第十二章維生素類藥物分析

1、一、掌握維生素一、掌握維生素A、B1、C、E的結(jié)構(gòu)性質(zhì)與分析方的結(jié)構(gòu)性質(zhì)與分析方 法之間的關(guān)系；法之間的關(guān)系；二、掌握維生素二、掌握維生素B1、C、E的含量測(cè)定原理和方法。的含量測(cè)定原理和方法。三、了解維生素三、了解維生素A的含量測(cè)定原理和方法。的含量測(cè)定原理和方法。四、了解維生素四、了解維生素D性質(zhì)和分析特點(diǎn)。性質(zhì)和分析特點(diǎn)。維生素：維生素： 是維持人體正常代謝機(jī)能所是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的必需的 微量營(yíng)養(yǎng)物資。微量營(yíng)養(yǎng)物資。 人體不能合成維生素。人體不能合成維生素。概概 述述脂溶性脂溶性水溶性水溶性 VitB族族(B1、B2、B6、B12) VitC、葉酸、煙酸、煙酰胺、葉酸、煙酸、

2、煙酰胺VitMVitPPV VA A及醋酸及醋酸酯棕櫚酸酯棕櫚酸酯混合物酯混合物的食用油的食用油溶液溶液。人工合成的人工合成的V VA A醋酸酯結(jié)醋酸酯結(jié)晶加精制植晶加精制植物油制成的物油制成的油溶液，其油溶液，其制劑有制劑有V VADAD膠膠丸和丸和V VADAD滴丸滴丸。濃縮濃縮V VA A油混合油混合物物Ch.PUSPBP-H 維生素維生素A醇醇-COCH3 維生素維生素A醋酸酯醋酸酯-COC15H31 維生素維生素A棕櫚酸酯棕櫚酸酯R : 維生素維生素ACH3CH3CH2ORCH3CH3CH3CH3CH3CH2ORCH3CH3CH3環(huán)己烯環(huán)己烯共軛多共軛多烯側(cè)鏈烯側(cè)鏈存在多種立體異構(gòu)化

3、合物存在多種立體異構(gòu)化合物具有具有UVUV吸收吸收易發(fā)生脫氫、脫水、聚合易發(fā)生脫氫、脫水、聚合 反應(yīng)反應(yīng)為一個(gè)具有共軛多烯側(cè)鏈的為一個(gè)具有共軛多烯側(cè)鏈的 環(huán)己烯環(huán)己烯（一）（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、一、v 具有具有UV吸收吸收v 存在多種立體異構(gòu)化合物存在多種立體異構(gòu)化合物max 相對(duì)生物效價(jià)相對(duì)生物效價(jià)VitA2VitA3v 易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)CH2OHCH2鯨醇鯨醇CH2OHCH2OHCH3酸酸醛醛環(huán)氧化物環(huán)氧化物、氧化劑、氧化劑紫外線、紫外線、VitAVitAVitAOO2v 或有金屬離子存在時(shí)氧化或有金屬離子存在時(shí)氧化共軛多烯側(cè)鏈共軛多烯側(cè)鏈 易被

4、氧化易被氧化（二）（二）環(huán)氧化物環(huán)氧化物VitA醛醛VitA酸酸OCH2OHHOCCOOH（三）（三）與三氯化銻發(fā)生呈色反應(yīng)與三氯化銻發(fā)生呈色反應(yīng)紫紫紅紅藍(lán)藍(lán)色色3SbClVitACHCl3溶解性溶解性（四）（四）不溶于水不溶于水易溶于有機(jī)溶劑和植物油等易溶于有機(jī)溶劑和植物油等三氯化銻反應(yīng)三氯化銻反應(yīng)（一）（一）條件條件 無(wú)水無(wú)醇無(wú)水無(wú)醇紫紫紅紅藍(lán)藍(lán)色色 3SbClVitACHCl3鑒別鑒別二、二、-RCOOSbCl5+CH2藍(lán)色藍(lán)色紫紅紫紅+CH2-RCOOSbCl5（BP（1998）VitAVitAHCl去去水水無(wú)無(wú)水水乙乙醇醇max為為326nm一個(gè)吸收峰一個(gè)吸收峰UV法法（二）（二）m

5、ax為為350390nm三個(gè)吸收峰三個(gè)吸收峰去水去水VitA（VitA3）CH2VitACH3CH3CH2ORCH3CH3CH3USP 顯色劑顯色劑 磷鉬酸磷鉬酸 規(guī)定斑點(diǎn)顏色和規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值值BP 雜質(zhì)對(duì)照品法雜質(zhì)對(duì)照品法 顯色劑顯色劑 三氯化銻三氯化銻TLC法法（三）（三）立體異構(gòu)體立體異構(gòu)體氧化產(chǎn)物及光照產(chǎn)物氧化產(chǎn)物及光照產(chǎn)物合成中間體合成中間體去氫維生素去氫維生素A（ VitA2）去水維生素去水維生素A（ VitA3）UV法法（一）（一）含量測(cè)定含量測(cè)定三、三、三點(diǎn)校正法三點(diǎn)校正法1. 條件：條件：（1）雜質(zhì)的吸收在）雜質(zhì)的吸收在310340nm波波長(zhǎng)范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長(zhǎng)范

