第八章 微生物的遺傳與育種

1、研究微生物遺傳學(xué)的意義1928年，Griffith進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn)：（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活對(duì)小鼠注射活S菌小鼠死亡對(duì)小鼠注射活R菌和熱死S菌 小鼠死亡 抽取心血分離活的S菌（3）S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn)活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液長(zhǎng)出大量R菌和少量S菌活R菌長(zhǎng)出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S. pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：只有S型細(xì)菌的DNA才能將S. Pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明S型菌株轉(zhuǎn)移

2、給R型菌株的，是遺傳因子。（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中所以，進(jìn)入細(xì)胞的是噬菌體的核酸而不是蛋白質(zhì)。植物病毒重建實(shí)驗(yàn)植物病毒重建實(shí)驗(yàn)RNAv選用選用TMV和和霍氏車前花葉病毒（霍氏車前花葉病毒（HRV），），分別分別拆分取得各自的拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分分別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒： （1）RNA（TMV） 蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（HRV）（2）RNA（HRV） 蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（TMV）v用兩種雜合病毒感染寄主：用兩種雜合病毒感染寄主：（1

3、）表現(xiàn)）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常的典型癥狀病分離到正常TMV粒子粒子（2）表現(xiàn)）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。粒子。v上述結(jié)果說明，在上述結(jié)果說明，在RNA病毒中，病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。核酸。遺傳豐余：遺傳豐余：三、原核生物的質(zhì)粒三、原核生物的質(zhì)粒1、定義、定義質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）：）：一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。中。 質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的；在質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般

4、是非必需的；在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的某些特殊條件下，質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能，從而使宿主得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。機(jī)能，從而使宿主得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。2、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)通常以共價(jià)閉合環(huán)狀通常以共價(jià)閉合環(huán)狀(covalently closed circle，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱CCC)的超螺旋雙的超螺旋雙鏈鏈DNA分子存在于細(xì)胞中；分子存在于細(xì)胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；質(zhì)粒；質(zhì)粒分子的大小范圍從質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到左右到1000kb； 細(xì)菌質(zhì)粒多在細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）以內(nèi)）3、質(zhì)粒的類型、質(zhì)粒的類型嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stri

5、ngent plasmid)：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制 同步，同步，低拷貝數(shù)低拷貝數(shù)松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制不復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制不 同步，同步，高拷貝數(shù)高拷貝數(shù)窄宿主范圍質(zhì)粒窄宿主范圍質(zhì)粒(narrow host range plasmid)（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）廣宿主范圍質(zhì)粒廣宿主范圍質(zhì)粒(broad host range plasmid)（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）4、質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用、質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)

6、：（1）體積小，易分離和操作）體積小，易分離和操作（2）環(huán)狀，穩(wěn)定）環(huán)狀，穩(wěn)定（3）獨(dú)立復(fù)制）獨(dú)立復(fù)制（4）拷貝數(shù)多）拷貝數(shù)多（5）存在標(biāo)記位點(diǎn)，易篩選）存在標(biāo)記位點(diǎn)，易篩選E. coli的的pBR322質(zhì)粒是質(zhì)粒是一個(gè)一個(gè) 常用的克隆載體常用的克隆載體5、質(zhì)粒的檢測(cè)、質(zhì)粒的檢測(cè)t 提取所有胞內(nèi)提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；后電鏡觀察；t 超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察；超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察；t 對(duì)于實(shí)驗(yàn)室常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點(diǎn)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點(diǎn)， 如抗藥性初步判斷。如抗藥性初步判斷。6、質(zhì)粒的主要種類、質(zhì)粒的主要種類質(zhì)粒所編碼質(zhì)粒所編碼的功能和賦的功

7、能和賦予宿主的表予宿主的表型效應(yīng)型效應(yīng)致育因子致育因子（Fertility factor，F(xiàn)因子）因子）抗性因子抗性因子（Resistance factor，R因子）因子）產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocin production plasmid）毒性質(zhì)粒毒性質(zhì)粒（virulence plasmid）代謝質(zhì)粒代謝質(zhì)粒（Metabolic plasmid）隱秘質(zhì)粒隱秘質(zhì)粒（cryptic plasmid）（1）致育因子致育因子(Fertility factor，F(xiàn)因子因子)又稱又稱F質(zhì)粒，其大小約質(zhì)粒，其大小約100kb，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象這是最早發(fā)現(xiàn)的一

