第3章菌種選育理論與技術(shù)

1、發(fā)發(fā) 酵酵 工工 藝藝 學(xué)學(xué) Technology of Fermentation理論授課內(nèi)容及學(xué)時(shí)分配理論授課內(nèi)容及學(xué)時(shí)分配第第1 1章章 緒論（緒論（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第2 2章章 發(fā)酵設(shè)備（發(fā)酵設(shè)備（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第3 3章章 菌種選育理論與技術(shù)（菌種選育理論與技術(shù)（3 3學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第4 4章章 培養(yǎng)基、滅菌與除菌（培養(yǎng)基、滅菌與除菌（3 3學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第5 5章章 生產(chǎn)菌種的制備與保藏（生產(chǎn)菌種的制備與保藏（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第6 6章章 發(fā)酵過(guò)程的供氧（發(fā)酵過(guò)程的供氧（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第7 7章章 發(fā)酵過(guò)程的控制（發(fā)酵過(guò)程的控制（4 4學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第8 8章章

2、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（次生代謝產(chǎn)物的生物合成（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 第第9 9章章 抗生素發(fā)酵工藝（抗生素發(fā)酵工藝（3 3學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第1010章章 氨基酸與核苷酸發(fā)酵（氨基酸與核苷酸發(fā)酵（3 3學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第1 11 1章章 維生素與核苷酸（維生素與核苷酸（3 3學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第1 12 2章章 酶制劑發(fā)酵工藝酶制劑發(fā)酵工藝（3 3學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）第第1 13 3章章 研究進(jìn)展和課程總結(jié)（研究進(jìn)展和課程總結(jié)（2 2學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)） 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)第三章第三章 菌種選育理論與技術(shù)菌種選育理論與技術(shù) 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)南陽(yáng)師范學(xué)院南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 本章主要內(nèi)容

3、本章主要內(nèi)容v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 自然選育自然選育v第三節(jié)第三節(jié) 誘變育種誘變育種v第四節(jié)第四節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù)育種原生質(zhì)體技術(shù)育種v第五節(jié)第五節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)理想發(fā)酵工業(yè)用菌要求理想發(fā)酵工業(yè)用菌要求1、遺傳性狀穩(wěn)定；、遺傳性狀穩(wěn)定；2、生長(zhǎng)速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；、生長(zhǎng)速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；3、目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理想轉(zhuǎn)化率；、目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理想轉(zhuǎn)化率；4、最好是胞外產(chǎn)物；、最好是胞外產(chǎn)物；5、盡可能減少產(chǎn)物類似物的生成；、盡可能減少產(chǎn)物類似物的生成；6、培養(yǎng)基簡(jiǎn)單、來(lái)源廣、價(jià)格低；、培養(yǎng)基

4、簡(jiǎn)單、來(lái)源廣、價(jià)格低；7、對(duì)、對(duì)T、pH、離子強(qiáng)度、剪切力不敏感；、離子強(qiáng)度、剪切力不敏感；8、溶氧要求低、便于培養(yǎng)能耗低；、溶氧要求低、便于培養(yǎng)能耗低；本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 菌種分離篩選菌種分離篩選v第三節(jié)第三節(jié) 自然選育自然選育v第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種v第五節(jié)第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù)育種原生質(zhì)體技術(shù)育種v第六節(jié)第六節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v一、菌種選育的目的一、菌種選育的目的v二、菌種選育的基本理論二、菌種選育的基本理論第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)菌種選育是一門應(yīng)用科

5、學(xué)技術(shù),其理論基礎(chǔ)是其理論基礎(chǔ)是微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)等微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)等,而其研究目的是微生而其研究目的是微生物產(chǎn)品的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和發(fā)展新品種為生產(chǎn)不斷地提物產(chǎn)品的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和發(fā)展新品種為生產(chǎn)不斷地提供優(yōu)良菌種供優(yōu)良菌種,從而促進(jìn)生產(chǎn)發(fā)展。從而促進(jìn)生產(chǎn)發(fā)展。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、菌種選育的目的一、菌種選育的目的 在正常生理?xiàng)l件下，微生物依靠其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，趨向于快速在正常生理?xiàng)l件下，微生物依靠其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，趨向于快速生長(zhǎng)和繁殖。但發(fā)酵工業(yè)需要培養(yǎng)微生物使其積累大量的代謝產(chǎn)物。生長(zhǎng)和繁殖。但發(fā)酵工業(yè)需要培養(yǎng)微生物使其積累大量的代謝產(chǎn)物。所以要采取種種措施打破菌的正常代謝，積累所需要的代謝