6、圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增大吸收度減?。婚L(zhǎng)的增大吸收度減??；（2）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。2. 波長(zhǎng)的選擇：波長(zhǎng)的選擇：（1） 1 VitA的的 max（328nm）（2） 2 3 分別在分別在 1的兩側(cè)各選一點(diǎn)的兩側(cè)各選一點(diǎn)測(cè)定對(duì)象測(cè)定對(duì)象 VitA醋酸酯醋酸酯328340316328 第一法第一法 等波長(zhǎng)差法等波長(zhǎng)差法 3403163283282523AAA.A 校校正正第二法第二法 等吸收度法等吸收度法(皂化法皂化法)測(cè)定對(duì)象測(cè)定對(duì)象 VitA醇醇32176 AAA 334310325325260455528156A.A.A.A 校校正正 測(cè)定法測(cè)定法（1

7、）基本步驟）基本步驟:v第一步第一步 A選擇選擇選擇依據(jù)：選擇依據(jù)：所選所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除值中雜質(zhì)的干擾已基本消除注意：注意： C 為混合樣品的濃度為混合樣品的濃度 第二步第二步 求求)(%cm1樣樣 l(%)CA%)(cm1 樣樣)()(%cm1%cm1純純樣樣 第三步第三步 求效價(jià)求效價(jià)換算因數(shù)換算因數(shù)）效價(jià)（效價(jià)（樣樣樣樣 %)(cm1)(Eg/IU換算因數(shù)由純品計(jì)算而得：換算因數(shù)由純品計(jì)算而得：%)(cm1Eg/IU純純）效效價(jià)價(jià)（換換算算因因數(shù)數(shù)醋醋酸酸酯酯維維生生素素Ag344. 0IU1 2907000g344. 0g101g/IU6 ）效效價(jià)價(jià)（1530290700

8、0Eg/IU%)(cm1 純純）效價(jià)（效價(jià)（換算因數(shù)換算因數(shù)1900 醇醇維維生生素素Ag300. 0IU1 3330000g300. 0g101g/IU6 ）效效價(jià)價(jià)g/IU%)(cm1 純純）效價(jià)（效價(jià)（換算因數(shù)換算因數(shù)1830 第四步：求標(biāo)示量第四步：求標(biāo)示量標(biāo)示量標(biāo)示量平均丸重平均丸重100g/IU 標(biāo)標(biāo)示示量量丸丸標(biāo)標(biāo)示示量量100/IU 標(biāo)示量標(biāo)示量平均丸重平均丸重?fù)Q算因數(shù)換算因數(shù)100CA 方法：方法：（2） 第一法第一法維生素維生素A醋酸酯醋酸酯iAnm360340328316300ml/IU159S處處測(cè)測(cè)、分分別別于于溶溶液液環(huán)環(huán)己己烷烷 判斷判斷

9、 是否在是否在326329nm之間之間max max 在在326329nm之間之間改用第二法改用第二法是是否否 求算求算 并與規(guī)定值比較并與規(guī)定值比較328iA/A 299.0AA811.0AA0000.1AA907.0AA555.0AA328360328340328328328316328300 規(guī)定值規(guī)定值 差值差值328iA/A 判斷差值是否超過(guò)規(guī)定值的判斷差值是否超過(guò)規(guī)定值的02. 0 有一個(gè)以上有一個(gè)以上超過(guò)超過(guò)02. 0 無(wú)超過(guò)無(wú)超過(guò)02. 0 計(jì)算計(jì)算 A328（校正）（校正） 用用A328計(jì)算計(jì)算%100AAAf328328)(328 校正校正 3403163283282523

10、AAA.A 校校正正03%15%3%第二法第二法 校校正正328A328A第二法第二法A300 /A328 ：0.555A316/A328 ：0.907A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.811A360/A328 ：0.299 求本品中維生素求本品中維生素A的含量？的含量？A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.833A360/A328 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 + 0.010.01 0 + 0.02 + 0.04 6050523056106

11、28025232523340316328328.AAA.A 校正校正=%)3%15(%7 . 3%100AAAf328328)(328 校正校正 %0 .99%1001000008262. 010020125022399. 01900605. 0%100)ml100/g(C1900A%328 標(biāo)示量標(biāo)示量平均丸重平均丸重標(biāo)示量標(biāo)示量校正校正適用于維生素適用于維生素A醇醇第一法無(wú)法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法第一法無(wú)法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法 皂化法、皂化法、6/7A法法 （3）第二法）第二法i/KOHAnm334325310300ml/IU159VitAVitAS處測(cè)處測(cè)、于于稀釋至稀釋至溶解溶解異丙醇異

