實驗八微生物生理生化試驗

1、實驗八實驗八 微生物生理生化試驗微生物生理生化試驗1 1 菌種菌種 大腸桿菌，普通變形桿菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，普通變形桿菌，金黃色葡萄球菌，產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌2 2 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 尿素瓊脂試管，尿素瓊脂試管，蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管各酵管和乳糖發(fā)酵管各3支。支。3 3 溶液和試劑溶液和試劑 甲基紅指示劑，甲基紅指示劑，5 萘酚，萘酚，乙醚和吲哚試劑乙醚和吲哚試劑4 4 儀器和其他用品儀器和其他用品 接種針接種針一一 實驗器材實驗器材二二 目的要求目的要求1 1 大分子物質(zhì)水解試驗大分子物質(zhì)水解試驗（1

2、 1）證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明）證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)；不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)；（2 2）掌握微生物大分子物質(zhì)水解實驗的原理和方法。）掌握微生物大分子物質(zhì)水解實驗的原理和方法。2 2 IMViCIMViC試驗試驗了解了解IMViCIMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。3 3 糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗（1 1）了解糖發(fā)酵的原理和在腸細(xì)菌鑒定中的重要作用。）了解糖發(fā)酵的原理和在腸細(xì)菌鑒定中的重要作用。（2 2）掌握通過糖發(fā)酵鑒別

3、不同微生物的方法。）掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。 三三 基本原理基本原理1 1 大分子物質(zhì)水解試驗大分子物質(zhì)水解試驗 微生物對大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的微生物對大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通過加水裂解大分子物質(zhì)為較小化合物，使其能被運輸至細(xì)胞內(nèi)。過加水裂解大分子物質(zhì)為較小化合物，使其能被運輸至細(xì)胞內(nèi)。水解過程可通過水解過程可通過底物的變化來證明，如細(xì)菌對大分子的淀粉不能直接利用，產(chǎn)生胞外酶

4、底物的變化來證明，如細(xì)菌對大分子的淀粉不能直接利用，產(chǎn)生胞外酶(淀粉酶淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖(或麥芽糖或麥芽糖)，再被細(xì)菌吸收利用，再被細(xì)菌吸收利用，這一過程可以用碘測定不再產(chǎn)生藍色來證明；水解明膠可觀察到明膠被液化；脂這一過程可以用碘測定不再產(chǎn)生藍色來證明；水解明膠可觀察到明膠被液化；脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸改變培養(yǎng)基的肪水解后產(chǎn)生脂肪酸改變培養(yǎng)基的pH，其中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色變，其中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色。為深紅色。 明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在252

5、5以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形式存在，而式存在，而在在2525以上明膠會液化。有些微生物能產(chǎn)生明膠酶，水解明膠蛋白，以上明膠會液化。有些微生物能產(chǎn)生明膠酶，水解明膠蛋白，而使明膠液化，甚至在而使明膠液化，甚至在4 仍能保持液化狀態(tài)。仍能保持液化狀態(tài)。 有些微生物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素，石蕊牛奶培養(yǎng)基由脫脂牛有些微生物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素，石蕊牛奶培養(yǎng)基由脫脂牛奶和石蕊配制而成，是昏濁的藍色，酪素水解成氨基酸和肽后，培養(yǎng)基奶和石蕊配制而成，是昏濁的藍色，酪素水解成氨基酸和肽后，培養(yǎng)基會變成透明。石蕊牛奶也用于檢測會變成透明。石蕊牛奶也用于檢測乳糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵，在

6、酸存在下，石蕊會轉(zhuǎn)變，在酸存在下，石蕊會轉(zhuǎn)變成成粉紅色粉紅色，過量的酸可引起牛奶的固化（凝乳形成），氨基酸的分解會，過量的酸可引起牛奶的固化（凝乳形成），氨基酸的分解會引起引起堿性反應(yīng)堿性反應(yīng)，石蕊變?yōu)?，石蕊變?yōu)樽仙仙?。某些?xì)菌能還原石蕊，使試管底部變?yōu)?。某些?xì)菌能還原石蕊，使試管底部變?yōu)榘咨０咨?尿素酶能分解尿素釋放氨。尿素瓊脂含有尿素、葡萄糖和酚紅，酚尿素酶能分解尿素釋放氨。尿素瓊脂含有尿素、葡萄糖和酚紅，酚紅在紅在pH6.8時為黃色，在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生時為黃色，在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨，培養(yǎng)基的氨，培養(yǎng)基的pH升高，在升高，在pH8.4時

