食品中乳酸菌的檢測

1、。1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗。2 規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3 術(shù)語和定義3.1乳酸菌 lactic acid bacteria一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus ）。4 設(shè)備和材

2、料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：4.1恒溫培養(yǎng)箱：36 ±1 。4.2冰箱： 2 5 。4.3均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。4.4天平：感量0.1 g 。4.5無菌試管： 18 mm×180 mm、 15 mm×100 mm。4.6無菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。4.7無菌錐形瓶：500 mL、 250 mL。5 培養(yǎng)基和試劑5.1MRS（ Man Rogosa Sharpe ）培養(yǎng)基及莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良 MRS培養(yǎng)基：見附錄 A

3、中 A.1。5.2MC培養(yǎng)基（ Modified Chalmers培養(yǎng)基）：見附錄A 中 A.2 。5.30.5%蔗糖發(fā)酵管 : 見附錄 A 中 A.3 。5.40.5%纖維二糖發(fā)酵管: 見附錄 A 中 A.3 。5.50.5%麥芽糖發(fā)酵管 : 見附錄 A 中 A.3 。5.60.5%甘露醇發(fā)酵管: 見附錄 A 中 A.3。5.70.5%水楊苷發(fā)酵管: 見附錄 A 中 A.3。5.80.5%山梨醇發(fā)酵管: 見附錄 A 中 A.3。5.90.5%乳糖發(fā)酵管 : 見附錄 A 中 A.3 。1。5.10 七葉苷發(fā)酵管: 見附錄 A 中 A.45.11 革蘭氏染色液：見附錄A 中 A.5 。5.12莫

4、匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學(xué)純。5.13半胱氨酸鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）：純度 99%。6 檢驗程序乳酸菌檢驗程序見圖 1。7 操作步驟7.1 樣品制備7.1.1樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。2。7.1.2冷凍樣品可先使其在2 5 條件下解凍， 時間不超過 18 h ，也可在溫度不超過 45 的條件解凍，時間不超過15 min 。7.1.3固體和半固體食品：以無菌操作稱取25 g 樣品，置于裝有225 mL 生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于 8000 r/min 10000 r/min均質(zhì) 1 min 2 min ，制成 1:10 樣品勻液；或

5、置于225 mL 生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min 2 min 制成 1:10 的樣品勻液。7.1.4液體樣品：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25 mL 放入裝有 225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10 的樣品勻液。7.2步驟7.2.1用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中 （注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用 1 支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。7.2.2另取 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸頭，

6、按上述操作順序，做10 倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1 次 1 mL 滅菌吸管或吸頭。7.2.3乳酸菌計數(shù)7.2.3.1乳酸菌總數(shù)根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計，選擇 2 個 3 個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。 36 ±1厭氧培養(yǎng)48 h ±2 h ，培養(yǎng)后計數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min 內(nèi)完成。7.2.3.2 雙歧桿菌計數(shù)根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇2 個 3 個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取 1 m

7、L 樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)， 每個稀釋度做兩個平皿。 稀釋液移入平皿后， 將冷卻至 50的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約 15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均。 36 ±1厭氧培養(yǎng)48 h ±2 h ，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在 15 min 內(nèi)完成。7.2.3.3嗜熱鏈球菌計數(shù)根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計，選擇2 個 3 個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取 1 mL 樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至 50的 MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36 ±1需氧培養(yǎng)

8、48 h ±2。3。h，培養(yǎng)后計數(shù)。 嗜熱鏈球菌在MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm±1 mm， 菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。7.2.3.4乳桿菌計數(shù)7.2.3.1項乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去7.2.3.2項雙歧桿菌與7.2.3.3項嗜熱鏈球菌計數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計數(shù)。7.3菌落計數(shù)可用肉眼觀察， 必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。7.3.1選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU 之間、無蔓延菌落生

9、長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。7.3.2其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用， 而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。7.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。7.4結(jié)果的表述7.4.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（ mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。7

10、.4.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算：式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。4。7.4.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。7.4.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.4.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)計算。7.4