12、丙醇除去植物油的干擾除去植物油的干擾甘油和脂肪酸鹽甘油和脂肪酸鹽植物油植物油醇醇醋酸酯醋酸酯皂化液皂化液揮干乙醚揮干乙醚乙醚提取乙醚提取乙醇乙醇 水溶性水溶性脂溶性脂溶性 判斷判斷 max是否在是否在323327nm之間之間取未皂化樣品取未皂化樣品采用色譜法純采用色譜法純化后再測(cè)定化后再測(cè)定 計(jì)算計(jì)算325300AA是是否否 判斷判斷 A300 /A325 是否大于是否大于0.73是是否否取未皂化樣品取未皂化樣品采用色譜法純采用色譜法純化后再測(cè)定化后再測(cè)定 計(jì)算計(jì)算A325(校正校正)%100AAAf325325)(325 校正校正 334310325325260455528156A.A.A.

13、A 校校正正03%3% 校正校正325A325A 校正校正325A三氯化銻比色法三氯化銻比色法藍(lán)色藍(lán)色 3SbClVitA優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便 快速快速max 618nm620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 SbOClSbClOH32缺點(diǎn)缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定呈色不穩(wěn)定 （5 10s內(nèi)）內(nèi)）水分干擾水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差1專屬性差專屬性差三氯化銻有腐蝕性三氯化銻有腐蝕性NSCH3CH2CH2OHNNH3CNH2CH2+ 維生素維生素B1HClCl-氨基嘧啶環(huán)氨基嘧啶環(huán)UV還原性還原性噻唑環(huán)噻唑環(huán)（一）（一）溶解性溶解性1、易溶于水、易溶于水2、水溶液呈酸性、水溶液呈酸性（二）（二）UV共軛雙鍵共

14、軛雙鍵max = 246nm結(jié)構(gòu)與性質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、一、嘧啶環(huán)嘧啶環(huán) 伯氨伯氨噻唑環(huán)噻唑環(huán) 季銨季銨1、可與酸成鹽、可與酸成鹽2、與生物堿、與生物堿3、含量測(cè)定、含量測(cè)定 非水堿量法非水堿量法 藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光硫色素硫色素正丁醇正丁醇 OOH（三）（三）硫色素反應(yīng)硫色素反應(yīng)（四）（四）堿性堿性熒熒光光消消失失藍(lán)藍(lán)色色熒熒光光硫硫色色素素正正丁丁醇醇）（環(huán)環(huán)合合 HCNFeKOHNaOHVitB6321O OHChP鑒別試驗(yàn)鑒別試驗(yàn)二、二、（一）（一）硫色素反應(yīng)硫色素反應(yīng)CH2NNH3CNH2CH3NNaSC2H4OHONNH3CNH2HClNSCH3C2H4OHCH2NaOHNNH3CNNNa

15、SCH3C2H4OH-H2O硫色素硫色素SCH3C2H4OHNNH3CNNH 環(huán)環(huán)合合NNH3CNNSCH3C2H4OH H22HVitB1 4242HgIHBHgIK 淡淡黃黃H+ 2KIIIHIB2 紅紅色色H+白白色色硅硅鎢鎢酸酸 H+ OH4WO12OHSiOB23222 白色扇形白色扇形苦酮酸苦酮酸 H+（二）（二） 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) PbSNaSVitBAcPbNaOH OHNHAgNOAgCl白白3HNO HNO藍(lán)藍(lán)淀淀粉粉試試紙紙 KIMnOCl H S元素反應(yīng)元素反應(yīng)Cl-反應(yīng)反應(yīng)（三）（三） 其他反應(yīng)其他反應(yīng)三、三、 含量測(cè)定含量測(cè)定 HClOClOBHClOHClClBA

16、cHg）（喹那啶紅亞甲藍(lán)喹那啶紅亞甲藍(lán) （紫紅（紫紅天藍(lán)）天藍(lán)）（一）（一）非水溶液滴定法非水溶液滴定法 ml/mg.nMcT861622733710 %WFTVV% 空空樣樣含含量量UV法法（二）（二）片劑、注射劑片劑、注射劑= 421%cmE11（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=%WEA%cm100110011 標(biāo)示量標(biāo)示量平均片重平均片重稀釋度稀釋度A = ECL規(guī)格規(guī)格g/片片g/100ml稀稀釋釋度度稀稀釋釋倍倍數(shù)數(shù)1 gChP（每（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=%VEA%cm1001110011 標(biāo)示量標(biāo)示量稀釋度稀釋度規(guī)格規(guī)格g/mlml準(zhǔn)確度高準(zhǔn)確度高