7、，指示劑轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。盡管許多時，指示劑轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶，但是利用尿素的速度比變形桿菌屬的細(xì)菌要微生物都可以產(chǎn)生尿素酶，但是利用尿素的速度比變形桿菌屬的細(xì)菌要慢，因此尿素酶實驗被用于從其它慢，因此尿素酶實驗被用于從其它非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個屬的成員。這個屬的成員。2 2 IMViC（吲哚、甲基紅、伏普和檸檬酸鹽）試驗（吲哚、甲基紅、伏普和檸檬酸鹽）試驗 這四個試驗主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌，多用于水的這四個試驗主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌，多用于水的細(xì)菌檢查。細(xì)菌檢查。 吲哚試驗吲哚試驗是用來檢測吲

8、哚的產(chǎn)生，有些細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋是用來檢測吲哚的產(chǎn)生，有些細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚（紅色化合物）。但并非所有的微生物都具有分解形成紅色的玫瑰吲哚（紅色化合物）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗可作為一個生物化學(xué)檢測的指標(biāo)。色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗可作為一個生物化學(xué)檢測的指標(biāo)。 大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。 甲基紅試驗甲基紅試驗是用來檢測有葡萄糖產(chǎn)生的有機

9、酸，如甲酸、乙酸、乳是用來檢測有葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅由橙黃色（紅由橙黃色（pH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。利用該），即甲基紅反應(yīng)。利用該試驗可區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。這兩個細(xì)菌在培養(yǎng)早期均產(chǎn)生有機試驗可區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。這兩個細(xì)菌在培養(yǎng)早期均產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使

10、機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH大約升至大約升至6。因此，。因此，此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。 大腸桿菌為陽性（紅色），產(chǎn)氣腸桿菌為陰性（黃色）。大腸桿菌為陽性（紅色），產(chǎn)氣腸桿菌為陰性（黃色）。 伏普試驗伏普試驗用于測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)用于測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與

11、蛋白胨中的精氨酸的呱基作用，生成紅色化合物，即伏普試驗陽性，不產(chǎn)生紅的精氨酸的呱基作用，生成紅色化合物，即伏普試驗陽性，不產(chǎn)生紅色化合物為反應(yīng)陰性。色化合物為反應(yīng)陰性。 產(chǎn)氣腸桿菌為陽性，大腸桿菌為陰性。產(chǎn)氣腸桿菌為陽性，大腸桿菌為陰性。 硫化氫試驗硫化氫試驗也是檢查腸道細(xì)菌的生化試驗。硫化氫試驗是檢測硫化也是檢查腸道細(xì)菌的生化試驗。硫化氫試驗是檢測硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細(xì)菌檢查的常用生化試驗。有些細(xì)菌能分解含氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細(xì)菌檢查的常用生化試驗。有些細(xì)菌能分解含硫的有機物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培硫的有機物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫

12、與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物，為硫化氫養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物，為硫化氫試驗陽性，可用于鑒別細(xì)菌。試驗陽性，可用于鑒別細(xì)菌。 產(chǎn)氣腸桿菌為陽性，大腸桿菌為陰性。產(chǎn)氣腸桿菌為陽性，大腸桿菌為陰性。3 3 糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗 糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要，尤為重要，不同的細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖不同的細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖(醇醇)的酶，因此的酶，因此不同細(xì)菌在分解不同細(xì)菌在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異，有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸糖類物質(zhì)的能力上有很

13、大的差異，有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、甲烷、二氧化碳等），有（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、甲烷、二氧化碳等），有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。比如，大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。比如，大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，普通變形桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。糖發(fā)酵管含有蛋普通變形桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。糖發(fā)酵管含有蛋白胨、指示劑（溴甲酚紫）和不同的糖類。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，溴甲酚紫指白胨、指示劑（溴甲酚紫）和不同的糖類。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，溴甲酚紫指示劑可由紫色（示劑可由紫色（pH6.8pH6.8）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（）

14、轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（pH5.2pH5.2）。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管）。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中有無氣泡來證明。中有無氣泡來證明。四、操作步驟四、操作步驟（一）大分子物質(zhì)水解試驗（一）大分子物質(zhì)水解試驗1 1 明膠水解試驗明膠水解試驗（1 1）?。┤? 3支明膠培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管欲接種的菌名。支明膠培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管欲接種的菌名。（2 2）用接種針分別穿刺接種枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。）用接種針分別穿刺接種枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。（3 3）將接種后的試管置）將接種后的試管置20 20 培養(yǎng)培養(yǎng)25 d。（4）觀察明膠液化情況。）觀察明膠液化情況。2 2 石蕊

