微生物鑒定常用的生理生化試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、WORD格式*大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2021年12月 4日_科目：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目：微生物鑒定常用的生理生化試驗(yàn)*：丁志康一、 目的要求1. 證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2. 掌握進(jìn)展微生物大分子水解試驗(yàn)的原理和方法。3. 了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用。4. 掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。5. 了解 IMViC 反響的原理及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。二、 根本原理1、生物對(duì)大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。 胞外酶只要為水解酶， 通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合

2、物， 使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。 如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、 雙糖和單糖； 脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等。 這些過程均可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實(shí)；淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，但細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測(cè)定不在產(chǎn)生藍(lán)色，說明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的 pH，使 pH降低，參加培養(yǎng)基的中性紅指示劑會(huì)使培養(yǎng)基從淡紅色變成深紅色，說明胞外存在著脂肪酶。2、糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反響，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源， 但是它們?cè)诜纸馓穷愇镔|(zhì)的能力上有很大的差異。 有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸 如

3、乳糖、醋酸、丙酸等和氣體如氫氣、甲烷、二氧化碳的等；有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。 例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣； 傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。發(fā)酵培養(yǎng)基含有蛋白胨，指示劑溴甲酚紫 ，倒置的德漢氏小管和不同的糖類。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，溴甲酚紫指示劑可由紫色 pH6.8變?yōu)辄S色 pH5.2。氣體的產(chǎn)生可由倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。3、IMViC 反響是吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、伏 - 普試驗(yàn)和檸檬酸試驗(yàn) 4 個(gè)試驗(yàn)的首字母縮寫。這四個(gè)實(shí)驗(yàn)主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌，多用于水的細(xì)菌檢查。 1吲哚試驗(yàn)：某些細(xì)菌有色氨酸酶，能分

4、解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚靛基質(zhì) ，吲哚能與對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈紅色。（ 2甲基紅試驗(yàn)：某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被分解成為甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培養(yǎng)基 pH 下降至 4.5 以下，參加甲基紅指示劑可呈紅色。如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)如醇、醛、酮、氣體和水，培養(yǎng)基 pH在 5.4 以上，參加甲基紅指示劑呈橘黃色。本試驗(yàn)常與 V-P 試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢叱赎栃缘募?xì)菌，后者通常為陰性。（ 3伏- 普二乙酰試驗(yàn)：某些細(xì)菌能發(fā)生如下轉(zhuǎn)換：葡萄糖丙酮酸脫羧乙酰甲基甲醇 2，3丁烯二醇，在有堿存在時(shí)氧化成二乙酰， 后者和胨

5、中的胍基化合物起作用產(chǎn)生粉專業(yè)資料整理WORD格式紅色的化合物。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟跍y(cè)定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力。（ 4檸檬酸試驗(yàn)：當(dāng)細(xì)菌利用銨鹽作為唯一氮源，并利用檸檬酸鹽作為唯一碳源時(shí)，假設(shè)細(xì)菌能利用這些鹽作為氮源和碳源而生長， 那么能利用檸檬酸鈉產(chǎn)生碳酸鹽， 從而與利用銨鹽產(chǎn)生的氨反響，形成 NH4OH，使培養(yǎng)基呈堿性，使指示劑溴麝香草酚藍(lán) BTB由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)。三、器材1. 菌種 : 枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌，銅綠假單胞菌，普通變形桿菌，金黃色葡萄球菌。2. 培養(yǎng)基 : 固體淀粉培養(yǎng)基，蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。3. 溶液或試劑 : 革

6、蘭氏染色用盧戈氏碘液，甲基紅試劑， V.P. 試劑，吲哚試劑。4. 儀器或其他用具 : 無菌平板，無菌試管，接種環(huán)，接種針，試管架，酒精燈，小玻璃管。四、 操作步驟一淀粉水解試驗(yàn)(1) 將固體淀粉培養(yǎng)基融化后冷卻至 50左右，無菌操作制成平板。(2) 用記號(hào)筆在平板底部劃成四局部。(3) 將枯草芽孢桿菌， 大腸桿菌，金黃色葡萄球菌， 銅綠假單細(xì)胞菌分別在不同的局部點(diǎn)點(diǎn)接種，在平板的反面分別在四局部寫上菌名。(4) 將平板倒置在 37溫箱中培養(yǎng) 24h。(5) 觀察各種細(xì)菌的生長情況， 將平板翻開蓋子， 滴入少量盧戈氏碘液于平皿中， 輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈

7、，說明淀粉已被水解，為陽性。透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉酶能力的強(qiáng)弱，即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的上下。二糖發(fā)酵試驗(yàn)1. 用記號(hào)筆在各試管外壁上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的細(xì)菌菌名。2. 取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管 3 支，同樣分別接入大腸桿菌， 普通變形桿菌，第三支不接種，作為對(duì)照。在接種后，輕緩搖動(dòng)試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。3. 將接種過和作為對(duì)照的 6 支試管均置 37培養(yǎng) 2448h。4. 觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。三 IMViC 試驗(yàn) 1 接種與培養(yǎng)用接種環(huán)分別取一些大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的菌種，接入五只葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中以及三只蛋白胨水培養(yǎng)基中，分別貼

