細胞培養(yǎng)技術(shù)

1、細胞培養(yǎng)技術(shù)簡介細胞培養(yǎng)技術(shù)簡介細胞培養(yǎng)的基本概念細胞培養(yǎng)的基本概念 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。 傳代傳代 細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。 培養(yǎng)細胞的特性培養(yǎng)細胞的特性 貼附生長：貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞。種實體瘤細胞。 懸浮生長：懸浮生長： 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于

2、支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞。持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞。 3. 3. 細胞培養(yǎng)的生長過程細胞培養(yǎng)的生長過程(1) (1) 細胞系的生長過程細胞系的生長過程( (三個階段三個階段) )：a.a.原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期 (1(14 4周周) )取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)b.b.傳代期傳代期 ( (數(shù)天到一周左右數(shù)天到一周左右) )細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種至兩個或者更多的培養(yǎng)器皿時間后，被分開接種至兩個或者更多的培養(yǎng)器皿中

3、中c.c.衰退期衰退期 ( (傳代傳代30305050次以后次以后) )在此期間細胞開始時雖仍在此期間細胞開始時雖仍然存活，但生殖已經(jīng)很緩慢并逐漸完全停止，進然存活，但生殖已經(jīng)很緩慢并逐漸完全停止，進而細胞發(fā)生衰亡、死亡而細胞發(fā)生衰亡、死亡(2) (2) 每代細胞的生長過程每代細胞的生長過程a.a.滯留期：包括游離期、貼壁期及潛伏期滯留期：包括游離期、貼壁期及潛伏期 游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)，游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)，也稱為懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形也稱為懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10min10min4h4h 貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。

4、貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在細胞株平均在1010分鐘一分鐘一5 5小時貼壁。血清中有促使小時貼壁。血清中有促使細胞貼壁的球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生細胞貼壁的球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再附著在吸附有促貼先吸附于底物上，懸浮細胞再附著在吸附有促貼壁因子的底物上。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)壁因子的底物上。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)以幫助細胞貼附。以幫助細胞貼附。 潛伏期：此時細胞有生長活動，而無細胞分潛伏期：此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為

5、裂。細胞株潛伏期一般為6 624h24h。b.b.指數(shù)生長期：指數(shù)生長期： 又稱對數(shù)期。此期間細胞增殖旺盛，成倍增又稱對數(shù)期。此期間細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。細胞生長長，活力最佳，最適合進行實驗研究。細胞生長增殖狀況可以依據(jù)細胞倍增情況增殖狀況可以依據(jù)細胞倍增情況( (細胞群體倍增時細胞群體倍增時間間) )及細胞分裂指數(shù)等來判斷。及細胞分裂指數(shù)等來判斷。(3(35 5天天) )c.c.生長停止期生長停止期( (平臺期平臺期) )： 此期可供細胞生長的底物面積已被生長的細此期可供細胞生長的底物面積已被生長的細胞所占滿，細胞雖尚有活力但已不再分裂增殖。胞所占滿，細胞雖尚

6、有活力但已不再分裂增殖。此時細胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動并可此時細胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動并可繼續(xù)存活一定的時間。繼續(xù)存活一定的時間。( (二二) ) 培養(yǎng)細胞生長的條件培養(yǎng)細胞生長的條件1 1 細胞的營養(yǎng)需要細胞的營養(yǎng)需要 a.a.基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、碳水化合物及一些基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、碳水化合物及一些無機離子無機離子 b.b.促生長因子等物質(zhì)促生長因子等物質(zhì) c.c.此外激素也可有助于細胞生長此外激素也可有助于細胞生長2 2 細胞的生存環(huán)境細胞的生存環(huán)境 a.a.溫度溫度: : 適宜的溫度與取材的動物種類有關(guān)適宜的溫度與取材的動物種類有關(guān) b.b.氣相及氣

