免疫組化是應用免疫學基本原理

1、免疫組化在醫(yī)學中的應用免疫組化是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(或免疫細胞化學技術免疫組化技術是用標記物標記的抗體與組織或細胞的抗原反應，結(jié)合形態(tài)學檢查，對抗原作定性、定量、定位檢測的技術。現(xiàn)廣泛應用的有酶免疫組化、免疫金銀組化、免疫電鏡技術等。免疫組化的分類 免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。免疫組化實驗所用的組織和細胞標本 實驗所用主

2、要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。 其中石蠟切片是整理組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片整理過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本整理方法。免疫組化實驗所用的抗體 免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所

3、產(chǎn)生的抗體混合物。 免疫組化常用的染色方法 根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用。免疫組化操作步驟免疫組化（ LP 法）操作步驟 ： 1 切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步后進行 2. 緩沖液洗 3min/2 次。 3. 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。 4. 緩沖液洗 5min/2 次。 5. 滴加

4、Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。 （注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 10% 正常羊血清，這一步可以省略。） 6. 緩沖液洗 5min/2 次。 7. 滴加一抗工作液 37 孵育 1 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定） 8. 緩沖液洗 5min/2 次。 9 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鐘。 10 緩沖液洗 5min/2 次。 11 滴加 HRP Polymer( 酶標二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鐘。 （注：

5、 HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。） 12 緩沖液洗 5min/2 次。 13 向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus chromogen） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。） 14 自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。 冰凍切片免疫組化染色步驟： 冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘后，入 4 丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫

6、孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。免疫組化實驗結(jié)果的判定和分析 從實驗結(jié)果而言，免疫組化技術服務主要涉及抗體實驗結(jié)果的描述與分析，圖片的確定與選取，相關數(shù)據(jù)的提供，上述工作是免疫組化工作的重點內(nèi)容，只有嚴格的實驗設計，標準的實驗操作，專業(yè)化的結(jié)果分析才能更好的滿足客戶的要求，這點對于形式為腹水，上清，培養(yǎng)液之類的抗體顯得更為重要。關于上述服務內(nèi)容應該在實驗開始前由雙方明確，一般而言，客戶方實驗前應提出需要什么樣的結(jié)果與分析，例如是簡要還是詳細的描述實驗結(jié)果，需要實驗數(shù)據(jù)否，圖片的數(shù)量與規(guī)格等。如果為雙盲試驗或有第三方參與，則事先申明。免疫組化在臨床工作的意義 近年來，隨著免疫組織化

7、學技術的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時，準確率可達50%-75%。 免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面：(1)惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷； (2)確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；(3)對某類腫瘤進行進一步的病理分型；（4）軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應用多種標志進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；（5）發(fā)現(xiàn)微小

8、轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術范圍的確定。（6）為臨床提供治療方案的選擇。 例如惡性間皮瘤，它是一種較少見的腫瘤，主要發(fā)生于漿膜腔，由于其形態(tài)學復雜，較易與其他腫瘤，尤其是肺癌及漿膜腔轉(zhuǎn)移性腺癌相混淆。近年來，由于新抗體的不斷出現(xiàn)和免疫組化技術的發(fā)展，對惡性間皮瘤的診斷和鑒別診斷有了新的認識。早期應用的腫瘤標記物多為腺癌陽性表達，而間皮瘤陰性表達，用“反證法”加以診斷，如CEA，Leu-M1,B72.3，Ber-EP4等。新近出現(xiàn)的幾種抗體多為間皮瘤的特異性抗體，即間皮瘤多為陽性表達，而腺癌多為陰性表達，在二者的診斷與鑒別診斷上具有一定的應用價值，是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來