實驗四 核酸的鑒定

1、DNADNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳實實 驗驗 二二學時：學時：3 31 1、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的、掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理和方法。原理和方法。2 2、學習核酸染色的方法。、學習核酸染色的方法。 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康模?（一）電泳技術(shù)：（一）電泳技術(shù)： 1 1、電泳定義：電泳定義：是指帶電粒子在電場中向與其自身是指帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。 根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同，可分為濾紙，醋酸纖維薄膜，根據(jù)電泳支持介質(zhì)的不同，可分為濾紙，醋酸纖維薄膜，淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳技術(shù)的應(yīng)用淀粉、瓊脂糖、

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。電泳技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛，從分離小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到非常廣泛，從分離小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到復(fù)雜的大分子如蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒顆粒的分離鑒定都復(fù)雜的大分子如蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒顆粒的分離鑒定都依賴于電泳技術(shù)。依賴于電泳技術(shù)。二、實驗原理二、實驗原理: （1 1）帶電顆粒的大小和形狀：）帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；越慢，反之越快；（2 2）顆粒的電荷數(shù)：）顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；之越快；（3 3） 溶液的粘度：溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之粘度越大

3、，電泳速度越慢，反之越快；越快；（4 4）溶液的）溶液的pHpH值：值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點越近，電泳速度越慢，反之越快；電點越近，電泳速度越慢，反之越快； 2 2、影響電泳的主要因素：影響電泳的主要因素： （5 5）電場強度：）電場強度：電場強度越小，電泳速度越慢，反電場強度越小，電泳速度越慢，反之越快；之越快；（6 6）離子強度：）離子強度：離子強度越大，電泳速度越慢，反離子強度越大，電泳速度越慢，反之越快；之越快；（7 7）電滲現(xiàn)象：）電滲現(xiàn)象：電場中，液體相對于固體支持物的電場中，液體相對于固體支持物的相對移動；相對移動；（8 8）支持物篩孔大小

4、：）支持物篩孔大小：孔徑小，電泳速度慢，反之孔徑小，電泳速度慢，反之則快。則快。l瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳是用電泳是用瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法，是一種簡便、快速分離鑒定核酸的方法，已泳分離方法，是一種簡便、快速分離鑒定核酸的方法，已成為分子生物學及基因工程研究中常用實驗方法之一。成為分子生物學及基因工程研究中常用實驗方法之一。l瓊脂糖瓊脂糖英文名英文名agarose，是從，是從瓊脂瓊脂中提取出來的，由中提取出來的，由半半乳糖乳糖和和3.6-3.6-脫水脫水- - 半乳糖半乳糖相互結(jié)合的相互結(jié)合的鏈狀多糖鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂糖和瓊脂瓊脂都可在不同濃

5、度的水溶液下可形成都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠多孔的凝膠，電泳，電泳中具有中具有分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：lDNADNA分子分子在在pH高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動（中向正極移動（電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)） 。lDNA分子泳動速率的大小除與分子泳動速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)分子的帶電量有關(guān)外，還與外，還與DNA分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠的的分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)）。）。l電泳時，用電泳時，用溴酚藍溴酚藍做前沿指示劑

6、，指示做前沿指示劑，指示DNA樣品在凝樣品在凝膠中的確切位置。膠中的確切位置。l溴乙啶溴乙啶是一種熒光染料，可插入是一種熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個堿基對之間，與個堿基對之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。這次實驗使用發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。這次實驗使用溴乙啶替代品溴乙啶替代品（DNAgreen）DNAgreen核酸染料vDNAgreen是一種花箐類染料，具有安全、靈敏作為各種核酸電泳的染色劑。vDNAgreen最大吸收峰在510nm左右，另外在254-380nm還有一個吸收峰，與核酸結(jié)合后發(fā)射綠色熒光，因此在紫外凝