7、相及pH:pH:一般氣體環(huán)境為一般氣體環(huán)境為95%95%空氣加空氣加5%CO25%CO2的混合氣的混合氣體。體。 pH: 7.2-7.4 pH: 7.2-7.4 。CO2CO2為細胞生長所需，同時又是細胞為細胞生長所需，同時又是細胞代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的代謝的產(chǎn)物，并與維持培養(yǎng)基的pHpH有關(guān)，有關(guān)， CO2CO2增加將使增加將使pHpH下降。下降。 3 3 滲透壓：因細胞的類型及種族而異。由于人類血漿的滲透滲透壓：因細胞的類型及種族而異。由于人類血漿的滲透壓約為壓約為290m mol/L290m mol/L，因此認為這是體外培養(yǎng)人類細胞的理，因此認為這是體外培養(yǎng)人類細胞的理想滲透壓。想

8、滲透壓。4 4 無污染及無毒：無毒是培養(yǎng)細胞的必須條件。凡與細胞直無污染及無毒：無毒是培養(yǎng)細胞的必須條件。凡與細胞直接接觸者接接觸者( (如培養(yǎng)瓶、底物、培養(yǎng)劑等如培養(yǎng)瓶、底物、培養(yǎng)劑等) )或間接接觸者或間接接觸者( (如如瓶蓋瓶塞等瓶蓋瓶塞等) )，若具細胞毒性，都會導(dǎo)致細胞的死亡。污，若具細胞毒性，都會導(dǎo)致細胞的死亡。污染問題包括細菌等微生物的污染、不同細胞類型的交叉污染問題包括細菌等微生物的污染、不同細胞類型的交叉污染及上述有害物質(zhì)的污染。染及上述有害物質(zhì)的污染。培養(yǎng)細胞所需的耗材和儀器培養(yǎng)細胞所需的耗材和儀器超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：

9、紫外線消毒。主要用于操作臺、塑料紫外燈：紫外線消毒。主要用于操作臺、塑料培養(yǎng)皿等表面消毒。培養(yǎng)皿等表面消毒。高壓滅菌鍋：濕熱消毒高壓滅菌鍋：濕熱消毒電熱干燥箱：干熱消毒電熱干燥箱：干熱消毒濾器：過濾除菌，濾器：過濾除菌，大多用于遇熱容易變性而失大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液效的試劑或培養(yǎng)液，包括人工合成培養(yǎng)基、血，包括人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用清、酶液等均采用0.22um0.22um濾膜過濾除菌。濾膜過濾除菌。 酸缸：玻璃儀器泡酸，出去蛋白酶酸缸：玻璃儀器泡酸，出去蛋白酶 4 4、-20-20冰箱冰箱，-80-80超低溫冰箱，液氮罐：用超低溫冰箱，液氮罐：用于儲存常用的溶液或

10、凍存細胞于儲存常用的溶液或凍存細胞 自動雙重純水蒸餾器，超純水儀：細胞培養(yǎng)用液自動雙重純水蒸餾器，超純水儀：細胞培養(yǎng)用液均需用超純水配制均需用超純水配制 耗材：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，移液管，移液器，凍存耗材：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，移液管，移液器，凍存管等管等 光學(xué)顯微鏡：定時觀察細胞的生長狀態(tài)。光學(xué)顯微鏡：定時觀察細胞的生長狀態(tài)。COCO2 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。箱內(nèi)滅菌蒸餾水，蒸餾水槽中保持3000毫升以保持箱內(nèi)濕度，避免培

11、養(yǎng)液蒸發(fā)。2 2、培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌、培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌玻璃：玻璃： 浸泡浸泡刷洗刷洗( (洗衣粉或洗潔精洗衣粉或洗潔精) )，流水，流水、蒸餾水沖干凈、蒸餾水沖干凈烘干烘干泡酸泡酸(12-24h )(12-24h )流水、單蒸雙蒸分別沖洗流水、單蒸雙蒸分別沖洗10-810-8次次高溫滅高溫滅菌后烘干備用菌后烘干備用酸缸成分酸缸成分: : 濃鹽酸濃鹽酸 25g25g，重鉻酸鉀，重鉻酸鉀 50cm50cm2 2，蒸餾水，蒸餾水 450cm450cm2 2塑料：塑料：a.a.濾器和注射器：清水、單雙蒸水分別沖洗濾器和注射器：清水、單雙蒸水分別沖洗烘烘干干b.b.多孔培養(yǎng)板：紫外照射多孔