17、靈敏度低靈敏度低操作繁瑣操作繁瑣設(shè)備簡(jiǎn)單設(shè)備簡(jiǎn)單（三）（三） 硅鎢酸重量法硅鎢酸重量法1、OHHClOHWOOHSiOOSClNHCOHWOSiOHClOSClNHCH 白白）（）（2、1939022347927337221.MMVitB 沉沉淀淀?yè)Q換算算因因數(shù)數(shù) 硅鎢酸硅鎢酸）（硅鎢酸硅鎢酸VitBVitB2337.273479.22 取本品約取本品約50mg，精密稱定，加水，精密稱定，加水50ml溶解后，加鹽酸溶解后，加鹽酸2ml，煮沸，立，煮沸，立即滴加硅鎢酸試液即滴加硅鎢酸試液4ml，繼續(xù)煮沸，繼續(xù)煮沸2分分鐘，用鐘，用80恒重的垂熔玻璃坩堝濾過(guò)，恒重的垂熔玻璃坩堝濾過(guò)，沉淀先用煮沸的

18、鹽酸溶液（沉淀先用煮沸的鹽酸溶液（120）20ml分次洗滌，再用水分次洗滌，再用水10ml洗滌洗滌1次，次，最后用丙酮洗滌最后用丙酮洗滌2次，每次次，每次5ml，在，在80干燥至恒重，精密稱定，所得重干燥至恒重，精密稱定，所得重量與量與0.1939相乘，即得相乘，即得3、例例 精密稱取本品精密稱取本品0.0519g，加水，加水50 ml溶解，加鹽酸溶解，加鹽酸2ml煮沸，立即滴加煮沸，立即滴加硅鎢酸試液硅鎢酸試液4 ml，繼續(xù)煮沸，繼續(xù)煮沸2分鐘，用分鐘，用80恒重的垂熔玻璃坩堝濾過(guò)，沉淀恒重的垂熔玻璃坩堝濾過(guò)，沉淀先用煮沸的鹽酸溶液（先用煮沸的鹽酸溶液（120）20 ml 分次洗滌，再用水分

19、次洗滌，再用水10ml 洗滌洗滌1次，后次，后用丙酮洗滌用丙酮洗滌2次，每次次，每次5ml。在。在80干干燥至恒重，稱得沉淀重量為燥至恒重，稱得沉淀重量為0.2557g。求本品的含量按干燥品計(jì)算為多少？求本品的含量按干燥品計(jì)算為多少？(本品干燥失重項(xiàng)下測(cè)定結(jié)果為本品干燥失重項(xiàng)下測(cè)定結(jié)果為3.73%)%W.W%VitB1001193901 ）水分水分（樣樣沉淀沉淀%.%.%VitB29910073310519019390255701 ）（A. 取樣量取樣量50mg 提高靈敏度提高靈敏度B. 80 保持保持4個(gè)個(gè)H2OC. HCl 增大沉淀顆粒增大沉淀顆粒D. 硅鎢酸硅鎢酸 ：VitB1 = 8

20、：1 使沉淀完全使沉淀完全E. 硅鎢酸邊攪拌邊緩慢加入硅鎢酸邊攪拌邊緩慢加入 增大沉淀顆粒增大沉淀顆粒4、熒熒光光硫硫色色素素異異丁丁醇醇鐵鐵氰氰化化鉀鉀 VitBNaOH（四）（四） 硫色素?zé)晒夥蛏責(zé)晒夥?、激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)365nm發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)435nm2、+ NaOH + 鐵氰化鉀鐵氰化鉀 + 異丁醇異丁醇+ NaOH + 異丁醇異丁醇+ NaOH + 鐵氰化鉀鐵氰化鉀 + 異丁醇異丁醇+ NaOH + 異丁醇異丁醇SdAb%WWdSbA%VitB1001 稀稀釋釋度度稀稀釋釋度度樣樣對(duì)對(duì)對(duì)照液對(duì)照液供試液供試液3、（1）靈敏度高，線性范圍寬）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不

21、干擾，適用于）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于 體液分析體液分析 維生素維生素C654321OOHHOO C OHHCH2OHL抗壞血酸抗壞血酸兩個(gè)手性碳原子，兩個(gè)手性碳原子，有四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體有四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體二烯醇強(qiáng)還原性二烯醇強(qiáng)還原性弱酸性（一元酸）弱酸性（一元酸）1、易溶于水、易溶于水2、水溶液呈酸性、水溶液呈酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、一、（一）（一）溶解性溶解性O(shè)二烯醇結(jié)構(gòu)二烯醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)二烯醇結(jié)構(gòu)二烯醇結(jié)構(gòu)（二）（二） 強(qiáng)還原性強(qiáng)還原性O(shè)HOHCCOOCCCH2OHOOOO C OHHCH2OHCHHOCHOHCOCOCOONa HH+OH-有活性有活性有活性有活性無(wú)活性無(wú)活性O(shè)