8、種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象（接（接合作用）合作用）有關(guān)的質(zhì)粒有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株菌株（相當(dāng)于雄性），無（相當(dāng)于雄性），無F質(zhì)粒的質(zhì)粒的菌株稱為菌株稱為F-菌株（相當(dāng)于雌菌株（相當(dāng)于雌性）。性）。F因子能以游離狀態(tài)因子能以游離狀態(tài)(F+)和和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中，所以存在于細(xì)胞中，所以又稱之為附加體又稱之為附加體(episome)。（2）抗性因子（抗性因子（Resistance factor，R因子）因子）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡(jiǎn)稱包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡(jiǎn)稱R質(zhì)粒。質(zhì)粒?？剐再|(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)

9、生抗藥性的重要原因之一?？剐再|(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。R質(zhì)粒質(zhì)?？剐赞D(zhuǎn)移因子（抗性轉(zhuǎn)移因子（RTF）：轉(zhuǎn)移和復(fù)制基因轉(zhuǎn)移和復(fù)制基因抗性決定因子抗性決定因子：抗性基因：抗性基因R100質(zhì)粒質(zhì)粒(89kb)可使宿主對(duì)下列藥物及重金屬具有抗性：可使宿主對(duì)下列藥物及重金屬具有抗性：汞（汞（mercuric ion ，mer）四環(huán)素（四環(huán)素（tetracycline，tet ）鏈霉素鏈霉素(Streptomycin, Str)、磺胺磺胺(Sulfonamide, Su)、氯霉素氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、夫西地酸夫西地酸（fusidic acid，fus）并且

10、負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上。并且負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上。（3）產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocin production plasmid）一般都位于一般都位于質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，因此，子上，因此，細(xì)菌素可以細(xì)菌素可以殺死同種但殺死同種但不攜帶該質(zhì)不攜帶該質(zhì)粒的菌株。粒的菌株。細(xì)菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名：細(xì)菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名：大腸桿菌（大腸桿菌（E. coli）產(chǎn)生的細(xì)菌素為產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins（大腸桿大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。質(zhì)粒。細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及細(xì)菌素結(jié)構(gòu)

11、基因涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)的基因賦予宿主發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)的基因賦予宿主對(duì)該細(xì)菌素具有對(duì)該細(xì)菌素具有“免疫力免疫力”的相關(guān)的相關(guān)產(chǎn)物的基因產(chǎn)物的基因（4）毒性質(zhì)粒（毒性質(zhì)粒（virulence plasmid）許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對(duì)宿主（動(dòng)物、植物）質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對(duì)宿主（動(dòng)物、植物）造成傷害。造成傷害。產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸毒原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸

12、毒素編碼的質(zhì)粒。素編碼的質(zhì)粒。蘇云金桿菌含有編碼蘇云金桿菌含有編碼內(nèi)毒素內(nèi)毒素(伴伴孢晶體中孢晶體中)的質(zhì)粒的質(zhì)粒根癌土壤桿菌所含根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子癭瘤的致病因子Ti質(zhì)粒質(zhì)粒中的中的T-DNA可攜帶任何外源基因整合到植物基可攜帶任何外源基因整合到植物基因組中，是植物基因工程中有效的克隆載體因組中，是植物基因工程中有效的克隆載體（5）代謝質(zhì)粒（代謝質(zhì)粒（Metabolic plasmid）質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基質(zhì)的酶，進(jìn)行共生固氮，或產(chǎn)生抗生素（某些放些基質(zhì)的酶，

13、進(jìn)行共生固氮，或產(chǎn)生抗生素（某些放線菌）等。線菌）等。將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡(jiǎn)單形式用的簡(jiǎn)單形式，環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。，環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。降解質(zhì)粒：降解質(zhì)粒：假單胞菌：假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物如芳香簇化合物(苯苯)、農(nóng)、農(nóng)藥藥(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟腦等的能辛烷和樟腦等的能力。力。（6）隱秘質(zhì)粒（隱秘質(zhì)粒（cryptic plasmid）隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，它們的存在只有通過物理隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型