12、培養(yǎng)板：紫外照射c.c.膠塞，瓶蓋等：流水、單蒸雙蒸分別沖洗膠塞，瓶蓋等：流水、單蒸雙蒸分別沖洗烘烘干干用雙蒸水煮沸用雙蒸水煮沸30min 30min 烘干烘干消毒滅菌：高溫濕熱滅菌消毒滅菌：高溫濕熱滅菌 玻璃玻璃：121 121 ，30min30min 塑料：塑料：115 115 ，15min15min細胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基培養(yǎng)用液培養(yǎng)用液a.a.水：蒸餾水或去離子水水：蒸餾水或去離子水b.b.平衡鹽溶液平衡鹽溶液(BSS)(BSS)：維持滲透壓、調(diào)節(jié)：維持滲透壓、調(diào)節(jié)pHpH值以及值以及供給細胞生存所需的能量和無機離子成分。主要供給細胞生存所需的能量和無機離子成分。主要作

13、為合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液及用于洗滌組織、細胞作為合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液及用于洗滌組織、細胞等。一般用等。一般用PBSPBS緩沖液緩沖液1 1PBSPBS配方：配方： KCl 0.2g KCl 0.2g，NaCl 8gNaCl 8g， KH KH2 2POPO4 4 0.2g 0.2g， NaNa2 2HPOHPO4 4.12H.12H2 2O 2.89gO 2.89g， 加蒸餾水定容至加蒸餾水定容至1000ml1000ml 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而

14、使細胞分離。胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。損傷細胞。 胰蛋白酶液消化時間：胰蛋白酶液消化時間：2-102-10分鐘。分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用。 胰蛋白酶配方：胰蛋白酶配方： 0.25g0.25g胰蛋白酶，胰蛋白酶，0.02g 0.02g EDTA EDTA 溶于溶于100ml 1100ml 1PBSPBS，過，過濾除菌。濾除菌。C C 消化液：消化液：培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的

15、溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。缺點：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。分析。 易發(fā)生支原體污染易發(fā)生支原體污染 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許數(shù)量，用人工方法模擬合成的。

16、目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如多種培養(yǎng)基，如TC199TC199、MEMMEM、-MEM-MEM、 DMEMDMEM等。等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低成本低 缺點：缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞胞 生長需要。生長需要。 人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基

17、（如血清）。繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 血清中含有：血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子多種金屬離子 激素；激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分不明成分 一般說來含一般說來含5 5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死但支持細胞生長一般需加維持細胞不死但支持細胞生長一般需加 1010血清血清 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血常用血清有胎牛血潔、新

18、生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以清、馬血清等，其中以胎牛血清胎牛血清質(zhì)量最好。質(zhì)量最好。 血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。染。 血清的滅活（消除補體活性）：血清的滅活（消除補體活性）：56 56 ，30 30 分鐘分鐘 血清的消毒：過濾除菌血清的消毒：過濾除菌 抗菌素的使用：抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。抑制可能存在的細菌的生長。 通

19、常是通常是青霉素和鏈霉素青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100100單位。單位。 完全培養(yǎng)基的組成完全培養(yǎng)基的組成 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8080一一9595 血清血清 5 5一一2020（一般加（一般加1010） 青、鏈霉素（雙抗）青、鏈霉素（雙抗） 1%1%三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù) 培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求 1 1、無菌操作、無菌操作一無菌操作）無菌操作一無菌操作）無菌操作 操作間消毒：紫外線燈操作間消毒：紫外線燈 30-5030-50分鐘分鐘 （工作臺）（工作臺）

20、洗手和著裝洗手和著裝 ：75%75%酒精酒精 火焰消毒火焰消毒 ：酒精燈或煤氣燈：酒精燈或煤氣燈 2 2、基本培養(yǎng)操作技術(shù)、基本培養(yǎng)操作技術(shù) 細胞換液細胞換液 1 1、提前將所需儀器試劑放入超凈工作臺滅菌、提前將所需儀器試劑放入超凈工作臺滅菌30min30min以上以上 2 2、吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基（從皿兩側(cè)吸取、吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基（從皿兩側(cè)吸?。?3 3、加入、加入3mlPBS3mlPBS清洗細胞，從兩側(cè)注入，緩慢清洗細胞，從兩側(cè)注入，緩慢晃動晃動1-2min1-2min 4 4、吸去、吸去PBSPBS，加入，加入5-8ml5-8ml培養(yǎng)基培養(yǎng)基 5 5、在顯微鏡下觀察細胞長勢后，放入