6、產(chǎn)物。所以要采取種種措施打破菌的正常代謝，積累所需要的代謝產(chǎn)物。如青霉素的原始菌種產(chǎn)黃色素，經(jīng)菌種選育，可使產(chǎn)生菌不再分泌如青霉素的原始菌種產(chǎn)黃色素，經(jīng)菌種選育，可使產(chǎn)生菌不再分泌黃色素。土霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生大量泡沫，經(jīng)誘變處理改變遺傳特性可黃色素。土霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生大量泡沫，經(jīng)誘變處理改變遺傳特性可使泡沫減少，節(jié)省大量消泡劑。菌種經(jīng)誘變獲得抗使泡沫減少，節(jié)省大量消泡劑。菌種經(jīng)誘變獲得抗phage的特性。的特性。 菌種選育的目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求菌種選育的目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求 菌種選育的目的是菌種選育的目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。改良菌

7、種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、菌種選育的目的一、菌種選育的目的1. 提高發(fā)酵產(chǎn)量提高發(fā)酵產(chǎn)量2. 改進(jìn)菌種的性能改進(jìn)菌種的性能3. 產(chǎn)生新的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生新的發(fā)酵產(chǎn)物4. 去除多余的組分去除多余的組分(二二)科研科研(一一)生產(chǎn)生產(chǎn)1. 了解菌種遺傳背景了解菌種遺傳背景2. 提供分子遺傳學(xué)研究材料提供分子遺傳學(xué)研究材料3. 獲得帶遺傳標(biāo)記的菌株獲得帶遺傳標(biāo)記的菌株4. 生物合成途徑的研究生物合成途徑的研究5. 生物合成機(jī)制的研究生物合成機(jī)制的研究第一節(jié)第一節(jié) 概述概述二、菌種選育的基本理論二、菌種選育的基本理論1. 遺傳與變異遺傳與變異2. 遺傳與變異的物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳

8、與變異的物質(zhì)基礎(chǔ)3. 基因突變的本質(zhì)和遺傳變異的類型基因突變的本質(zhì)和遺傳變異的類型4. 突變的過(guò)程突變的過(guò)程5. 突變后的表型變化突變后的表型變化6. 表型延遲表型延遲本章主要內(nèi)容v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 菌種分離篩選菌種分離篩選v第三節(jié)第三節(jié) 自然選育自然選育v第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種v第五節(jié)第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù)育種原生質(zhì)體技術(shù)育種v第六節(jié)第六節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)第二節(jié)第二節(jié) 菌種的分離篩選菌種的分離篩選 一、菌種的來(lái)源一、菌種的來(lái)源v根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或

9、購(gòu)買；或菌種保藏部門索取或購(gòu)買；v從大自然中分離篩選新的微生物菌種。從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 二、分離思路二、分離思路 v1. 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來(lái)。把所需要的菌種挑選出來(lái)。v2. 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。進(jìn)行分離純化。 v3. 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理

10、先進(jìn)的設(shè)備與之配合。的設(shè)備與之配合。v定方案：定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。v采樣：采樣：有針對(duì)性地采集樣品。有針對(duì)性地采集樣品。v增殖：增殖：人為地通過(guò)控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，人為地通過(guò)控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。v分離篩選：分離篩選：采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的菌。采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的菌。v發(fā)酵性能測(cè)定：發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周

11、期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、最適最適pH值、提取工藝等。值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟三、新種分離與篩選的步驟 （一）采樣一）采樣1、采樣對(duì)象、采樣對(duì)象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土中，以以采集土壤為主。一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物

12、品，某些水域等。可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選從自然界篩選v2、采樣季節(jié)：、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。以溫度適中，雨量不多的秋初為好。v3、采土方式：、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面取離地面5-15 cm處的土約處的土約10 g，盛入清潔的牛皮紙袋或，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分

13、離?；藢悠分鸩椒峙幕兀员慵皶r(shí)分離。采取土壤樣品要考慮的幾個(gè)問(wèn)題采取土壤樣品要考慮的幾個(gè)問(wèn)題v土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細(xì)菌多，放線菌少；土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細(xì)菌多，放線菌少；在植物殘?bào)w枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。在植物殘?bào)w枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。v離地面離地面520cm處的土壤通氣良好、不受陽(yáng)光直射，含菌量最高。處的土壤通氣良好、不受陽(yáng)光直射，含菌量最高。v采土季節(jié)以春秋兩季最好。采土季節(jié)以春秋兩季最好。v采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)、鏟除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)、鏟除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事先準(zhǔn)備的無(wú)菌防水紙

14、袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點(diǎn)、植被情先準(zhǔn)備的無(wú)菌防水紙袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點(diǎn)、植被情況等。況等。v多點(diǎn)采土、混合分離，可以代表每一地塊上的微生物分布平均多點(diǎn)采土、混合分離，可以代表每一地塊上的微生物分布平均情況情況（二）增殖培養(yǎng)（二）增殖培養(yǎng)v含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng)v如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培養(yǎng)使之以如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長(zhǎng)繁殖，從而提高它們?cè)跇悠分械谋壤?，便于較其它微生物更快的速度生長(zhǎng)繁殖，從而提高它們?cè)跇悠分械谋壤?，便于分離。分離。v富集培養(yǎng)的