22、HOO C OHHCH2OHHOO顯顯色色糠糠醛醛衍衍生生物物糠糠醛醛酚酚類類脫脫水水 H糖類的顯色反應(yīng)糖類的顯色反應(yīng)藍(lán)藍(lán)色色糠糠醛醛吡吡咯咯脫脫水水 HVitC50結(jié)構(gòu)與糖類相似結(jié)構(gòu)與糖類相似（三）（三）具糖的性質(zhì)具糖的性質(zhì)OOHHOO C OHHCH2OH123456C3OH的的pKa = 4.17C2OH的的pKa = 11.57酸性酸性（四）（四）一元酸一元酸OOHHOO C OHHCH2OH123456L(+)抗壞血酸抗壞血酸活性最強(qiáng)活性最強(qiáng)手性手性C（C4、C5）（五）（五） 光學(xué)活性光學(xué)活性*與堿反應(yīng)與堿反應(yīng)單鈉鹽單鈉鹽32CONa酮酮酸酸鹽鹽水水解解 NaOH（六）（六） 水解

23、反應(yīng)水解反應(yīng)OHOO C OHHCH2OHHOOHOO C OHHCH2OHNaOCOONaOCOCCHOHHOCHCH2OHNa2CO3NaOHnmnmmaxOHmaxH （七）（七） UV特征特征去去氫氫抗抗壞壞血血酸酸OVitC與氧化劑的反應(yīng)與氧化劑的反應(yīng)（一）（一）鑒別試驗(yàn)鑒別試驗(yàn)二、二、OHOO C OHHCH2OHHOCH2OHOOOO C OHH O（銀鏡）（銀鏡）黑黑 AgAgNOVitC1、與、與AgNO3反應(yīng)反應(yīng)2、與、與2，6 - 二氯靛酚反應(yīng)二氯靛酚反應(yīng)(ChP2000)無(wú)色無(wú)色二氯靛酚二氯靛酚， VitC62氧化型氧化型玫瑰紅色玫瑰紅色 H還原型還原型藍(lán)色藍(lán)色 OHO

24、H(ChP2000)NClHOClONClHOClOHH（玫瑰色）玫瑰色）（無(wú)色）（無(wú)色）紅紅堿堿性性酒酒石石酸酸銅銅 OCuVitC3、與堿性酒石酸銅反應(yīng)、與堿性酒石酸銅反應(yīng)USP4、與、與KMnO4反應(yīng)反應(yīng) MnKMnOVitC糖類的反應(yīng)糖類的反應(yīng)（二）（二）藍(lán)藍(lán)色色糠糠醛醛戊戊糖糖脫脫水水三三氯氯醋醋酸酸 VitC或鹽酸或鹽酸50吡咯吡咯USPOO C OHHCH2OHHOOHCH2OHOO C OHHHHOOCCOHO OCHOH3CH2OHH2O-CO2-H2OOCHN（藍(lán)色）（藍(lán)色）OCHO(糠醛糠醛)OCHOH3CH2OHCH（戊糖）（戊糖）NNH50(吡咯吡咯)UV（三）（三）

25、BP0.01mol/L HClnmmax243 58554511E%cm IIVitCH去氫抗壞血酸去氫抗壞血酸2指示劑指示劑 淀粉指示液淀粉指示液原理原理1、碘量法碘量法（一）（一）含量測(cè)定含量測(cè)定三、三、OO C OHHOOCH2OHHI2+OHOO C OHHCH2OHHOH+ I 取本品約取本品約0.2g，精密稱定，加新，精密稱定，加新沸過(guò)的冷水沸過(guò)的冷水100ml與稀醋酸與稀醋酸10ml使溶使溶解，加淀粉指示液解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴，立即用碘滴定液（定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在色，在30秒內(nèi)不褪。每秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液碘滴定液(0

26、.1mol/L)相當(dāng)于相當(dāng)于8.806mg的的C6H8O6方法方法2、）（ml/mg.nMCT806821317610 IIVitCH去氫抗壞血酸去氫抗壞血酸2（1）酸性環(huán)境）酸性環(huán)境 d . HCl （2）新沸冷）新沸冷H2O減慢減慢VitC被被O2氧化速度氧化速度討論討論4、（3）立即滴定）立即滴定 趕走水中趕走水中O2減少減少O2的干擾的干擾（4）附加劑干擾的排除）附加劑干擾的排除片劑片劑 滑石粉滑石粉 過(guò)濾過(guò)濾注射劑注射劑 抗氧劑抗氧劑 丙酮丙酮甲醛甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 CHHOOaS3a S O+H2N H ON2252HO NH COS3a