15、牛奶試驗石蕊牛奶試驗（1 1）?。┤? 2支石蕊牛奶培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管欲接種的菌名。支石蕊牛奶培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管欲接種的菌名。（2 2）用接種針分別穿刺接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。）用接種針分別穿刺接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。（3 3）將接種后的試管置）將接種后的試管置35 35 培養(yǎng)培養(yǎng)242448h48h。（4 4）觀察培養(yǎng)基顏色變化。）觀察培養(yǎng)基顏色變化。石蕊在酸性條件下為粉紅色，堿性條件下為紫色，而被還原時為白色。石蕊在酸性條件下為粉紅色，堿性條件下為紫色，而被還原時為白色。3 3 尿素試驗?zāi)蛩卦囼灒? 1）?。┤? 2支尿素培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管

16、欲接種的菌名。支尿素培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管欲接種的菌名。（2 2）分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌）分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌（兩種細(xì)菌對尿素的分（兩種細(xì)菌對尿素的分解速度不同），需要觀察解速度不同），需要觀察2 2次。次。（3 3）將接種后的試管置）將接種后的試管置35 35 培養(yǎng)培養(yǎng)242448h48h。（4 4）觀察培養(yǎng)基顏色變化。）觀察培養(yǎng)基顏色變化。 尿素酶存在時為紅色，無尿素酶時為黃色。尿素酶存在時為紅色，無尿素酶時為黃色。（二）（二）IMViC試驗試驗1 1 接種與培養(yǎng)接種與培養(yǎng)（1 1）用接種針將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別穿刺接入）用接種針將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿

17、菌分別穿刺接入2 2支醋酸鉛培養(yǎng)基支醋酸鉛培養(yǎng)基中（硫化氫試驗），置中（硫化氫試驗），置3737培養(yǎng)培養(yǎng)48 h48 h。（2 2）將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接入）將大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接入2 2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（甲支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（甲基紅和伏普試驗），置基紅和伏普試驗），置3737培養(yǎng)培養(yǎng)48 h48 h。2 2 結(jié)果觀察結(jié)果觀察（1 1）硫化氫試驗：培養(yǎng)）硫化氫試驗：培養(yǎng)48 h48 h后，觀察后，觀察黑色硫化鉛黑色硫化鉛的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。（2 2）甲基紅試驗：培養(yǎng)）甲基紅試驗：培養(yǎng)48 h48 h后，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入甲基紅后，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入甲基紅試劑試

18、劑2 2滴，培養(yǎng)基變?yōu)榈?，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色為陽性，變?yōu)辄S色為陰性紅色為陽性，變?yōu)辄S色為陰性。（3 3）伏普試驗：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入甲液，然后加入等量）伏普試驗：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入甲液，然后加入等量的乙液，用力振蕩，置的乙液，用力振蕩，置3715371530 min,30 min,加快反應(yīng)速度，培養(yǎng)物加快反應(yīng)速度，培養(yǎng)物呈紅色呈紅色者，為伏普試驗陽性。者，為伏普試驗陽性。（三）（三）糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗1 1 在發(fā)酵管上標(biāo)明所接種的細(xì)菌名稱。在發(fā)酵管上標(biāo)明所接種的細(xì)菌名稱。2 2 取葡萄糖發(fā)酵管取葡萄糖發(fā)酵管3 3支，分別接入大腸桿菌、普通變形桿菌，第三支不支，分別接入大腸桿菌、普

19、通變形桿菌，第三支不接接 種，作為對照，另取乳糖發(fā)酵管種，作為對照，另取乳糖發(fā)酵管3 3支，同樣操作。支，同樣操作。3 3 將接種和對照的發(fā)酵管置將接種和對照的發(fā)酵管置37 37 培養(yǎng)培養(yǎng)242448h48h。4 4 觀察發(fā)酵管的顏色和有無氣泡。觀察發(fā)酵管的顏色和有無氣泡。各試驗需接種的菌種各試驗需接種的菌種: :（1 1）明膠水解試驗：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）明膠水解試驗：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 20 220 25 d5 d（2 2）石蕊牛奶試驗：普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌）石蕊牛奶試驗：普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌 35 2435 2448 h48 h（3

20、 3）尿素試驗：普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌）尿素試驗：普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌 35 2435 2448 h48 h（4 4）糖發(fā)酵試驗：葡萄糖發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管：）糖發(fā)酵試驗：葡萄糖發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管： 大腸桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌普通變形桿菌 37 2437 2448 h48 h（5 5）硫化氫、甲基紅（）硫化氫、甲基紅（葡萄糖蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水）和伏普試驗）和伏普試驗（葡萄糖蛋白胨（葡萄糖蛋白胨水）水） ：大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌 37 48 h37 48 h各試驗結(jié)果判定：各試驗結(jié)果判定：（1 1）明膠水解試驗：）明膠水解試驗：明膠液化明膠液化 （），（）， 明膠不液化（）明膠不液化（）（2 2）石蕊牛奶試驗：）石蕊牛奶試驗： 酸性條件下粉