15、一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無(wú)關(guān)微生物的營(yíng)養(yǎng)和富集培養(yǎng)的一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無(wú)關(guān)微生物的營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件，以達(dá)到使目的菌種在群體中比例上升的目的。培養(yǎng)條件，以達(dá)到使目的菌種在群體中比例上升的目的。v 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利

16、得多。v一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過(guò)大量艱苦的工作一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過(guò)大量艱苦的工作篩選取得。篩選取得。某些細(xì)菌的富集條件某些細(xì)菌的富集條件 富集對(duì)象富集對(duì)象 接種菌樣接種菌樣添加營(yíng)養(yǎng)物添加營(yíng)養(yǎng)物(g)特殊培養(yǎng)條件特殊培養(yǎng)條件好氧氨基酸氧化菌好氧氨基酸氧化菌土壤土壤好氧，好氧，pH7.0好氧性芽孢桿菌好氧性芽孢桿菌土壤，巴氏消毒土壤，巴氏消毒 好氧，好氧，pH7.0氨基酸發(fā)酵性梭菌氨基酸發(fā)酵性梭菌土壤，巴氏消毒土壤，巴氏消毒 厭氧，厭氧，pH7.0耐堿解尿素芽孢菌耐堿解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒土壤，巴氏消毒 尿素尿素50 好氧，好氧，pH8.

17、6 厭氧八疊球菌厭氧八疊球菌土壤土壤 葡萄糖葡萄糖20厭氧，厭氧，pH23 乳酸菌乳酸菌植物體或牛奶植物體或牛奶 葡萄糖葡萄糖20厭氧，厭氧，pH6.5 腸道細(xì)菌腸道細(xì)菌土壤或污水土壤或污水葡萄糖葡萄糖20，CaCO320好氧或厭氧，好氧或厭氧， pH7.0 丙酸菌丙酸菌干酪干酪 乳酸鈉乳酸鈉20厭氧，厭氧，pH7.0 醋酸菌醋酸菌果實(shí)或生啤酒果實(shí)或生啤酒 乙醇乙醇40 好氧，好氧，pH6.0注：培養(yǎng)基成分為酵母膏注：培養(yǎng)基成分為酵母膏10g，KH2PO4或或K2HPO4 1.0g，MgSO47H2O 0.2g，加水，加水1000ml。一般培養(yǎng)在。一般培養(yǎng)在30下。下。（三）培養(yǎng)分離（三）培養(yǎng)

18、分離v 盡管通過(guò)增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混盡管通過(guò)增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分劃線分離法、稀釋分離法。離法。稀釋分離法稀釋分離法 稀釋倒稀釋倒 平板法平板法 平板平板 涂布法涂布法注意：必須要做多個(gè)濃度的稀釋分離平板。注意：必須要做多個(gè)濃度的稀釋分離平板。劃線分離法劃線分離法平板劃線法平板劃線法（四）篩（四）篩

19、 選選1、初篩：、初篩：從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)微生物從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)微生物 篩選出來(lái)的過(guò)程。篩選出來(lái)的過(guò)程。常用的初選方法：常用的初選方法： 水解酶產(chǎn)生菌的篩選：水解酶產(chǎn)生菌的篩選： 將酶的作用底物加在培將酶的作用底物加在培 養(yǎng)基中，接種后適溫培養(yǎng)基中，接種后適溫培 養(yǎng)，根據(jù)菌苔周圍是否養(yǎng)，根據(jù)菌苔周圍是否 產(chǎn)生水解圈篩選出水解產(chǎn)生水解圈篩選出水解 酶產(chǎn)生菌。酶產(chǎn)生菌。一般采用平板篩選。一般采用平板篩選。 拮抗菌的篩選拮抗菌的篩選對(duì)峙培養(yǎng)：對(duì)峙培養(yǎng)： 將病原指示菌與待測(cè)菌株將病原指示菌與待測(cè)菌株 相對(duì)接種在平板上適溫培相對(duì)接種在平板上適溫培 養(yǎng)，根據(jù)病原菌的生長(zhǎng)情養(yǎng)，

20、根據(jù)病原菌的生長(zhǎng)情 況篩選出拮抗性菌株。況篩選出拮抗性菌株。分初篩、復(fù)篩。分初篩、復(fù)篩。2）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測(cè)菌株進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，?。u瓶發(fā)酵篩選：將待測(cè)菌株進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，取 發(fā)酵濾液進(jìn)行活力測(cè)定。發(fā)酵濾液進(jìn)行活力測(cè)定。2、復(fù)篩：、復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步鑒定有希望菌株的在初篩的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步鑒定有希望菌株的 生產(chǎn)能力強(qiáng)弱的過(guò)程。生產(chǎn)能力強(qiáng)弱的過(guò)程。 復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法 進(jìn)行測(cè)定。進(jìn)行測(cè)定。 復(fù)篩過(guò)程中，要結(jié)合培養(yǎng)條件進(jìn)行。復(fù)篩過(guò)程中，要結(jié)合培養(yǎng)條件進(jìn)行。 培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)基培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)基 pH值值 發(fā)酵