27、33COCHCH33CHCHCNaSO3OH33CHCHCNaSO3OH2，6 - 二氯靛酚鈉滴定法法二氯靛酚鈉滴定法法（二）（二）酚酚亞亞胺胺二二氯氯靛靛酚酚， VitCUSPJP原理原理1、空空樣樣二二氯氯靛靛酚酚液液空空白白樣樣品品VVHAcHPO 3自身指示終點(diǎn)法自身指示終點(diǎn)法藍(lán)藍(lán)色色玫玫瑰瑰紅紅 OHH無(wú)無(wú)色色還還原原 方法方法2、（2）快速滴定）快速滴定 2min內(nèi)內(nèi) （1）酸性環(huán)境）酸性環(huán)境 HPO3-HAc 穩(wěn)定穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測(cè)定）剩余比色測(cè)定 AVitC測(cè)測(cè)二二氯氯靛靛酚酚 （定量過(guò)量）（定量過(guò)量）（測(cè)剩余染料）（測(cè)剩余

28、染料）討論討論3、（4）缺點(diǎn)）缺點(diǎn) 需經(jīng)常標(biāo)定需經(jīng)常標(biāo)定貯存貯存一周一周不穩(wěn)定不穩(wěn)定干擾多干擾多 氧化力較強(qiáng)氧化力較強(qiáng)HPLC法法（三）（三）1、HPLC的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高靈敏度高選擇性高選擇性高分離分析同步分離分析同步微量分析微量分析干擾少干擾少 快速快速2、HPLC法分離法分離VitC常用方法及測(cè)常用方法及測(cè) 定對(duì)象定對(duì)象 對(duì)象對(duì)象 制劑、生物樣品、果汁制劑、生物樣品、果汁方法方法 離子交換色譜法離子交換色譜法 離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法 分配色譜法（正、反相）分配色譜法（正、反相）血、尿、組織、細(xì)胞等血、尿、組織、細(xì)胞等例例多種維生素片中多種維生素片中VitA、 VitB1、 VitB2

29、 、VitB6 、煙酰胺、煙酰胺、VitC、VitE的含量測(cè)定的含量測(cè)定色譜柱色譜柱 ODS流動(dòng)相流動(dòng)相 A、水、水 -甲醇（甲醇（4 ：1） B、甲醇、甲醇 （梯度洗脫）（梯度洗脫）抗氧劑抗氧劑 二巰基丙烷磺酸鈉二巰基丙烷磺酸鈉水溶性維生素水溶性維生素 離子對(duì)色譜法（樟腦磺酸）離子對(duì)色譜法（樟腦磺酸） 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 + 校正因子校正因子 內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)物苯酚苯酚脂溶性維生素脂溶性維生素 外標(biāo)法外標(biāo)法維生素維生素DHOHHCH2CH3HHHCH3CH3CH3CH3維生素維生素D2一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)HOHHCH2CH3HHCH3CH3CH3維生素維生素D3開(kāi)環(huán)的甾體開(kāi)環(huán)的甾體：具有甾類化合

30、物的顯色反：具有甾類化合物的顯色反應(yīng)，可用于鑒別。應(yīng)，可用于鑒別。手性碳原子手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。：具有旋光性，可用于鑒別。多烯多烯：可進(jìn)行紫外檢測(cè)。：可進(jìn)行紫外檢測(cè)。二、鑒別試驗(yàn)二、鑒別試驗(yàn)1. 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)醋酐醋酐-硫酸反應(yīng)硫酸反應(yīng) D2 黃黃 紅紅 紫紫 綠綠 D3 黃黃 紅紅 紫、藍(lán)綠紫、藍(lán)綠 綠綠 三氯化銻反應(yīng)三氯化銻反應(yīng) 橙紅色漸變粉紅橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)三氯化鐵反應(yīng) 橙黃色橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng) 綠色綠色2. 比旋度鑒別比旋度鑒別維生素維生素D D2 2維生素維生素D D3 3溶溶 劑劑 濃濃 度度 比旋度值比旋度值無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇

31、無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇40mg/ml40mg/ml5mg/ml5mg/ml+102.5+102.5+107.5+107.5 +105+105+112+112注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：應(yīng)于容器開(kāi)啟：應(yīng)于容器開(kāi)啟3030分鐘內(nèi)取樣，分鐘內(nèi)取樣， 在溶液配制后在溶液配制后3030分鐘內(nèi)測(cè)定。分鐘內(nèi)測(cè)定。 3.3.區(qū)別反應(yīng)：區(qū)別反應(yīng)： 以以96%96%乙醇為溶劑，加乙醇和乙醇為溶劑，加乙醇和85%85%硫酸，硫酸，D D2 2顯紅色，在顯紅色，在570nm570nm處有最大吸收，處有最大吸收，D D3 3顯黃色，顯黃色，在在495nm495nm處有最大吸收。處有最大吸收。 4.4.其他方法其他方法： TLCTLC、