8、上標(biāo)簽注明培養(yǎng)基名稱以及菌種名稱，放入37培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48h。 2 結(jié)果觀察1、吲哚試驗(yàn)：于培養(yǎng)48 小時(shí)后的蛋白胨水培養(yǎng)基中滴入34 滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置一分鐘，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐參加2 滴吲哚試劑。在乙醚與培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性。專業(yè)資料整理WORD格式2、甲基紅試驗(yàn)：培養(yǎng)48 小時(shí)后，向一只葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)參加甲基紅試劑2 滴，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。注意甲基紅不要假的太多，以免出現(xiàn)假陽性。3、伏 - 普試驗(yàn)：培養(yǎng) 48 小時(shí)后，向另外兩只葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)參加510 滴 40%KOH，然后參加等量的 5%的- 萘酚試劑，用力震蕩，再放入

9、37恒溫箱中保溫 1530 分鐘，以加快反響速度，假設(shè)培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色那么為陽性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果一淀粉水解試驗(yàn)左上為枯草芽孢桿菌；左下為產(chǎn)氣桿菌；右上為大腸桿菌；右下為銅綠色假單胞菌 * 因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌菌量剩余少，所以實(shí)驗(yàn)中菌余用量大的產(chǎn)氣桿菌替代專業(yè)資料整理WORD格式觀察結(jié)果如下：觀察者：丁志康專業(yè)資料整理WORD格式菌種枯草芽孢桿菌大腸桿菌銅綠色假單胞菌產(chǎn)氣桿菌專業(yè)資料整理WORD格式淀粉水解效果+專業(yè)資料整理WORD格式+表示陽性，即產(chǎn)胞外淀粉酶；+數(shù)量表示透明圈大小，+越多透明圈越大二糖發(fā)酵試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下列圖：左邊三支試管分別是乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基接種大腸桿菌、變形桿菌、空白對(duì)照。右邊三

10、支試管分別是葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基接種大腸桿菌、變形桿菌、空白對(duì)照。專業(yè)資料整理WORD格式觀察結(jié)果如下：菌種葡萄糖+乳糖+觀察者：丁志康大腸桿菌普通變形桿菌對(duì)照+-+-專業(yè)資料整理WORD格式（ +表示陽性， - 表示陰性；第一個(gè)格子代表是否產(chǎn)酸，第二個(gè)格子代表是否產(chǎn)氣三 IMViC 試驗(yàn)圖一圖二圖三1、圖一中左一為大腸桿菌，左二為產(chǎn)氣桿菌，左三為對(duì)照。2、圖二中左一為產(chǎn)氣桿菌淺橙色 ，右一為大腸桿菌淡紫紅色 ，中間為對(duì)照淺黃色。3、圖三中左為大腸桿菌，右為產(chǎn)氣桿菌。觀察結(jié)果匯總?cè)缦拢河^察者：丁志康菌種吲哚試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)V.P. 試驗(yàn)大腸桿菌+-產(chǎn)氣桿菌-+對(duì)照-+表示陽性， - 表示陰性甲基紅試

11、驗(yàn)中產(chǎn)氣桿菌所在試管呈淡橙色，比對(duì)照組顏色略深，但遠(yuǎn)比大腸桿菌淺，記作陰性。專業(yè)資料整理WORD格式六、思考題(1) 你怎么樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？答：淀粉酶是大分子物質(zhì)，無法通過跨膜運(yùn)輸進(jìn)入胞內(nèi)，所以消化淀粉的酶應(yīng)當(dāng)是由細(xì)胞分泌進(jìn)入外界環(huán)境中，在胞外對(duì)淀粉進(jìn)展水解，之后細(xì)胞再將消化處理后的小分子物質(zhì)運(yùn)輸進(jìn)胞內(nèi)進(jìn)展利用。(2) 不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？答：淀粉是葡萄糖的多聚體，在被淀粉酶水解過程中極有可能水解產(chǎn)生葡萄糖，而葡萄糖又是復(fù)原性糖，故可以嘗試通過檢測(cè)復(fù)原性糖的方式 如斐林試劑來驗(yàn)證是否有淀粉酶存在。(3) 假設(shè)某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)

12、果？答：試管中培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，小玻璃管中出現(xiàn)氣泡。(4) 討論 IMViC 試驗(yàn)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上的意義。答： IMViC 試驗(yàn)可以非?？旖莸罔b別出待測(cè)細(xì)菌的一些信息，從而可以結(jié)合伯杰氏手冊(cè)對(duì)待測(cè)菌進(jìn)展初步的鑒定，再結(jié)合革蘭氏染色有時(shí)甚至可以做到對(duì)待測(cè)菌進(jìn)展定科或定屬的研究，這十分有利于細(xì)菌導(dǎo)致的傳染病的臨床治療。此外，IMViC 試驗(yàn)還可以快速地鑒別出大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，這兩種菌廣泛存在于自然界，常被作為水源糞便污染的標(biāo)志，所以IMViC試驗(yàn)也可廣泛應(yīng)用于飲用水的檢測(cè)之中。七、 附實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基配方1、淀粉培養(yǎng)基蛋白胨 10gNaCl5g牛肉膏 5g可溶性淀粉 2g瓊脂 1520g蒸餾水 1000mL121滅菌 20min。2、蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨10gNaCl5g蒸餾水1000mLpH7.6121滅菌 20min。3、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨5g葡萄糖5g磷酸氫二鉀2g專業(yè)資料整理WORD格式蒸餾水1000mL將上述各成分溶于 1000mL水中，調(diào) pH 7.07.2，過濾。分裝試管，每管 10mL,121滅菌 30min。4、糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基1000mL1.6%溴甲酚紫乙醇溶液12mLpH7.6另配 20%糖溶液葡萄糖以及乳糖各10mL。制法：1、將上述含指示劑的蛋白胨水培養(yǎng)基