21、溫度發(fā)酵溫度 供氧量等。供氧量等。（五）菌種鑒定（五）菌種鑒定v 經(jīng)典分類鑒定方法：經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特形態(tài)特征、生理生化特征、血清學(xué)試驗(yàn)等。征、血清學(xué)試驗(yàn)等。v現(xiàn)代分類鑒定方法：現(xiàn)代分類鑒定方法：遺傳特性、細(xì)胞化學(xué)組遺傳特性、細(xì)胞化學(xué)組分、計(jì)算機(jī)數(shù)值分析。分、計(jì)算機(jī)數(shù)值分析。（五）毒性試驗(yàn)（五）毒性試驗(yàn)v 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中

22、除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過(guò)兩年以上毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗(yàn)。的毒性試驗(yàn)。本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 菌種分離篩選菌種分離篩選v第三節(jié)第三節(jié) 自然選育自然選育v第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種v第五節(jié)第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù)育種原生質(zhì)體技術(shù)育種v第六節(jié)第六節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué) 3. 自然選育自然選育 目前菌種選育常采用目前菌種選育常采用自然選育自然選育和和誘變育種誘變育種等方

23、法，帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育等方法，帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。隨著微生物學(xué)、生化遺傳學(xué)的發(fā)種的范疇。隨著微生物學(xué)、生化遺傳學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了展，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法。等較為定向的育種方法。 在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工處理，利用菌種的自然突變?cè)谏a(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工處理，利用菌種的自然突變而進(jìn)行菌種篩選的過(guò)程叫做而進(jìn)行菌種篩選的過(guò)程叫做自然選育自然選育。 所謂所謂自然突變自然突變: 是指某些微生物在沒(méi)有人工參與下所是指某些微生物在沒(méi)有人工參與下所發(fā)生的那些突變。發(fā)生的那些突變。 一般認(rèn)為

24、引起自然突變有兩個(gè)原因一般認(rèn)為引起自然突變有兩個(gè)原因：3.1 自然選育的概念自然選育的概念多因素低劑量的誘變效應(yīng)多因素低劑量的誘變效應(yīng)互變異構(gòu)效應(yīng)互變異構(gòu)效應(yīng) 3.1 自然選育的概念自然選育的概念菌種的自然突變往往有兩種可能性菌種的自然突變往往有兩種可能性:菌種衰退，生產(chǎn)性能下降菌種衰退，生產(chǎn)性能下降;代謝更加旺盛，生產(chǎn)性能提高。代謝更加旺盛，生產(chǎn)性能提高。v所謂所謂多因素低劑量的誘變效應(yīng)多因素低劑量的誘變效應(yīng)，是指自然突變，是指自然突變實(shí)質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引實(shí)質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長(zhǎng)期綜合效應(yīng)起的長(zhǎng)期綜合效應(yīng)。v所謂所謂互變異構(gòu)效應(yīng)互變異構(gòu)效應(yīng)是指四種堿

25、基的是指四種堿基的第六位第六位上的上的酮基和酮基和氨基氨基，胸腺嘧啶（，胸腺嘧啶（T）和鳥嘌呤（）和鳥嘌呤（G）可以酮式或烯醇）可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶（式出現(xiàn)，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亞）可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)。平衡一般傾向于酮式和氨基式。堿基對(duì)氨基式出現(xiàn)。平衡一般傾向于酮式和氨基式。堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率約為發(fā)生自然突變的機(jī)率約為108一一109。1 1. .采樣采樣2 2. .增殖增殖3 3. .純化純化4 4. .性能鑒定性能鑒定調(diào)查研究，查閱資料調(diào)查研究，查閱資料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案確定樣品的生態(tài)環(huán)境、季節(jié)確定樣品的生態(tài)環(huán)境、季節(jié)選擇和地點(diǎn)選擇選

26、擇和地點(diǎn)選擇采樣采樣增殖培養(yǎng)增殖培養(yǎng)(1)控制營(yíng)養(yǎng)成分控制營(yíng)養(yǎng)成分(2)控制控制pH(3)溫度控制溫度控制3.2 自然選育的一般過(guò)程自然選育的一般過(guò)程純種分離純種分離(1)稀釋法稀釋法(2)劃線法劃線法(3)組織分離組織分離原種斜面原種斜面篩選篩選(1)紙片培養(yǎng)顯色法紙片培養(yǎng)顯色法(2)透明圈法透明圈法(3)變色圈法變色圈法(4)生長(zhǎng)圈法生長(zhǎng)圈法(5)抑菌圈法抑菌圈法復(fù)篩復(fù)篩再?gòu)?fù)篩再?gòu)?fù)篩35株株性能鑒定性能鑒定發(fā)酵發(fā)酵pH、T、通風(fēng)、攪拌、無(wú)菌程度、適應(yīng)性、通風(fēng)、攪拌、無(wú)菌程度、適應(yīng)性、副產(chǎn)品和對(duì)低劣廉價(jià)原料的利用副產(chǎn)品和對(duì)低劣廉價(jià)原料的利用毒性實(shí)驗(yàn)毒性實(shí)驗(yàn)菌種鑒定菌種鑒定自然選育操作步驟：自