32、HPLCHPLC、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)三、雜質(zhì)檢查三、雜質(zhì)檢查維生素維生素D D2 2中麥角甾醇的檢查中麥角甾醇的檢查：加洋地：加洋地黃皂苷溶液，混合，放置黃皂苷溶液，混合，放置18h18h不得發(fā)不得發(fā)生渾濁或沉淀。生渾濁或沉淀。前維生素前維生素D D的光照產(chǎn)物的光照產(chǎn)物四、含量測(cè)定方法四、含量測(cè)定方法 中國(guó)藥典（中國(guó)藥典（20002000年版）采用年版）采用正相高效液相色譜法正相高效液相色譜法測(cè)定維生素測(cè)定維生素D D的含量，定量方法為內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為鄰的含量，定量方法為內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二甲酸二甲酯，該法分為苯二甲酸二甲酯，該法分為三個(gè)方法三個(gè)方法。固定相：硅膠固定相：硅膠

33、流動(dòng)相：正己烷流動(dòng)相：正己烷- -正戊醇（正戊醇（997997：3 3）第一法第一法：用于無(wú)維生素：用于無(wú)維生素A A醇及其它雜質(zhì)的干擾的情況，醇及其它雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：步驟如下：1 1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定重復(fù)性和分離度。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定重復(fù)性和分離度。Vit D3對(duì) 照 品前 Vit D3反 式 Vit DVit D3速 甾 醇 DVit D3重 復(fù) 性前 Vit D3與 反 式 Vit D3Vit D3與 速 甾 醇 D3901h254nm365nmHPLC冷 卻 環(huán) 己 烷R大 于 1.0RSD小 于 2.0%峰 ：峰峰33 2 2測(cè)定校正因子：測(cè)定校正因子： A A S

34、S /m /m S S f f1 1 = - = - A A r r /m /m r r f f2 2 = =（A A S S m m r r- f- f1 1 m m S S A A r1r1）/ /（A A r1 r1 m m S S） 3 3含量測(cè)定：含量測(cè)定： m mi i= =（f f1 1 A Ai1i1+ f + f 2 2 A A i2i2）m m S S /A /A S S第二法第二法：用于有雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：用于有雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：1 1皂化處理：皂化、乙醚提取、洗滌提取液、蒸除乙皂化處理：皂化、乙醚提取、洗滌提取液、蒸除乙 醚、制備供試液醚、制備供試液

35、A A。2 2凈化：供試液凈化：供試液A A經(jīng)液相色譜分離，準(zhǔn)確收集含有維經(jīng)液相色譜分離，準(zhǔn)確收集含有維 生素生素D D及前維生素及前維生素D D混合物的全部流出液，制混合物的全部流出液，制 備成供試液備成供試液B B。 固定相：固定相：ODSODS 流動(dòng)相：甲醇流動(dòng)相：甲醇- -乙腈乙腈- -水（水（5050：5050：2 2） 3 3含量測(cè)定：取供試液含量測(cè)定：取供試液B B按第一法測(cè)定。按第一法測(cè)定。第三法第三法：用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質(zhì)的干擾的情況。：用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質(zhì)的干擾的情況。步驟如下：步驟如下：1 1制備供試液：取供試液制備供試液：取供試液A A，凈化，水浴加熱，得供

36、，凈化，水浴加熱，得供 試液試液C C。 制備對(duì)照液：對(duì)照品儲(chǔ)備液：稀釋、加熱。制備對(duì)照液：對(duì)照品儲(chǔ)備液：稀釋、加熱。2 2含量測(cè)定：在第一法的色譜條件下，交替精密進(jìn)樣含量測(cè)定：在第一法的色譜條件下，交替精密進(jìn)樣 對(duì)照液和供試液，按外標(biāo)法定量。對(duì)照液和供試液，按外標(biāo)法定量。苯并二氫吡喃醇苯并二氫吡喃醇維生素維生素EOHO苯環(huán)苯環(huán) + + 二氫吡喃環(huán)二氫吡喃環(huán) + + 飽和烴鏈飽和烴鏈OR1HOR2CH3名名 稱稱R1R2相對(duì)活性相對(duì)活性-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1*（天然品）（天然品） （合成品）（合成品）CH

37、3COOCH3CH3CH3CH3CH3CH3H3CH3COdl生育酚醋酸酯生育酚醋酸酯結(jié)構(gòu)與性質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、一、苯環(huán)苯環(huán) + 二氫吡喃環(huán)二氫吡喃環(huán) + 飽和烴鏈飽和烴鏈1、易溶于有機(jī)溶劑，不溶于水、易溶于有機(jī)溶劑，不溶于水2、UV3、酯鍵、酯鍵 易水解易水解 OorOHHVitE醌型化合物醌型化合物生育酚生育酚OHNO3VitE生生育育紅紅生生育育酚酚7515（一）（一）硝酸反應(yīng)硝酸反應(yīng)橙紅色橙紅色鑒別鑒別二、二、OOCH3C16H33H3CCH3O（橙紅色）（橙紅色）生育紅生育紅CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑強(qiáng)氧化劑 取本品約取本品約30mg，加無(wú)水

