應時間的條件；用1個小溫度計放置在板孔反應液中測量觀察。 2.2 “邊緣效應”的排除“邊緣效應”是在使用96 孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產生的原因可能是為96 孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度造成的，因此在溫育時盡量采用水浴。 3.3洗板 ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