27、然選育操作步驟： 一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞單細(xì)胞(孢子孢子)懸液的制備懸液的制備平板分離平板分離挑選單菌落挑選單菌落發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育發(fā)酵高產(chǎn)菌種的選育注意形態(tài)的觀察注意形態(tài)的觀察選擇性培養(yǎng)法選擇性培養(yǎng)法隨機(jī)分離法隨機(jī)分離法平板劃線法平板劃線法平板稀釋法平板稀釋法本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 菌種分離篩選菌種分離篩選v第三節(jié)第三節(jié) 自然選育自然選育v第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種v第五節(jié)第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù)育種原生質(zhì)體技術(shù)育種v第六節(jié)第六節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種 發(fā)酵工藝

28、學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)4.l 誘變育種的基本原理誘變育種的基本原理 誘變育種的理論基礎(chǔ)是誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變基因突變，所謂突變是指由于染色，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。突變主要包括突變主要包括染色體畸變?nèi)旧w畸變和和基因突變基因突變二大類。二大類。 （1）染色體畸變?nèi)旧w畸變是指染色體或是指染色體或DNA片斷的缺失、易位、逆位、片斷的缺失、易位、逆位、重復(fù)等。重復(fù)等。 （2）基因突變基因突變是指是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的某一部位發(fā)生變化分子結(jié)構(gòu)中的某一部位發(fā)生變化（又稱點(diǎn)突變）。（又稱點(diǎn)突變）。4. 誘變育種誘變育種 根據(jù)突

29、變發(fā)生的原因又可分為根據(jù)突變發(fā)生的原因又可分為自然突變自然突變和和誘發(fā)突變誘發(fā)突變。 誘發(fā)突變誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學(xué)的和生因突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學(xué)的和生物的三大類。經(jīng)誘變處理后，微生物的遺傳物質(zhì)、物的三大類。經(jīng)誘變處理后，微生物的遺傳物質(zhì)、DNA和和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物的遺傳變的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物的遺傳變異。異。用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為稱為誘變育種。誘變育種。誘變劑

30、：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑誘變劑誘變劑物理：紫外，快中子，射線，激光物理：紫外，快中子，射線，激光化學(xué)：硫酸二乙酯（化學(xué)：硫酸二乙酯（DES），亞硝基胍（），亞硝基胍（NTG）生物：噬菌體，轉(zhuǎn)座子生物：噬菌體，轉(zhuǎn)座子誘變劑誘變劑誘變劑處理過(guò)程中幾個(gè)有關(guān)的問(wèn)題誘變劑處理過(guò)程中幾個(gè)有關(guān)的問(wèn)題 化學(xué)誘變劑使用過(guò)程的安全性化學(xué)誘變劑使用過(guò)程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇誘變劑的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇壓硝酸：壓硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亞硝基胍：亞硝基胍：1MNaOH1MNaOH誘變育

31、種一般包括誘變育種一般包括誘變和篩選誘變和篩選兩個(gè)部分。兩個(gè)部分。誘變誘變部分成功的關(guān)鍵包括出發(fā)菌株的選擇、誘部分成功的關(guān)鍵包括出發(fā)菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法。變劑種類和劑量的選擇，以及合理的使用方法。篩選篩選部分包括初篩和復(fù)篩來(lái)測(cè)定菌種的生產(chǎn)能部分包括初篩和復(fù)篩來(lái)測(cè)定菌種的生產(chǎn)能力。力。誘變育種是誘變和篩選過(guò)程的不斷重復(fù)，直到誘變育種是誘變和篩選過(guò)程的不斷重復(fù)，直到達(dá)到達(dá)到高產(chǎn)菌株高產(chǎn)菌株。4.2 誘變育種的一般步驟誘變育種的一般步驟 1、出發(fā)菌株的選擇、出發(fā)菌株的選擇 自然界直接分離到的野生型菌株自然界直接分離到的野生型菌株 經(jīng)歷過(guò)生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株經(jīng)歷過(guò)生產(chǎn)條

32、件考驗(yàn)的菌株 已經(jīng)歷多次育種處理的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株步步 驟驟2、制備菌懸液、制備菌懸液v待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件；環(huán)境條件；v盡可能選擇孢子或單倍體細(xì)胞作為誘變對(duì)象，避免表型延遲。盡可能選擇孢子或單倍體細(xì)胞作為誘變對(duì)象，避免表型延遲。v表型延遲就是指某一突變?cè)诒硇脱舆t就是指某一突變?cè)贒NA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在細(xì)復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在細(xì)胞表型上顯示出來(lái)，造成不純的菌落。胞表型上顯示出來(lái)，造成不純的菌落。3、誘變處理、誘變處理v根據(jù)誘變劑用量對(duì)菌體致死率的曲線選擇合適的處理劑量。根據(jù)誘變劑用量對(duì)菌

