2022年醫(yī)學專題—PNH-陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細胞術(shù)檢測解讀

1、李智偉第一頁，共三十七頁。PNH(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) 是一種罕見的獲得性克隆造血干細胞疾是一種罕見的獲得性克隆造血干細胞疾病。但近年來有增多趨勢。我國北方多于南病。但近年來有增多趨勢。我國北方多于南方。半數(shù)以上發(fā)生在方。半數(shù)以上發(fā)生在20-4020-40歲青壯年。男性歲青壯年。男性多于女性，與遺傳及種族無關(guān)。本病起病隱多于女性，與遺傳及種族無關(guān)。本病起病隱襲緩慢，呈慢性襲緩慢，呈慢性(mn xng)(mn xng)過程，以貧血、出血過程，以貧血、出血為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者較為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者較少。少。第二頁，

2、共三十七頁。第三頁，共三十七頁。血紅蛋白(xuhng dnbi)尿 睡眠有關(guān)(yugun)，早晨較重，下午較輕 尿液外觀為醬油或紅葡萄酒樣;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、發(fā)熱等 第四頁，共三十七頁。原因(yunyn)因為補體作用最適宜的pH是6.87.O，而睡眠時呼吸中樞敏感性降低，酸性(sun xn)代謝產(chǎn)物積聚 第五頁，共三十七頁。第六頁，共三十七頁。研究(ynji)歷史 Strubing第一次報道(bodo)PNH Ham 和Dingle 證明了PNH 患者的紅細胞在血清酸化條件下，易發(fā)生溶血，這就是現(xiàn)在普遍使用的Ham 實驗1983年證實PNH患者GPI合成異常1993年pig-a基因突變

3、第七頁，共三十七頁。流式細胞術(shù) 原理：X染色體上PIG-A（造血干細胞經(jīng)獲得性體細胞基因）突變導致(dozh)糖化肌醇磷脂(GPI)錨合成障礙 導致由GPI錨接在細胞膜上的一組膜蛋白丟失，包括CD16、CD55、CD59等第八頁，共三十七頁。第九頁，共三十七頁。GPI錨連接蛋白 補體調(diào)接蛋白(dnbi) 衰變加速因子(DAF或CD55)、膜攻擊復合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、補體C8結(jié)合蛋白(HRF或C8bp)、膜輔助蛋白(MCP)。粘附分子 淋巴細胞功能相關(guān)抗原-3(LFA-3或CD58)、 Blast-1/ CD48、CD67、CD66。第十頁，共三十七頁。GPI錨連接蛋

4、白 酶類 紅細胞乙酰膽堿脂酶 ( AchE )、中性粒細胞堿性磷酶酸酶 ( NAP )、5外核酸酶 ( CD 73 )。受體類 中性粒細胞III型Fc受體 ( FcRIIIb 或CD16 )、單核細胞分化抗原 ( CD14 )、尿激酶型纖溶酶原激活物受體 ( u-PAR )。血型抗原(kngyun) CD55 攜帶的Comer抗原、AchE攜帶的 Yt抗原。 第十一頁，共三十七頁。1型細胞 CD59完全(wnqun)陽性第十二頁，共三十七頁。補體激活(j hu)途徑 C1 C1C2,C4 C4b2b (C3轉(zhuǎn)化酶） C3 C3b P （備解素） PC3bBb C3bB (C5轉(zhuǎn)化酶）C4b2b

5、3b或PC3bBb C8 C9 C6C7C5 C5b C5b678 C5b-9 (MAC)CD59替代(tdi)途徑經(jīng)典(jngdin)途徑CD55Ag-Ab第十三頁，共三十七頁。分析(fnx)1.紅系及粒系FSC/SSC設(shè)門報告(bogo)標本中CD55、CD59陰性比例第十四頁，共三十七頁。做2030份正常人血樣劃定(hu dn)陽性區(qū)（區(qū)）范圍同型陰性對照界定區(qū)范圍，中間的區(qū)域即為區(qū)。第十五頁，共三十七頁。第十六頁，共三十七頁。根據(jù)CD59可以將PNH細胞分為3型1型細胞 CD59完全陽性(yngxng) 正常細胞2型細胞 CD59部分陽性 補體中度敏感細胞3型細胞 CD59完全陰性 補

6、體敏感細胞第十七頁，共三十七頁。第十八頁，共三十七頁。第十九頁，共三十七頁。第二十頁，共三十七頁。CD55和CD59同時部分或完全缺失(qu sh)是PNH的典型表現(xiàn)，單GPI缺失不能確診。CD59重要性大于CD55單CD55缺乏時并不因此改變紅細胞對補體的敏感性而造成溶血CD59的缺失會增加補體的敏感性臨床上以CD59缺失作為診斷標準是一個趨勢。解決了一切以補體溶血為基礎(chǔ)的實驗診斷方法在診斷PNH的不確定性意義意義(yy)第二十一頁，共三十七頁。其它(qt)細胞的PNH檢測PNH患者的紅細胞、粒細胞、單核細胞及淋巴細胞上GPI錨連膜蛋白部分或全部喪失(sngsh)。粒細胞單核細胞淋巴細胞紅細