38、乙，加無(wú)水乙醇醇10ml溶解后，加硝酸溶解后，加硝酸2ml，搖勻，在搖勻，在75加熱加熱15分鐘，溶分鐘，溶液應(yīng)顯橙紅色。液應(yīng)顯橙紅色。三氯化鐵聯(lián)吡啶反應(yīng)三氯化鐵聯(lián)吡啶反應(yīng)紅色紅色生育醌生育醌對(duì)對(duì)生育酚生育酚聯(lián)吡啶聯(lián)吡啶 2FeKOHFeVitE3O（二）（二）OOH3CCH3OHCH3C16H33CH3CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚生育酚對(duì)對(duì)-生育醌生育醌+3FeO弱氧化弱氧化劑劑紅色紅色+23Fe3+2FeNNNN = 41.045.5%cmE11max = 284nmmin = 254nm0.01%無(wú)水乙醇中無(wú)水乙醇中UV法法（三）（三）維生素維生素EUV圖圖薄層板薄層

39、板 硅膠硅膠G展開(kāi)劑展開(kāi)劑 環(huán)己烷環(huán)己烷 -乙醚（乙醚（4 ：1）顯色劑顯色劑 硫酸（硫酸（105 5） VitE Rf = 0.7TLC法法（四）（四）硫酸鈰滴定液（硫酸鈰滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黃二苯胺（亮黃灰紫）灰紫）生生育育醌醌對(duì)對(duì)生生育育酚酚 3422CeCe 利用游離生育酚的還原性，利用游離生育酚的還原性，將硫酸鈰還原成硫酸亞鈰將硫酸鈰還原成硫酸亞鈰 檢查檢查 三、三、原理原理（一）（一）試劑試劑（二）（二）nCMT （M生育酚生育酚= 430.8）（ml/mg154. 228 .43001. 0T 例例 取本品取本品0.10g，加無(wú)水乙醇，加無(wú)水乙醇5ml溶解后，加

40、二苯胺試液溶解后，加二苯胺試液1滴，滴，用硫酸鈰液（用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，）滴定，消耗硫酸鈰液（消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不）不得過(guò)得過(guò) 1.0ml。%100WTV% 限量限量2.15%15. 2%1001 . 0002154. 00 . 1% 限量限量限量限量（三）（三）藥典規(guī)定藥典規(guī)定消耗硫酸鈰液（消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）1.0ml設(shè)：應(yīng)消耗硫酸鈰液設(shè)：應(yīng)消耗硫酸鈰液 V ml0.011.0 實(shí)際濃度實(shí)際濃度 V硫硫酸酸鈰鈰實(shí)實(shí)際際濃濃度度）（0 . 101. 0mlV 若硫酸鈰液濃度不是若硫酸鈰液濃度不是0.01000mol/L，應(yīng)重新計(jì)算硫酸鈰的消耗量

41、應(yīng)重新計(jì)算硫酸鈰的消耗量）（）（ml.mlV98001020001010 四、四、 含量測(cè)定含量測(cè)定GC法法（一）（一）1、選擇性好選擇性好靈敏度高靈敏度高速度快速度快分離效能好分離效能好揮發(fā)性低、不揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)穩(wěn)定、極性強(qiáng)衍生化易受衍生化易受樣品蒸氣壓限樣品蒸氣壓限制制載氣載氣N2固定液固定液硅酮（硅酮（OV-17）擔(dān)體擔(dān)體硅藻土或高分子多孔小球硅藻土或高分子多孔小球柱溫柱溫265檢測(cè)器檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)正三十二烷正三十二烷 n 500 R2VitE測(cè)定的色譜條件測(cè)定的色譜條件2、內(nèi)標(biāo)法加校正因子內(nèi)標(biāo)法加校正因子內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法供試液（樣品供試液（樣品+內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)物對(duì)照液（對(duì)照對(duì)照液（對(duì)照+內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)）是樣品中不存在的物質(zhì)是樣品中不存在的物質(zhì)與被測(cè)組分峰靠近與被測(cè)組分峰靠近能與各組分完全分離能與各組分完全分離與被測(cè)組分的量接近與被測(cè)組分的量接近對(duì)樣內(nèi)對(duì)內(nèi)樣樣樣內(nèi)內(nèi)對(duì)對(duì)內(nèi)內(nèi)相對(duì)mmAAAAmAmAmAmAf校正因子：校正因子：1KAA 內(nèi)