33、體致死率的曲線選擇合適的處理劑量。v一般突變率隨誘變劑量的增大而增高，但達(dá)到一定劑量后，一般突變率隨誘變劑量的增大而增高，但達(dá)到一定劑量后，突變率會(huì)下降。突變率會(huì)下降。4、突變菌株的篩選、突變菌株的篩選（1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選v 生物合成途徑的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不生物合成途徑的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。（2）抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙甑暮Y選）抗反饋?zhàn)瓒艉涂狗答佉种仆蛔兙甑暮Y選v 調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不能再

34、和終產(chǎn)物結(jié)合調(diào)節(jié)基因或操縱基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不能再和終產(chǎn)物結(jié)合或結(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因，因此不再起反饋?zhàn)瓒糇饔茫换蚪Y(jié)合后不能作用于已突變的操縱基因，因此不再起反饋?zhàn)瓒糇饔茫籿編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力但仍編碼酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使變構(gòu)酶不再具有結(jié)合終產(chǎn)物的能力但仍具有催化活性，從而解除了反饋抑制。具有催化活性，從而解除了反饋抑制。v抗反饋突變株一般通過(guò)抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選?？狗答佂蛔冎暌话阃ㄟ^(guò)抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選。v營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株中也可獲得抗反饋突變株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株中也可獲得抗反饋突變株。（3）組成型突變株的

35、篩選）組成型突變株的篩選v分批限量加入誘導(dǎo)物法，解除菌株對(duì)誘導(dǎo)物的依賴分批限量加入誘導(dǎo)物法，解除菌株對(duì)誘導(dǎo)物的依賴v交替培養(yǎng)法交替培養(yǎng)法（4）抗性突變株的篩選）抗性突變株的篩選v抗生素抗性突變抗生素抗性突變v抗噬菌體菌株的選育抗噬菌體菌株的選育v條件抗性突變條件抗性突變v敏感突變敏感突變誘變育種的一般步驟示意圖誘變育種的一般步驟示意圖出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇制備菌懸液制備菌懸液誘變處理誘變處理突變菌株的篩選突變菌株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選抗反饋?zhàn)璧K和抗反饋抑制突變菌株抗反饋?zhàn)璧K和抗反饋抑制突變菌株的篩選的篩選組成型突變株的篩選組成型突變株的篩選抗性突變株的篩選

36、抗性突變株的篩選自然界直接分離到的野生型菌株自然界直接分離到的野生型菌株經(jīng)歷過(guò)生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株經(jīng)歷過(guò)生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株隨隨機(jī)機(jī)篩篩選選形形態(tài)態(tài)理理化化性性質(zhì)質(zhì)2.2.3 誘變育種工作中幾個(gè)應(yīng)注意的問(wèn)題誘變育種工作中幾個(gè)應(yīng)注意的問(wèn)題A 選擇好出發(fā)菌株選擇好出發(fā)菌株 選好出發(fā)菌株對(duì)誘變效果有著極其重要的作用。有些微選好出發(fā)菌株對(duì)誘變效果有著極其重要的作用。有些微生物比較穩(wěn)定，其遺傳物質(zhì)耐誘變劑的作用強(qiáng)。如果用這種生物比較穩(wěn)定，其遺傳物質(zhì)耐誘變劑的作用強(qiáng)。如果用這種菌株于生產(chǎn)是很有益的，而用作出發(fā)菌株則不適宜。菌株于生產(chǎn)是很有益的，而用作出發(fā)菌株則不

37、適宜。 用作誘變的出發(fā)菌株必須對(duì)它的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方用作誘變的出發(fā)菌株必須對(duì)它的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當(dāng)了解。挑選出發(fā)菌株的標(biāo)準(zhǔn)是面有相當(dāng)了解。挑選出發(fā)菌株的標(biāo)準(zhǔn)是產(chǎn)量高、對(duì)誘變劑的產(chǎn)量高、對(duì)誘變劑的敏感性大、變異幅度廣敏感性大、變異幅度廣，再確定誘變劑的使用及篩選條件。，再確定誘變劑的使用及篩選條件。 B 復(fù)合誘變因素的使用復(fù)合誘變因素的使用 在微生物誘變育種中，可利用各種物理、化學(xué)在微生物誘變育種中，可利用各種物理、化學(xué)誘變因素來(lái)處理菌種。對(duì)野生型菌株單誘變因素有誘變因素來(lái)處理菌種。對(duì)野生型菌株單誘變因素有時(shí)也能取得好的效果，但對(duì)老菌種單一誘變因素重時(shí)也能取得好的效果，但對(duì)老菌種單