14、效應(yīng)，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。的方法，例如用凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。 它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）（一般加上抗性基因）一、基因突變一、基因突變 一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變、可遺傳、序列的任何改變、可遺傳、自發(fā)或誘變產(chǎn)生自發(fā)或誘變產(chǎn)生基因突變基因突變狹義：點(diǎn)突變狹義：點(diǎn)突變廣義：基因突變和染色體畸變廣義：基因突變和染色體畸變野生型

15、（原始性狀）野生型（原始性狀）基因突變基因突變突變型（新性狀）突變型（新性狀）（一）突變類型（一）突變類型（二）（二）基因突變的特點(diǎn)基因突變的特點(diǎn) 1、隨機(jī)性、隨機(jī)性 2、稀有性、稀有性 3、獨(dú)立性、獨(dú)立性 4、可逆性、可逆性 5、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性（三）基因突變隨機(jī)性的實(shí)驗(yàn)證明（三）基因突變隨機(jī)性的實(shí)驗(yàn)證明三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)變量實(shí)驗(yàn)變量實(shí)驗(yàn)涂布實(shí)驗(yàn)涂布實(shí)驗(yàn)影印實(shí)驗(yàn)影印實(shí)驗(yàn)證明突變是自發(fā)產(chǎn)生證明突變是自發(fā)產(chǎn)生的，并且突變的性狀的，并且突變的性狀與引起突變的原因間與引起突變的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。野生型野生型（原始性狀）（原始性狀）特定環(huán)境特定環(huán)境突變型突變型（適應(yīng)環(huán)境的新性狀

16、）（適應(yīng)環(huán)境的新性狀）馴化馴化定向定向誘變誘變篩選篩選？突變的原因突變的原因？（四）基因突變及其機(jī)制（四）基因突變及其機(jī)制1、誘發(fā)突變：物理、化學(xué)核生物的因素，提高突、誘發(fā)突變：物理、化學(xué)核生物的因素，提高突 變率的人為的作法變率的人為的作法（1）堿基的置換）堿基的置換堿基的置換引起的突變堿基的置換引起的突變（2）移碼突變：添加或缺失）移碼突變：添加或缺失核苷酸，引起閱讀錯(cuò)誤核苷酸，引起閱讀錯(cuò)誤- 錯(cuò)誤錯(cuò)誤+ 錯(cuò)誤錯(cuò)誤-+ 正常正常- 正常正常+ 正常正常（3）染色體畸變：缺失、重復(fù)、插入、易位、倒位）染色體畸變：缺失、重復(fù)、插入、易位、倒位2、自發(fā)突變：無人為因素下的低頻率突變?cè)颍?、自發(fā)突

17、變：無人為因素下的低頻率突變?cè)颍海?）背景輻射）背景輻射（2）有害產(chǎn)物積累）有害產(chǎn)物積累（3）堿基錯(cuò)配）堿基錯(cuò)配（五）紫外線對(duì)（五）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)的損傷及其修復(fù)嘧啶嘧啶嘧啶二聚體嘧啶二聚體UV1、光復(fù)活作用、光復(fù)活作用嘧啶二聚體嘧啶二聚體嘧啶嘧啶光解酶光解酶2、切除修復(fù)切除修復(fù)二、突變與育種二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種（一）自發(fā)突變與育種： 生產(chǎn)選育生產(chǎn)選育 定向培育定向培育（二）誘變育種（二）誘變育種1、誘變育種的基本環(huán)節(jié)、誘變育種的基本環(huán)節(jié)2、誘變育種的原則、誘變育種的原則（1）使用簡(jiǎn)便有效的誘變劑）使用簡(jiǎn)便有效的誘變劑誘變劑誘變劑物理因素物理因素化學(xué)因素化學(xué)因素紫外