11、.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU 300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU或大于 300 CFU時，則以最接近 30 CFU或 300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.5菌落數(shù)的報告7.5.1菌落數(shù)小于 100 CFU時，按 “四舍五入 ”原則修約，以整數(shù)報告。7.5.2菌落數(shù)大于或等于 100 CFU時，第 3 位數(shù)字采用 “四舍五入 ”原則修約后， 取前 2 位數(shù)字，后面用0 代替位數(shù)；也可用10 的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入 ”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。7.5.3稱重取樣以CFU/g 為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。8 結(jié)果與報告根據(jù)菌落計

12、數(shù)結(jié)果出具報告，報告單位以CFU/g（ mL）表示。9乳酸菌的鑒定（可選做）9.1純培養(yǎng)挑取 3 個或以上單個菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板，置36 ±1 厭氧培養(yǎng)48 h 。9.2鑒定9.2.1雙歧桿菌的鑒定按 GB 4789.34的規(guī)定操作。9.2.2涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無芽胞，革蘭氏染色陽性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑為0.5 m 2.0 m，成對或成鏈排列，無芽胞，革蘭氏染色陽性。9.2.3乳酸菌菌種主要生化反應(yīng)見表1和表 2。5。附錄 A培養(yǎng)基及試劑A.1MRS培養(yǎng)基A.1.1成分蛋白胨10.

13、0 g牛肉粉5.0 g酵母粉4.0 g葡萄糖20.0 g吐溫 801.0 mLK2HPO4·7H2O2.0 g醋酸鈉 ·3H O5.0 g2檸檬酸三銨2.0 gMgSO·7H O0.2 g42MnSO·4H O0.05 g42瓊脂粉15.0 g。6。pH 6.2A.1.2制法將上述成分加入到1 000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121 高壓滅菌15 min 20 min 。A.1.3莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基A.1.3.1莫匹羅星鋰鹽儲備液制備：稱取50mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL 蒸餾水中，用0.22 mm微孔濾膜

14、過濾除菌。A.1.3.2半胱氨酸鹽酸鹽儲備液制備：稱取 250mg莫匹羅星鋰鹽加入到50 mL 蒸餾水中， 用0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。A.1.3.2 制法將 A.1.1成分加入到950 mL 蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后 121 高壓滅菌 15 min 20 min 。臨用時加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至48 ，用帶有 0.22 mm微孔濾膜的注射器將莫匹羅星鋰鹽儲備液及半胱氨酸鹽酸鹽儲備液制備加入到熔化瓊脂中，使培養(yǎng)基中莫匹羅星鋰鹽的濃度為50 mg/mL，半胱氨酸鹽酸鹽的濃度為500 mg/mL。A.2MC培養(yǎng)基A.2.1成分大豆蛋白胨5.0 g牛肉粉3.0 g酵母粉3.0 g

15、葡萄糖20.0 g乳糖20.0 g碳酸鈣10.0 g瓊脂15.0 g蒸餾水1 000 mL1中性紅溶液5.0 mLpH6.0A.2.2制法將前面 7 種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，加入中性紅溶液。分裝后121 高壓滅菌15 min 20 min 。7。A.3 乳酸桿菌糖發(fā)酵管A.3.1基礎(chǔ)成分牛肉膏5.0 g蛋白胨5.0 g酵母浸膏5.0 g吐溫 800.5 mL瓊脂1.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4 mL蒸餾水1 000 mLA.3.2制法按 0.5%加入所需糖類，并分裝小試管,121 高壓滅菌 15 min 20 min 。A.4 七葉苷培養(yǎng)基A.4.1 成分蛋白胨5.0

16、g磷酸氫二鉀1.0 g七葉苷3.0 g枸櫞酸鐵0.5 g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4 mL蒸餾水100 mLA.4.2制法將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，121 高壓滅菌 15 min 20 min 。A.5 革蘭氏染色液A.5.1結(jié)晶紫染色液A.5.1.1成分結(jié)晶紫1.0 g95乙醇20 mL1草酸銨水溶液80 mLA.5.1.2制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。8。A.5.2革蘭氏碘液A.5.2.1成分碘1.0 g碘化鉀2.0 g蒸餾水300 mLA.5.2.2制法將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。A.5.3沙黃復(fù)染液A.5.3.1成分沙黃0.25 g95乙醇