38、一誘變因素重復(fù)使用突變的效果不高，這時(shí)可利用復(fù)使用突變的效果不高，這時(shí)可利用復(fù)合因素復(fù)合因素來(lái)擴(kuò)來(lái)擴(kuò)大誘變幅度，提高誘變效果。大誘變幅度，提高誘變效果。C 劑量選擇劑量選擇 各種誘變因素有它們各自的誘變劑量單位，如紫外線各種誘變因素有它們各自的誘變劑量單位，如紫外線劑量單位用焦耳，劑量單位用焦耳，x一射線劑量單位是庫(kù)（侖）每千克，一射線劑量單位是庫(kù)（侖）每千克，中子劑量單位是戈。中子劑量單位是戈。 化學(xué)誘變因素一般是以溶液濃度來(lái)計(jì)算劑量單位的?；瘜W(xué)誘變因素一般是以溶液濃度來(lái)計(jì)算劑量單位的。對(duì)不同微生物使用的劑量是不同的，致死率取決于誘變對(duì)不同微生物使用的劑量是不同的，致死率取決于誘變劑量，而劑

39、量，而致死率和變異率致死率和變異率之間有一定關(guān)系。因此之間有一定關(guān)系。因此可以用可以用致死率作為選擇適宜劑量的依據(jù)致死率作為選擇適宜劑量的依據(jù)。D 變異菌株的篩選變異菌株的篩選 誘變育種工作的一個(gè)主要任務(wù)是獲得高產(chǎn)變異誘變育種工作的一個(gè)主要任務(wù)是獲得高產(chǎn)變異菌株。從經(jīng)誘變的大量個(gè)體中挑選優(yōu)良菌種不是一菌株。從經(jīng)誘變的大量個(gè)體中挑選優(yōu)良菌種不是一件容易的事。因?yàn)椴煌木N表現(xiàn)的變異形式是不件容易的事。因?yàn)椴煌木N表現(xiàn)的變異形式是不同的，從一個(gè)菌種的變異規(guī)律去發(fā)現(xiàn)那些與產(chǎn)量有同的，從一個(gè)菌種的變異規(guī)律去發(fā)現(xiàn)那些與產(chǎn)量有關(guān)的特性，并根據(jù)這些特性，分門別類地挑選一定關(guān)的特性，并根據(jù)這些特性，分門別類

40、地挑選一定數(shù)最的典型菌株進(jìn)行發(fā)酵和鑒定，以確定各種數(shù)最的典型菌株進(jìn)行發(fā)酵和鑒定，以確定各種類型類型與產(chǎn)量與產(chǎn)量之間的關(guān)系。這樣，可大大提高篩選的工作之間的關(guān)系。這樣，可大大提高篩選的工作效率。效率。E 高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合 在誘變育種過(guò)程中高產(chǎn)菌株的獲得還必須有合適在誘變育種過(guò)程中高產(chǎn)菌株的獲得還必須有合適的的篩選條件的配合篩選條件的配合。 誘變與篩選可以說(shuō)是一個(gè)問(wèn)題的兩個(gè)方面，必須用誘變與篩選可以說(shuō)是一個(gè)問(wèn)題的兩個(gè)方面，必須用辯證的觀點(diǎn)來(lái)看待。辯證的觀點(diǎn)來(lái)看待。 總之，在誘變育種過(guò)程中要正確處理出發(fā)菌株，誘總之，在誘變育種過(guò)程中要正確處理出發(fā)菌株，

41、誘變因素和篩選條件三者的關(guān)系。變因素和篩選條件三者的關(guān)系。2.2.4 幾種常見的物理、化學(xué)誘變劑的使用方法幾種常見的物理、化學(xué)誘變劑的使用方法1）物理誘變劑：）物理誘變劑：紫外線、紫外線、X射線、射線、射線，快中子；射線，快中子； 電離輻射特點(diǎn)：電離輻射特點(diǎn)： 導(dǎo)致導(dǎo)致DNA斷裂缺失，造成不可回復(fù)斷裂缺失，造成不可回復(fù) 的缺失突變。誘變效率高，但它可能的缺失突變。誘變效率高，但它可能 影響鄰近基因的性能。影響鄰近基因的性能。 紫外線是常用的誘變劑。紫外線是常用的誘變劑。2）化學(xué)誘變劑：）化學(xué)誘變劑：堿基類似物（堿基類似物（5-BU）、脫氨劑（羥胺、）、脫氨劑（羥胺、 亞硝酸）、亞硝酸）、 嵌入

42、劑（吖啶類）等。嵌入劑（吖啶類）等。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 堿基類似物：堿基類似物：取代相應(yīng)堿基進(jìn)入取代相應(yīng)堿基進(jìn)入DNA鏈，具有鏈，具有 很高的特異性，但回復(fù)突變率高，很少使用。很高的特異性，但回復(fù)突變率高，很少使用。 脫氨劑：脫氨劑：堿基脫氨或脫氮，引起堿基對(duì)轉(zhuǎn)換，堿基脫氨或脫氮，引起堿基對(duì)轉(zhuǎn)換， 造成的遺傳損傷較多。應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。應(yīng)用的范圍較廣， 嵌入劑：嵌入劑：引起移碼突變。可以造成生化代謝途徑引起移碼突變。可以造成生化代謝途徑 完全中斷。完全中斷。 5BU 酮式酮式T 烯醇式烯醇式CA：TBU(酮酮) ： AT：AA：TG) : BU(烯烯BU(酮酮) ： AC：GA：