7、膠透射儀上可以檢測出DNA樣品。v作為EB的一種替代品。（1）核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 凝膠中，凝膠中，DNA片段遷移率與片段遷移率與DNA分子大小成反比分子大小成反比( 20kb) ，因此通，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。測出未知片段的大小。（2）核酸構(gòu)象與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系核酸構(gòu)象與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 不同構(gòu)型不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：閉環(huán)的移動速度次序為：閉環(huán)DNA直線直線DNA開環(huán)的雙鏈開環(huán)的雙鏈環(huán)狀環(huán)狀D

8、NA(當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀當瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA不能進入膠中不能進入膠中)。（3）不同大小的不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。分離。瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度/%/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線狀線狀DNADNA大小大小/kb/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：注：DNADNA片段在片段在5-500bp5-500bp之間時，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳之間時，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）進行電泳分離。）進行電泳分離。（三）瓊脂糖凝膠電泳

9、分離核酸的影響因素（三）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素（1 1）操作簡單、制備容易快速、凝膠機械性能好、電泳速度）操作簡單、制備容易快速、凝膠機械性能好、電泳速度快、分離快、分離DNADNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進行電泳。片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進行電泳。（2 2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。高，重復(fù)性好。（3 3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光檢測及定量測定。光檢測及定量測定。（4 4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫

10、，便于定量測定。制）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。成干膜可長期保存。因此，因此，瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學及基因工程研電泳已成為分子生物學及基因工程研究中常用實驗方法之一，究中常用實驗方法之一， DNADNA樣本的分離、純化、鑒定以及樣本的分離、純化、鑒定以及相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。相對分子質(zhì)量測定常用瓊脂糖凝膠電泳。（四）（四）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點：電泳具有以下優(yōu)點：DNA Marker 熒光染料熒光染料EB染色染色后，在紫外燈后，在紫外燈(305nm)下觀察下觀察到的電泳結(jié)果：到的電泳結(jié)果：1 1、實驗材料：、實

11、驗材料：提取的小麥苗中的提取的小麥苗中的DNADNA2 2、儀器：、儀器： (1)(1)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (2)(2)可調(diào)微量移液器可調(diào)微量移液器 (3)(3)水平電泳槽水平電泳槽 （4 4）暗箱紫外透射儀等。）暗箱紫外透射儀等。3 3、試劑：、試劑：（1 1）電泳緩沖液：）電泳緩沖液：TrisTris- -硼酸EDTAEDTA（5050TBETBE）pH8.3pH8.3。（2 2）加樣緩沖液：）加樣緩沖液：0.25%0.25%溴酚藍（溴酚藍（BPBBPB），），40%40%蔗糖，蔗糖，DNAgreenDNAgreen。 (4)(4)瓊脂糖凝膠：瓊脂糖凝膠：濃度為濃度為0.7%0.

12、7%。 三、實驗材料、儀器和試劑三、實驗材料、儀器和試劑：1 1、凝膠板的制備：、凝膠板的制備：（1 1）取瓊脂糖）取瓊脂糖0.7 g0.7 g，加，加1 1TBETBE緩沖溶液緩沖溶液100ml100ml，于沸水浴中至熔化，制，于沸水浴中至熔化，制成成0.7%0.7%的瓊脂糖膠液。的瓊脂糖膠液。（2 2）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成）膠床兩頭貼上防水膠帶，形成8mm8mm高的擋墻，壓緊膠帶，置水平臺面高的擋墻，壓緊膠帶，置水平臺面上。上。（3 3）插入梳子，梳齒下端離板底插入梳子，梳齒下端離板底0.50.51mm1mm。（4 4）當瓊脂糖膠液溫度降到）當瓊脂糖膠液溫度降到6060的時候的時候,