18、線紫外線激光激光離子束離子束X射線射線r射線射線快中子快中子烷化劑烷化劑堿基類似物堿基類似物吖啶化合物吖啶化合物Ames試驗(yàn)：利用細(xì)菌模型了解潛在化學(xué)致癌物的誘變作用試驗(yàn)：利用細(xì)菌模型了解潛在化學(xué)致癌物的誘變作用“生物化學(xué)統(tǒng)一性生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則：法則： 人和細(xì)菌在人和細(xì)菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會(huì)作用于人的生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會(huì)作用于人的DNA，使其發(fā)使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。誘變劑的共性原則：誘變劑的共性原則：化學(xué)藥劑對(duì)細(xì)菌的誘變率與其對(duì)動(dòng)物的致癌性成正

19、比化學(xué)藥劑對(duì)細(xì)菌的誘變率與其對(duì)動(dòng)物的致癌性成正比超過超過95%95%的致癌物質(zhì)對(duì)微生物有誘變作用的致癌物質(zhì)對(duì)微生物有誘變作用90%90%以上的非致癌物質(zhì)對(duì)微生物沒有誘變作用以上的非致癌物質(zhì)對(duì)微生物沒有誘變作用 美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的Bruce Ames教授于教授于1966年發(fā)年發(fā)明，因此稱為明，因此稱為Ames試驗(yàn)試驗(yàn)具體操作：檢測(cè)具體操作：檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhmurium)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變的回復(fù)突變率率回復(fù)突變回復(fù)突變：突變體失去的野生型性狀，可以通過第突變體失去的野生型性狀，可以通過

20、第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變證明證明Ames試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例：試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例： 國(guó)外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物國(guó)外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)停反應(yīng)?！保捎谄渌幮э@著，在，由于其藥效顯著，在60-7060-70年代十分流行，年代十分流行， 但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)停反應(yīng)?！?，后來采用，后來采用AmesAmes試試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具

21、有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用物被禁止使用 但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行AmesAmes試驗(yàn)檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，（2）選用優(yōu)良的出發(fā)菌株）選用優(yōu)良的出發(fā)菌株（3）處理單細(xì)胞或單孢子懸浮液處理單細(xì)胞或單孢子懸浮液（4）使用最佳誘變劑量）使用最佳誘變劑量 劑量劑量 = 強(qiáng)度（濃度）強(qiáng)度（濃度） 作用時(shí)間作用時(shí)間 相對(duì)劑量相對(duì)劑量 = 殺菌率殺菌率（5）利用協(xié)同效應(yīng)）利用協(xié)同效應(yīng)（6）尋找和利用形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)）尋找和利用形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)（7）設(shè)計(jì)高效

22、率篩選方案）設(shè)計(jì)高效率篩選方案（8）根據(jù)具體情況創(chuàng)造新型篩選方案）根據(jù)具體情況創(chuàng)造新型篩選方案3、突變株的篩選：（、突變株的篩選：（1）產(chǎn)量突變株的篩選）產(chǎn)量突變株的篩選 （2）抗藥性突變株的篩選）抗藥性突變株的篩選 （3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選突變株的篩選方法突變株的篩選方法誘變誘變檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)（抗生素法）（抗生素法）（菌絲過濾法）（菌絲過濾法）（差別殺菌法）（差別殺菌法）夾層培養(yǎng)法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法逐個(gè)檢出法影印平板法影印平板法生長(zhǎng)譜法生長(zhǎng)譜法混合氨基酸法混

23、合氨基酸法第三節(jié)第三節(jié) 基因重組和雜交育種基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化（一）轉(zhuǎn)化供體菌供體菌受體菌受體菌DNA片段片段1928年，年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：力進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：1、建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞、建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞：感受態(tài)細(xì)胞：具有攝取外源具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞能力的細(xì)胞 自然感受態(tài)自然感

24、受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性，受細(xì)菌的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性，受細(xì)菌 自身的基因控制；自身的基因控制； 人工感受態(tài)人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNADNA的的 能力，或人為地將能力，或人為地將DNADNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)2、外源游離、外源游離DNA分子（轉(zhuǎn)化因子）分子（轉(zhuǎn)化因子）轉(zhuǎn)化過程（革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型）轉(zhuǎn)化過程（革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型）噬菌體噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)：轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)：轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)：提純的噬菌體提

