高效液相發(fā)色譜使用常見問題解決方法

1、高效液相色譜使用常見問題癥狀：（一）保留時(shí)間變化可能的原因:解決方法1. 柱溫變化:柱恒溫2. 等度與梯度間未能充分平衡:至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱3. 緩沖液容量不夠:用>25mmol/L的緩沖液4. 柱污染:每天沖洗柱5. 柱內(nèi)條件變化:穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相6. 柱快達(dá)到壽命:采用保護(hù)柱（二）保留時(shí)間縮短可能的原因:解決方法1. 流速增加:檢查泵,重新設(shè)定流速2. 樣品超載:降低樣品量3. 鍵合相流失:流動(dòng)相PH值保持在37.5檢查柱的方向4. 流動(dòng)相組成變化:防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5. 溫度增加:柱恒溫（三）保留時(shí)間延長(zhǎng)可能的原因:解決方法1. 流速下降:管路泄漏,更換泵密

2、封圈,排除泵內(nèi)氣泡2. 硅膠柱上活性點(diǎn)變化:用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3. 鍵合相流失:同前（二）34. 流動(dòng)相組成變化:同前（二）45. 溫度降低:同前（二）5（四）出現(xiàn)肩峰或分叉可能的原因:解決方法1. 樣品體積過大:用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2. 樣品溶劑過強(qiáng):采用較弱的樣品溶劑3. 柱塌陷或形成短路通道:更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4. 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效:更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5. 進(jìn)樣器損壞:更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子（五）鬼峰可能的原因:解決方法1. 進(jìn)樣閥殘余峰:每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗2. 樣品中未知物:處理樣品3.

3、 柱未平衡:重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜）4?三氟乙酸（TFA）氧化（肽譜）：每天新配，用抗氧化劑5.水污染（反相）:通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水（六）基線噪聲可能的原因：解決方法1.氣泡（尖銳峰）：流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓2?污染（隨機(jī)噪聲）：清洗柱，凈化樣品，用HPLC級(jí)試劑3. 檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲：更換氘燈4. 電干擾（偶然噪聲）:采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來(lái)源（如水浴等）5. 檢測(cè)器中有氣泡:流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓（七）峰拖尾可能的原因:解決方法1. 柱超載:降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相2. 峰干擾:清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相3. 硅羥基作用加三乙

4、胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品4. 同前（四）4:同前（四）45. 同前（四）35.:同前（四）36. 死體積或柱外體積過大:連接點(diǎn)降至最低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7. 柱效下降:用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱（八）峰展寬可能的原因:解決方法1. 進(jìn)樣體積過大:同（四）12. 在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展:進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散3. 數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)4. 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過大:設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%5. 流動(dòng)相粘度過高:增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相6. 檢測(cè)池體積過大:用小體積池,卸下熱交換器

5、7. 保留時(shí)間過長(zhǎng):等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫8. 柱外體積過大:將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小9. 樣品過載:進(jìn)小濃度小體積樣品液相色譜常見問題及處理方法HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法1、樣品量不足，解決辦法為增加樣品量2、樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子3、樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器4、檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可。5、檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)6、檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。7、檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣。8、記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。9、流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。10、

6、檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。為什么HPLC柱柱壓過高柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1 、拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；2 、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；3、將柱子的進(jìn)出口反過來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；4 、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些

7、雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？1 、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2 、存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子如何解決HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間發(fā)生漂移或急速變化漂移現(xiàn)象1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2、流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3、柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡快

8、速變化現(xiàn)象1. 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3、流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合HPLC儀器問題1 、我的HPLC泵壓明顯的偏高，請(qǐng)問可能的原因？答：流速設(shè)定過高；流動(dòng)相或進(jìn)樣中有機(jī)械雜質(zhì)，造成保護(hù)柱、柱前篩板或在線過濾器阻塞；流動(dòng)相粘度過大；柱溫過低；緩沖鹽結(jié)晶；壓力傳感器故障。2 、基線不穩(wěn)，上下波動(dòng)或漂移的原因是什么，如何解決？答：a.流動(dòng)相有溶解氣體；用超聲波脫氣15-30分鐘或用充氨氣脫氣b. 單向閥堵塞；取下單向閥，用超聲波在純水中超20分鐘左右,去處堵塞物c. 泵密圭寸損壞，造成壓

9、力波動(dòng)；更換泵密圭寸d. 系統(tǒng)存在漏液點(diǎn)；確定漏液位置并維修f. 柱后產(chǎn)生氣泡；流通池出液口加負(fù)壓調(diào)整器g. 檢測(cè)器沒有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處；將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處h. 柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)；用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。3 、接頭處為何經(jīng)常漏液，如何處理？答：接頭沒有擰緊；擰松后再緊，手緊接頭以手勁為限，不要使用工具，不銹鋼接頭先用手?jǐn)Q緊，再用專用扳手緊1/4-1/2圈，注意接頭中的管路一定要通到底，否則會(huì)留下死體積。接頭被污染或磨損；建議更換接頭。接頭不匹配，建議使用同一品牌的配件。4 、進(jìn)樣閥漏液是如何造成的？

10、答：a.轉(zhuǎn)子密封損壞；更換轉(zhuǎn)子密封b. 定量環(huán)阻塞；清洗或更換定量環(huán)c. 進(jìn)樣口密封松動(dòng)；調(diào)整松緊度d. 進(jìn)樣針頭尺寸不合適，一般是過短；使用恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣針（注意針頭形狀）e. 廢液管中產(chǎn)生虹吸；清空廢液管譜圖問題1、問：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？答：a.篩板阻塞；反沖色譜柱、更換進(jìn)口篩板b. 色譜柱塌陷；填充色譜柱c. 有干擾物質(zhì)的存在；使用更長(zhǎng)的色譜柱、改變流動(dòng)相或更換色譜柱e. 流動(dòng)相PH值不合適；調(diào)整PH值，對(duì)于堿性化合物，低PH值更有利于得到對(duì)稱峰f. 樣品與填料表面的溶化點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)；加入離子對(duì)試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑或更改色譜柱2 、問：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？答：保

11、護(hù)柱或分析柱污染；取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析。如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞，拆下來(lái)清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧Ｈ绻麊栴}仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。樣品溶劑不溶于流動(dòng)相；改變樣品溶劑，如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。3 、問：K值增加時(shí)，拖尾更嚴(yán)重，這是為什么？答：反相模式，二級(jí)保留效應(yīng)；a.加入三乙胺（或堿性樣品）b加入乙酸（或酸性樣品）c.加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品）d.更換一支柱子4 、問：保留時(shí)間的波動(dòng)有幾種可能的原因？答：溫控不當(dāng)；調(diào)節(jié)好柱溫。流動(dòng)相組分變化；防止流動(dòng)相蒸發(fā)、反應(yīng)等，做梯度時(shí)尤其要注意流動(dòng)相混合的均勻。色

12、譜柱沒有平衡；在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱。1.色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎？不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因

13、揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤(rùn)填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤(rùn)，恢復(fù)到正常狀態(tài)。2.使用PEEK（polyetheretherketone管路和接頭需要注意什么問題？如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無(wú)需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍

14、之外的管路長(zhǎng)度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會(huì)變脆。另一個(gè)西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過3000psi）。使用PEEK接頭時(shí)則無(wú)需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。3. 如何預(yù)防液相泵的故障要保持泵的良好操作性能,必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項(xiàng)措施:1 ）.用高質(zhì)量試劑和HPLC級(jí)溶劑；2）、過