13、 ,將將6060凝膠不間斷倒入膠床，高凝膠不間斷倒入膠床，高3 34mm4mm，避免產(chǎn)生氣泡，室溫下凝固。，避免產(chǎn)生氣泡，室溫下凝固。（5 5）完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠完全凝固后，撕掉膠帶，置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，高于膠面面1 12mm2mm，從一頭輕輕斜拉，從一頭輕輕斜拉 梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。梳子，除去產(chǎn)生的氣泡。四、實驗步驟：四、實驗步驟： 3 3、加樣：、加樣： 將樣品將樣品DNADNA溶液與加樣緩沖液以溶液與加樣緩沖液以5 5 ：1 1的體積比混合，用的體積比混合，用微量進樣器加樣，每加完一個樣品，沖洗三次。加樣量微量進樣器加樣，每加完一個樣品

14、，沖洗三次。加樣量151520 20 l l （加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝（加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部）。膠底部）。4 4、電泳：、電泳： 為了獲得電泳分離為了獲得電泳分離DNADNA片段的最大分辨率，電場強度不片段的最大分辨率，電場強度不應(yīng)高于應(yīng)高于5V/cm5V/cm（兩電極間的距離）開始時用較高電壓（兩電極間的距離）開始時用較高電壓(80V)(80V)，樣品一進入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至樣品一進入膠內(nèi)則將電壓調(diào)至5V/cm 5V/cm 。當染料前沿移至底邊。當染料前沿移至底邊1-2mm1-2mm時，電泳畢。時，電泳畢。5 5、染色、觀察、顯微照相與記錄、

15、染色、觀察、顯微照相與記錄： 關(guān)閉電源，取出膠床，浸入關(guān)閉電源，取出膠床，浸入0.5g/mL0.5g/mL的的EBEB溶液中，溶液中，30min30min后取出。在紫外檢測儀下觀察凝膠中的后取出。在紫外檢測儀下觀察凝膠中的DNADNA（紅橙色熒（紅橙色熒光），并進行顯微照相。最后要求繪制光），并進行顯微照相。最后要求繪制DNADNA電泳圖譜。電泳圖譜。五、思考題：五、思考題：影響電泳的主要因素影響電泳的主要因素? ? * * 熒光染料熒光染料EBEB染色的原理和優(yōu)點是什么？染色的原理和優(yōu)點是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-

16、苯基菲錠溴鹽苯基菲錠溴鹽(Ethidium Bromide)(Ethidium Bromide)。 EBEB是一種扁平分子，它可以嵌是一種扁平分子，它可以嵌入核酸相鄰的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙入核酸相鄰的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。它與色熒光。它與DNADNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。 溴化乙錠嵌入堿基分子中，導(dǎo)致溴化乙錠嵌入堿基分子中，導(dǎo)致DNA在復(fù)制過程中錯配在復(fù)制過程中錯配 。所以所以溴化乙錠是一種強誘變劑，溴化乙錠是一種強誘變劑，具有高致癌性具有高致癌性。在實驗過程。在實驗過程一定要帶上手套！一定要帶上手套！ 2 2、優(yōu)點：、優(yōu)

17、點：（1 1）染色比較簡便、快捷，一般在）染色比較簡便、快捷，一般在101015min15min就可反應(yīng)。就可反應(yīng)。（2 2）EBEB對核酸分子無破壞作用，這是其它染料所不能做對核酸分子無破壞作用，這是其它染料所不能做 到的。到的。（3 3）EBEB靈敏度高，可檢測出靈敏度高，可檢測出10ng10ng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。（4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的檢測。的檢測。（5 5）EBEB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時用紫外可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時用紫外 燈檢測電泳的進程和效果。燈檢測電泳的進程和效果。（6 6）EB-DNAEB-DNA復(fù)合物中的復(fù)合物中的EBEB發(fā)出的熒光比游離的發(fā)出的熒光比游離的EBEB強強1010倍，倍， 因此不需洗凈凝膠中游離的因此不需洗凈凝膠中游離的EBEB也可檢測出也可檢測出DNADNA的條帶。的條帶。3 3、缺點：、缺點： 溴乙啶是一種強的致突變劑，在操作和配制試劑時溴乙啶是一種強的致突變劑，在操作和配制試劑時應(yīng)戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道