【公開課課件】目的基因的篩選和獲取課件高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

1、第第3 3章章 基因工程基因工程第第2 2節(jié)節(jié) 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉花 從社會(huì)中來抗蟲棉的培育過程抗蟲棉的培育過程2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的基因的篩選與獲取3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的 檢測與鑒定Bt基因Ti質(zhì)粒重組DNA分子將目的基因插入染色體DNA中 從社會(huì)中來基因工程的基本操作

2、程序：基因工程的基本操作程序：v獲：目的基因的篩選與獲取v構(gòu)：基因表達(dá)載體的構(gòu)建v導(dǎo)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞v檢：目的基因的檢測和鑒定（核心） 從社會(huì)中來第一步：第一步：目的基因的篩選與獲取目的基因的篩選與獲取1 1目的基因目的基因(1)(1)概念：概念：在因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)在因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。的基因。(2)(2)作用：作用：根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。(3)(3)實(shí)例：實(shí)例：與生

3、物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt Bt 抗蟲蛋抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將科學(xué)家將“殺蟲基因殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt Bt 抗蟲蛋白抵抗蟲害?？瓜x蛋白抵抗蟲害。目的基因目的基因一.目的基因的篩選與獲取1.目的基因3.23.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的篩選與獲取1

4、.篩選合適的目的基因：（1）方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。實(shí)例：蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害；蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)；科學(xué)家不僅掌握了Bt基因的序列信息，對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物-Bt抗蟲蛋白也有較為深入的了解。因此，篩選Bt基因作為培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為科學(xué)家找到合適的目的基因提供更多機(jī)會(huì)和可能。目的基因獲取方法目的基因獲取方法利用利用PCRPCR獲取和擴(kuò)增目的基因獲取和擴(kuò)增目的基因一.目的基因的篩選與獲取2.目

5、的基因的獲取方法從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選的基因中進(jìn)行篩選通過通過DNADNA合成儀合成儀直接合成直接合成從從基因文庫基因文庫中獲取中獲取基因組文庫基因組文庫部分基因文庫（部分基因文庫（）基因文庫：基因文庫：DNA合成儀合成儀前提前提：基因比較小、核苷酸序列已知基因比較小、核苷酸序列已知方法：方法：通過通過DNADNA合成儀合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因用化學(xué)方法直接合成目的基因一.目的基因的篩選與獲取2.目的基因的獲取方法(2)人工合成PCR技術(shù)：PCR是_ _的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)_的原理，在_ _提供參與DNA復(fù)制的_ _與_ _，對(duì)_ _進(jìn)行_

6、_的技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制全稱全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因一.目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因原理原理操作環(huán)境操作環(huán)境目的目的優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：DNA復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用 解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）（2種）

7、引物是一小段能與_的一段堿基序列_的_DNA母鏈互補(bǔ)配對(duì)短單鏈核酸一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因G-C堿基對(duì)含量越高，需要的變性溫度相對(duì)越高想一想：為什么？2.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因：（1）概念反應(yīng)條件：P77表3-1+P77文字 PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供DNA模板，分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物，4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶；同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。P77相關(guān)信息 真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。第一步：目的基因的篩選與獲取2.利用PCR獲取和擴(kuò)

8、增目的基因：（2）擴(kuò)增過程：P77文字+P78圖3-5 目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3，端，如此重復(fù)循環(huán)多次。由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。每次循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。延伸延伸PCRPCR過程過程: :DNADNA模板模板4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸耐高溫的耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶引物引物533553353553變性變性復(fù)性復(fù)性53535335

9、 當(dāng)溫度上升到當(dāng)溫度上升到9090以上以上時(shí)，時(shí)，雙鏈雙鏈DNADNA解聚為單鏈解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到當(dāng)溫度下降到5 500左右左右時(shí)，時(shí)，兩種引物通過兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈與兩條單鏈DNADNA結(jié)合結(jié)合當(dāng)溫度上升到當(dāng)溫度上升到7272左右左右時(shí)，時(shí)，溶液中的溶液中的4 4種脫種脫氧核苷酸氧核苷酸在在耐高溫的耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，的作用下，根據(jù)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的合成新的DNADNA鏈鏈355335353535353553353535353535353535353535353535第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪

10、反應(yīng)的模板，經(jīng)第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。物。第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物。環(huán)的產(chǎn)物。53353535完成以后，常采用完成以后，常采用瓊瓊脂糖凝膠電泳脂糖凝膠電泳來鑒定來鑒定PCRPCR的產(chǎn)物的產(chǎn)物 目的基因DNA_后_，_與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以_為模板在_作用下進(jìn)行_，即將4種_加到_，如此重復(fù)循環(huán)多次。過程歸納：受熱變性解為單鏈引物延伸單鏈DNADNA聚合酶引物的3端脫氧核苷酸 由

11、于延伸后得到的_又可以作為下一個(gè)循環(huán)的_，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加_，即成_形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。產(chǎn)物模板一倍指數(shù)每次循環(huán)一般可以分為_、_、_三步。變性復(fù)性延伸PCR反應(yīng)過程一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCRPCR擴(kuò)增技術(shù)和體內(nèi)擴(kuò)增技術(shù)和體內(nèi)DNADNA復(fù)制的異同復(fù)制的異同項(xiàng)目項(xiàng)目體內(nèi)體內(nèi)DNADNA復(fù)制復(fù)制PCRPCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)解旋方式解旋方式解旋酶催化解旋酶催化DNADNA在高溫作用下變性解旋在高溫作用下變性解旋場所場所細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)( (主要主要在細(xì)胞核內(nèi)在細(xì)胞核內(nèi)) )PCRPCR擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增儀內(nèi)酶酶解旋酶、解旋酶

12、、DNADNA聚合酶聚合酶耐高溫的耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶溫度溫度條件條件細(xì)胞內(nèi)溫和條件細(xì)胞內(nèi)溫和條件需控制溫度，需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行在較高溫度下進(jìn)行結(jié)果結(jié)果DNADNA分子分子DNADNA片段或目的基因片段或目的基因相同點(diǎn)相同點(diǎn)(1)(1)模板：均需要模板：均需要DNADNA的兩條單鏈作為模板；的兩條單鏈作為模板；(2)(2)原料：均為原料：均為4 4種脫氧核苷酸；種脫氧核苷酸；(3)(3)酶：均需酶：均需DNADNA聚合酶聚合酶用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶以以RNARNA為模板合成一條與為模板合成一

13、條與RNARNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的DNADNA鏈鏈，形成，形成RNA-DNARNA-DNA雜交分子雜交分子；核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA雜交分子中的雜交分子中的RNARNA鏈鏈，使之變成，使之變成單鏈單鏈DNADNA；以單鏈以單鏈DNADNA為模板，在為模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNADNA鏈，形成鏈，形成雙鏈雙鏈DNADNA分子分子，即，即cDNAcDNA一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一.目的基因的篩選與獲取PCR反應(yīng)過程PCR循環(huán)：變性退火延伸Lehninger: Principles of Bio