21、培養(yǎng)箱、在顯微鏡下觀察細胞長勢后，放入培養(yǎng)箱中中細胞傳代細胞傳代貼壁生長細胞傳代方法貼壁生長細胞傳代方法 吸去舊的培養(yǎng)基，加入吸去舊的培養(yǎng)基，加入3ml PBS 3ml PBS 清洗清洗1-2min1-2min 吸去吸去PBSPBS后，加入后，加入1ml 0.25%1ml 0.25%胰酶消化胰酶消化2min2min 顯微鏡下觀察細胞，待細胞由梭形變成圓形后，小心吸去顯微鏡下觀察細胞，待細胞由梭形變成圓形后，小心吸去胰蛋白酶液，加入胰蛋白酶液，加入2-3ml2-3ml含含10%10%血清的培養(yǎng)基終止消化血清的培養(yǎng)基終止消化 用移液槍吹打培養(yǎng)皿底部，使消化后的細胞從皿壁上脫落用移液槍吹打培養(yǎng)皿底部

22、，使消化后的細胞從皿壁上脫落下來下來 吹打混勻后用移液槍將一部分液體移入另一滅菌干凈培養(yǎng)吹打混勻后用移液槍將一部分液體移入另一滅菌干凈培養(yǎng)皿中皿中 分別向兩個皿中加入分別向兩個皿中加入4-6ml4-6ml培養(yǎng)基，搖勻后培養(yǎng)培養(yǎng)基，搖勻后培養(yǎng) 細胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進行常規(guī)檢細胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天進行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量查和顯微鏡觀察，及時了解細胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細胞形態(tài)、細胞有無移動、有無污染、培改變、細胞形態(tài)、細胞有無移動、有無污染、培養(yǎng)液養(yǎng)液pHpH是否變酸、變黃是否更換等。是否變酸、變黃是否更換等。 3 3、培養(yǎng)細胞生長狀況的觀察、培養(yǎng)細胞生長

23、狀況的觀察4 4、細胞凍存和復(fù)蘇、細胞凍存和復(fù)蘇低溫液氮冷凍貯存低溫液氮冷凍貯存 ：-196 -196 原理：原理： 10%10%的的DMSODMSO或甘油或甘油要點：慢凍快融要點：慢凍快融細胞凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融細胞凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 凍存方法（1 1）預(yù)先配制凍存液：）預(yù)先配制凍存液：80%80%含血清培養(yǎng)基含血清培養(yǎng)基+10%DMSO+10%+10%DMSO+10%血清血清（2 2）吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基，加）吸去培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)基，加3mlPBS3mlPBS清洗細胞約清洗細胞約1min1min，棄去，棄去PBSPBS（3 3）加入）加入1ml1ml胰酶消化胰酶消化2-3m

24、in2-3min，觀察細胞貼壁情況。待細胞變圓后，小，觀察細胞貼壁情況。待細胞變圓后，小心吸去胰酶，加入心吸去胰酶，加入3ml3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化含血清的培養(yǎng)基終止消化（4 4）將）將3ml3ml的帶細胞培養(yǎng)基加入兩個的帶細胞培養(yǎng)基加入兩個1.5mlEP1.5mlEP管中，管中，4 4,1000rmp,1000rmp，離心，離心5min5min，棄上清，棄上清（5 5）吸取）吸取1ml1ml凍存液加入一個凍存液加入一個EPEP管中小心吹散細胞，后加入另一個管中小心吹散細胞，后加入另一個EPEP管管中吹散細胞，兩中吹散細胞，兩EPEP管細胞合在一起，加入管細胞合在一起，加入2ml2ml凍存管中充分混勻凍存管中充分混勻（6 6）封口：擰緊瓶蓋，膠布封好口端，并寫明細胞種類、時間、代數(shù)。）封口：擰緊瓶蓋，膠布封好口端，并寫明細胞種類、時間、代數(shù)。（7 7）凍存：）凍