7、胞骨髓PNH克隆出現(xiàn)比外周血早，網(wǎng)織紅細胞略早于紅細胞第二十二頁，共三十七頁。其它細胞(xbo)的PNH檢測應(yīng)用FSC/SSC設(shè)門分析時會有許多脫顆粒的中性粒細胞，這時只使用物理特征無法準確設(shè)定粒細胞門了，這時必須使用系列標志/SSC設(shè)門:CD15，CD33 。 CD64設(shè)門，分析單核CD14,CD55,CD59，PNH病人檢測GPI缺乏(quf)的血小板不容易分辨不能只根據(jù)淋巴細胞上GPI相關(guān)蛋白的表達來診斷。 第二十三頁，共三十七頁。與其他實驗(shyn)比較 1.酸溶血(rn xu)試驗(Ham試驗) 患者紅細胞與含5%鹽酸的正常同型血清混合，pH6.4，37孵育2小時，溶血明顯。本試驗

8、特異性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血試驗蛇毒因子能通過補體交替途徑，使補體敏感的紅細胞發(fā)生溶血。本試驗特異性強，敏感性優(yōu)于酸溶血試驗。3.熱溶血試驗和蔗糖溶血試驗 因特異性差，常作為篩選方法。第二十四頁，共三十七頁。具有(jyu)PNH克隆的血液病 檢測(jin c)粒細胞GPI 錨連蛋白表達 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù)( % ) AA 115 25 ( 22 % ) MDS 39 9 ( 23% )并發(fā)現(xiàn) MDS有 PNH表達者 ATG（人胸腺細胞免疫球人胸腺細胞免疫球蛋白）蛋白）治療有效 ( An Intern Med 1999，131: 401 ) 第二十五頁，共三十七頁。PNH和AA關(guān)系

9、(gun x) 相當密切，可以相互轉(zhuǎn)化(zhunhu)且并存AAPNH較多(15%)，PNHAA少 20%30% PNH可伴骨髓再障 AA(ATG治療后)PNH 1031% AA-PNH綜合征 16.5%(我國) 50%AA外周血或骨髓可檢出PNH克隆AAPNH 生存率要高于PNHAAMDS-RA 如撿出PNH克隆者預(yù)后好，且ATG(人胸腺細人胸腺細胞免疫球蛋白胞免疫球蛋白) )治療有效。PNH對AA和MDS的“自然治療”，而“AA救了PNH” 。第二十六頁，共三十七頁。PNH 克隆見于(jiny)淋巴增殖性疾病 檢測(jin c)病種 例數(shù) NHL 87 HD 55 紅細胞 CD55/CD5

10、9 CLL 49 缺失檢出率 9.2% ALL 22 HCL 4 (Hematol J 2001，2: 33) 第二十七頁，共三十七頁。PNH克隆(k ln)見于漿細胞病 檢測紅細胞 CD55/CD59 缺失(qu sh) 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù) (%) MM 62 6 WM 7 2 MGUS 6 1 HCD 2 1 合計 77 10 (12.9%) (Int J Hematol 2002, 75 :40)第二十八頁，共三十七頁。FLAER嗜水氣單胞菌溶素變異體(FLAER)。1998年Diep等報道嗜水氣單胞菌(HEC)毒素能特異地與細胞膜上GPI錨連蛋白結(jié)合，隨后立即聚合成多具體，插入細

11、胞膜脂質(zhì)雙層，在膜上形成孔洞致溶破。PNH細胞缺乏GPI蛋白而抵抗(dkng)毒素保持細胞完好。第二十九頁，共三十七頁。FLAERFLAER在所有具有GPI錨連蛋白的白細胞上都有特異性表達，所以正常人及非PNH貧血FLAER成100%陽性。是目前診斷PNH最敏感、特異的方法。FLAER對PNH克隆檢出的敏感性為0.1%，其它(qt)靶向標記檢出率的敏感性為1%；第三十頁，共三十七頁。結(jié)果(ji gu)分析1.設(shè)門 CD45/SSC2.標記CD15，CD14，CD45，F(xiàn)LAER檢測(jin c)PNH粒、單核及淋巴細胞，報告標本中各系細胞FLAER陰性比例第三十一頁，共三十七頁。第三十二頁，共

12、三十七頁。第三十三頁，共三十七頁。FLAER目前FLAER一般用于有核細胞的檢測，不能評價紅細胞的PNH克隆。由于紅細胞表面沒有氣單胞菌溶素前體產(chǎn)生所需要的蛋白(dnbi)水解酶類，盡管表達在紅細胞表面的血型糖蛋白(dnbi)不是錨連蛋白(dnbi)，但是由于血型糖蛋白(dnbi)與氣單胞菌溶素前體結(jié)合力較弱，因此限制了FLAER在紅細胞中的應(yīng)用。第三十四頁，共三十七頁。與與CD55CD55、CD59CD59比較，比較，F(xiàn)laerFlaer對對PNHPNH患者患者(hunzh)(hunzh)對中性粒細胞的測定最為清晰、準對中性粒細胞的測定最為清晰、準確確臨床上高度懷疑，而臨床上高度懷疑，而CD55CD55、CD59CD59不能不能確診的病例，可以結(jié)合確診的病例，可以結(jié)合F1aerF1aer檢查，獲得檢查，獲得明確診斷明確診斷第三十五頁，共三十七頁。第三十六