25、純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：a）對(duì)核酸酶敏感；對(duì)核酸酶敏感；b）不需要活的不需要活的DNA供體細(xì)胞；供體細(xì)胞；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化供體菌轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化供體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系； d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多人工轉(zhuǎn)化人工轉(zhuǎn)化用用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。段

26、。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細(xì)菌自身的基因所控制；不是由細(xì)菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源一種可以攝取外源DNA的的“人工感受態(tài)人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高；質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高；（二）細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（二）細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction） 通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的 DNA 片片段攜帶到受體細(xì)

27、胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo) 細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型：細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型：普遍普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)局限局限轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別局限轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別(三三)溶源轉(zhuǎn)變?nèi)茉崔D(zhuǎn)變普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌染色體的任何部分供體菌染色體的任何部分到受體細(xì)胞中到受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種

28、后果：外源外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。進(jìn)入受體的外源進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞通過與細(xì)胞染色體的重組交換染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行整合、重組和復(fù)制，但其攜帶的基不能進(jìn)行整合、重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物，到其基因產(chǎn)物，在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)溫和噬菌體感染溫和噬菌體感染

29、整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體割而連在噬菌體DNA上上部分缺陷的溫和噬菌體部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中體菌中溫和噬菌體溫和噬菌體裂解時(shí)的裂解時(shí)的不正常切割：不正常切割：包含包含galgal或或biobio基因基因缺陷噬菌體缺陷噬菌體DNADNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的分子在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的DNADNA分子一

30、樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需分子一樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，但沒有正常噬菌體的要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒，但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力溶源性和增殖能力，感染受體細(xì)胞后，感染受體細(xì)胞后，通過，通過DNADNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子。整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子。低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物裂解物正常噬菌體正常噬菌體極少量的極少量的部分部分缺陷噬菌體缺陷噬菌體（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子（極少量）（極少量）低感染復(fù)數(shù)低感染復(fù)數(shù)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物裂解物正常噬菌體正常噬菌

31、體極少量的極少量的部分缺陷噬菌體部分缺陷噬菌體（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒三次感染，三次整合，一次切割，兩次復(fù)制，兩三次感染，三次整合，一次切割，兩次復(fù)制，兩次裂解，兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)次裂解，兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)高感染復(fù)數(shù)高感染復(fù)數(shù)雙重溶源菌雙重溶源菌缺陷噬菌體缺陷噬菌體和正常噬菌和正常噬菌體同步復(fù)制體同步復(fù)制高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物裂解物部分缺陷噬菌體部分缺陷噬菌體（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）正常噬菌體正常噬菌體等等量量轉(zhuǎn)導(dǎo)顆轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒粒局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子（大量）（大量）低感染低感染復(fù)數(shù)復(fù)數(shù)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：局限轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：a）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地與

32、噬菌體局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地與噬菌體DNA連接，連接，與噬菌體與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)一起進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中。胞中。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。的個(gè)別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。而普遍性而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性。轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性。 溶源轉(zhuǎn)變是溶源轉(zhuǎn)變是一個(gè)與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象一個(gè)與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化，因噬

33、菌體的溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的基因整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象?，F(xiàn)象。溶源轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)：溶源轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)： 1、噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；噬菌體不攜帶任何供體菌的基因；2、噬菌體是完整的，而不是缺陷的；、噬菌體是完整的，而不是缺陷的；3、噬菌體基因的整合到噬菌體基因的整合到宿主染色體上宿主染色體上導(dǎo)致導(dǎo)致宿主獲得宿主獲得 新性狀，無通過基因重組而形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子；新性狀，無通過基因重組而形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子；4 4、宿主獲得新性狀具有不穩(wěn)定性、宿主獲得新性狀具有不穩(wěn)定性（四）接合（四）接合(conjugation

34、)通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程和重組過程1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn)中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致。和重組所致。證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管型管實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)（ Bernard Davis，1950 ）接合機(jī)制接合機(jī)制(大腸桿菌的接合機(jī)制大腸桿菌的接合機(jī)制)接合作用是由一種被稱為接合

