酵母雙雜交系統(tǒng)

1、酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）主講人：MrQiu主要從以下幾方面介紹主要從以下幾方面介紹酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) 概念 原理 優(yōu)點與缺點 應(yīng)用 優(yōu)化酵母雙雜交系統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)的概念 酵母雙雜交系統(tǒng)是一種建立在酵母菌基礎(chǔ)上的遺傳學(xué)分析方法，主要用于檢測蛋白間的相互作用及克隆與已知蛋白相關(guān)的未知新基因。在功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中起積極的促進作用。在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中，通過酵母雙雜交系統(tǒng)能較全面真實地反映細胞內(nèi)信號蛋白的網(wǎng)絡(luò)性聯(lián)系與調(diào)節(jié)。該法由Fields等人于1989年首次建立并得到廣泛地應(yīng)用。酵母雙雜交的原理 利用酵母作為真核蛋白相互作用的模型 利用

2、誘餌質(zhì)粒篩選文庫或者單個已知蛋白 通過報告基因的轉(zhuǎn)錄鑒定蛋白的相互作用 使用不同的培養(yǎng)基篩選陽性克隆 雙雜交系統(tǒng)的兩個重要元件：雙雜交系統(tǒng)的兩個重要元件： 轉(zhuǎn)錄激活因子：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain，簡稱為DB）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，簡稱為AD） 報道株：經(jīng)改造的、含報道基因的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞。 酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒；具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因；酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合。酵母雙雜交模型DNA-BindingDomainBait P

3、roteinPrey ProteinTranscriptionActivatingRegionReporter GeneDNA-Binding Site模型模型文庫篩選的步驟 將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結(jié)合域融合構(gòu)建誘餌質(zhì)粒 將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母 再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中 通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白序列分析 從酵母中分離質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化E.coli 從大腸桿菌中提取質(zhì)粒并測序 在數(shù)據(jù)庫中比對所測定序列與已知蛋白的同源性質(zhì)粒構(gòu)建 在Gal4（或其他合適的蛋白功能域）的DNA結(jié)合域前面的多克隆位點處插入待測基因序列構(gòu)建誘餌

4、質(zhì)粒 誘餌質(zhì)粒含有篩選基因，例如氨芐青霉素抗性基因，Leu2,Ura3,orTrp1等。 實例： 釀酒酵母的GAL4蛋白質(zhì)N-端和C-端分別融合的兩種蛋白質(zhì)相互作用可激活具有UAS（upstreamactivatingsequence，上游激活序列）報告基因的表達 i.GAL4蛋白質(zhì)是一個調(diào)控基因，控制半乳糖利用酶類基因的表達，這些基因的5-端存在UAS序列； ii.GAL4存在兩個結(jié)構(gòu)域：N-端(1-147)具有UAS-DNA結(jié)合域(DNA-bindingdomain,BD),C-端(768-881)具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionalactivationdomain,AD)。

5、二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開，仍具有各自的功能，而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄GAL 1 UASTranscriptionDNA-BDGAL 4GAL 4 ADPromoterGAL1GAL 1 UASTranscriptionProtein XDNA-BDProtein YGAL 4GAL 4 ADPromoterLacZ(or HIS3) reporter geneprotein YGAL4 AD GAL 4DNA-BDProtein X iii. 如果AD和BD分別與兩個基因編碼序列融合，且兩種蛋白質(zhì)能相互發(fā)生結(jié)合，就可導(dǎo)

6、致GAL1-LacZ基因的表達。其中與AD融合的基因稱之為釣餌基因，與BD融合的基因可稱之為目的基因(即建立的基因文庫)。 為了提高報告基因的表達活性，LacZ基因還可以與HIS3基因融合在一起，只有當(dāng)HIS3基因表達量足夠大時，轉(zhuǎn)化細胞才能在合成培養(yǎng)基上生長。2) 操作步驟構(gòu)建誘餌融合基因（AD） 轉(zhuǎn)化相應(yīng)的酵母菌株 在檢測平板上篩選構(gòu)建文庫（BD） 陽性菌落 提取質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 陽性克隆的進一步鑒定 B a i t p r o t e i nB 4 2 B DL i b r a r y p r o t e i nL e x AD N A - A DL e x A o p e r

7、a t o rP r o m o t e rT r a n s c t i p t i o nL E U 2 a n d L a c 2 r e p o r t e r g e n e sL e x A o p e r a t o rP r o m o t e rN o T r a n s c t i p t i o nL E U 2 a n d L a c 2 r e p o r t e r g e n e sB a i t p r o t e i nB 4 2 B DL e x AL i b r a r y p r o t e i nD N A - A DL e x A o p e r a

8、 t o rP r o m o t e rN o T r a n s c t i p t i o nL E U 2 a n d L a c 2 r e p o r t e r g e n e s酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點與缺點 優(yōu)點優(yōu)點 快速獲得相互作用蛋白的基因 只需單一步驟的質(zhì)粒構(gòu)建 在體內(nèi)鑒定蛋白的相互作用 高度敏感-弱小的，暫時的相互作用也能鑒定 能在整個時間段積聚弱小的相互作用信號 缺點缺點 首先，它并非對所有蛋白質(zhì)適用； 其次，假陽性的發(fā)生較為繁多； 再次，雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化，而且，酵母細胞的轉(zhuǎn)化效率比細菌要低約4個數(shù)量級。 最后，在某些酵母菌株中大量表達外源蛋白質(zhì)常會帶來毒

9、性作用，從而影響菌株生長及報告基因的表型。酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)作為一種高度敏感、適用于細胞核內(nèi)外以至于細胞內(nèi)外多種蛋白質(zhì)在體研究體系，雙雜交系統(tǒng)主要應(yīng)用于： 1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能。例：Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECHMATCHMARKERSYSTEM3為操作平臺，從成人腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1 2、利用酵母雙雜交在細胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用。例：來源于矮牽牛的黃烷

10、酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應(yīng)中，抗體的單鏈的三個可變區(qū)A4、G4、H3與抗原之間作用有強弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術(shù)，將黃烷酮醇還原酶DFR作為誘餌蛋白，編碼抗體的三個可變區(qū)的基因分別被克隆在AD-LIBRARY載體上，將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉(zhuǎn)化改造后的酵母菌株中，并檢測報告基因在克隆的菌落中的表達活性，從而在活細胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應(yīng)。 3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓撲異

11、構(gòu)酶NS3，以及細胞核轉(zhuǎn)運受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制，從而達到治療這種疾病的目的。 4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）例如：HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。酵母雙雜交系統(tǒng)方法的優(yōu)化酵母雙雜交系統(tǒng)方法的優(yōu)化(1)酵母接合型的引入:Bendixenetal通過酵母接合型的