35、作用是由一種被稱為F因子的因子的質(zhì)粒介導(dǎo)。質(zhì)粒介導(dǎo)。F因子的分子量通常為因子的分子量通常為5107，上面，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛及控制接合有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛及控制接合過程進(jìn)行的過程進(jìn)行的20多個(gè)基因。多個(gè)基因。F因子為附加體質(zhì)粒因子為附加體質(zhì)粒既可以脫離染色體在細(xì)既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可插入（整合）到染色體上入（整合）到染色體上F F因子的四種細(xì)胞形式因子的四種細(xì)胞形式 a）F-菌株菌株(“雌性雌性”菌株菌株)，不含不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收接合作用接收F因子而變成因子而變成F+菌株菌株；b）F+菌株菌株(“

36、雄性雄性”菌株菌株)， F因因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c c）HfrHfr菌株菌株，F(xiàn) F因子插入到染色體因子插入到染色體DNADNA上上，細(xì)胞表面有性菌毛。，細(xì)胞表面有性菌毛。d d）F F菌株菌株，Hfr菌株內(nèi)的菌株內(nèi)的F因子因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體形成游離的但攜帶一小段染色體基因的基因的F因子，特稱為因子，特稱為F因因 子。子。 細(xì)胞表面同樣有性菌毛。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。1） F+F-雜交雜交理化因子的處理可將理化因子的處理可將F因子消除而使因子消除而使F+菌株變成菌株變成F-菌株菌株F

37、+菌株的菌株的F因子向因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞因子的宿主細(xì)胞的染色體的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。一般不被轉(zhuǎn)移。a a）F F+ +細(xì)菌通過性毛與細(xì)菌通過性毛與F F- -細(xì)菌接觸并發(fā)生細(xì)菌接觸并發(fā)生相互作用；相互作用；b b）F F+ +細(xì)菌的細(xì)菌的F F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F F因子的一條鏈到因子的一條鏈到F F- -細(xì)菌中。細(xì)菌中。 c c）F F因子的一條鏈一進(jìn)入因子的一條鏈一進(jìn)入F F- -細(xì)菌中，就細(xì)菌中，就在在F F- -細(xì)菌中復(fù)制新的細(xì)菌中復(fù)制新的 F F因子。因子。d d）復(fù)制完成后，復(fù)制

38、完成后， F F- -細(xì)菌變成細(xì)菌變成F F+ + ，同時(shí)原有同時(shí)原有F F+ +細(xì)胞也完成細(xì)胞也完成F F因子另一條鏈的復(fù)制，所因子另一條鏈的復(fù)制，所以轉(zhuǎn)移是以轉(zhuǎn)移是F F+ +的拷貝。的拷貝。所以最終所以最終雜交的結(jié)果雜交的結(jié)果是是F F- -細(xì)菌變成細(xì)菌變成F F+ +細(xì)菌，而原有的細(xì)菌，而原有的F F+ +細(xì)菌則不變。細(xì)菌則不變。HfrHfr菌株的菌株的F F因子插入到染色體因子插入到染色體DNADNA上，因此上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給移轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F F- -細(xì)細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為胞并

39、發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株高頻重組菌株。2 2）HfrHfr F-雜交雜交Hfr菌株仍然保持著菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，性菌毛，并象并象F+一樣與一樣與F-細(xì)胞進(jìn)行接合。細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是，當(dāng)所不同的是，當(dāng)OriT序列被缺刻螺旋酶識(shí)別而產(chǎn)序列被缺刻螺旋酶識(shí)別而產(chǎn)生缺口后，生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)因子的先導(dǎo)區(qū)(leading region)結(jié)合著結(jié)合著染色體染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。F因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。HfrF-雜交后的受體細(xì)胞雜交后的受體細(xì)胞(或接合子或接合子)大多數(shù)仍然大多數(shù)仍然是是F-。染色體上越靠近染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，在多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。中斷雜交（中斷雜交（interrupted mating）技術(shù)技術(shù)利用利用HfrF-的接合過程，的接合過程，在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細(xì)菌，然后分析受體細(xì)菌基因型，以時(shí)間分散接合中的細(xì)菌，然后分析