43、TC：GT：T：AX：U：AHNO2XG：CA：TT：A HD:高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機(jī)制的合成調(diào)節(jié)機(jī)制 HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類似物抗性結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物的類似物AEC, Thr的類似物的類似物AHV營(yíng)養(yǎng)缺陷型營(yíng)養(yǎng)缺陷型：如如Thr缺陷型缺陷型黃色短桿菌黃色短桿菌F9-50的誘變譜系的誘變譜系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/lF9-50 (leu -

44、, Thr -, AEC r) 33.5 g/l2.3 雜交育種雜交育種 發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用誘變育種方法。發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用誘變育種方法。但是，一個(gè)菌種長(zhǎng)期使用誘變劑處理之后，其生活能力一但是，一個(gè)菌種長(zhǎng)期使用誘變劑處理之后，其生活能力一般要逐漸下降，例如生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，孢子量減少，代謝減般要逐漸下降，例如生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，孢子量減少，代謝減慢，產(chǎn)量增加緩慢，誘變因素對(duì)產(chǎn)量基因影響的有效性降慢，產(chǎn)量增加緩慢，誘變因素對(duì)產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，有必要利用雜交育種方法。低等。因此，有必要利用雜交育種方法。 雜交育種是雜交育種是指將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接指將

45、兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合（或接合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。菌株。 1、雜交育種的目的在于：、雜交育種的目的在于： 1）通過(guò)雜交使不同菌株的）通過(guò)雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合，從而改變?cè)?，從而改變?cè)芯甑倪z傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株（重組體）；有菌株的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株（重組體）； 2）可以通過(guò)雜交把）可以通過(guò)雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中，克服長(zhǎng)，克服長(zhǎng)期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；期用誘變劑處理造成的菌株生

46、活力下降等缺陷； 3）通過(guò)雜交，可以）通過(guò)雜交，可以擴(kuò)大變異范圍擴(kuò)大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種；新的品種； 4）分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)）分析雜交結(jié)果，可以總結(jié)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律，促進(jìn)遺傳學(xué)，促進(jìn)遺傳學(xué)理論的發(fā)展。理論的發(fā)展。 微生物雜交育種所使用的配對(duì)菌株稱為微生物雜交育種所使用的配對(duì)菌株稱為直接親本直接親本。由于多數(shù)微生物尚未。由于多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代，因此，直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)陌l(fā)現(xiàn)其有性世代，因此，直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記。常用的遺。常用的遺傳標(biāo)記有傳標(biāo)記有顏色、營(yíng)養(yǎng)要求和抗藥性

47、顏色、營(yíng)養(yǎng)要求和抗藥性等。等。 營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記菌株（即營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株）營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記菌株（即營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株）是最常用的遺傳標(biāo)記之一。是最常用的遺傳標(biāo)記之一。 所謂所謂營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體。是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生化突變體。由于基因突變，它失去了合成某種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）由于基因突變，它失去了合成某種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株需要補(bǔ)加一定的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株需要補(bǔ)加一定種類的有機(jī)物質(zhì)后才能生長(zhǎng)。種類的有機(jī)物質(zhì)后才能生長(zhǎng)。2、遺傳標(biāo)記、遺傳標(biāo)記

48、本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 菌種分離篩選菌種分離篩選v第三節(jié)第三節(jié) 自然選育自然選育v第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種v第五節(jié)第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù)育種原生質(zhì)體技術(shù)育種v第六節(jié)第六節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué) 所謂所謂原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合就是把兩個(gè)親本的細(xì)胞壁分別通過(guò)酶解就是把兩個(gè)親本的細(xì)胞壁分別通過(guò)酶解作用加以瓦解，使菌體細(xì)胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜作用加以瓦解，使菌體細(xì)胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀體包裹著的球狀體（稱原生質(zhì)體）（稱原生質(zhì)體）。 兩親本的原生質(zhì)體在兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件高滲條件下使之混

49、合，由聚乙二醇下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合細(xì)胞融合，接著，接著兩親本基因組由兩親本基因組由接觸接觸到到交換交換，從而實(shí)現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組遺傳重組。在再生成細(xì)。在再生成細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子重組子。5. 原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)從現(xiàn)有資料看，原生質(zhì)體融合技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)從現(xiàn)有資料看，原生質(zhì)體融合技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn) （l）去除了細(xì)胞壁的障礙）去除了細(xì)胞壁的障礙，親株基因親株基因組直接融合、交換，實(shí)組直接融合、交換，實(shí)現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。即使是相同接

50、合型的真菌現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。即使是相同接合型的真菌細(xì)胞也能發(fā)生原生質(zhì)體的相互融合，并可對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞也能發(fā)生原生質(zhì)體的相互融合，并可對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染。和轉(zhuǎn)染。 （2）原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機(jī)會(huì)發(fā)生多次交）原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機(jī)會(huì)發(fā)生多次交換，換，產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的重組子重組子。 參與融合的親株數(shù)并不限于一個(gè)，可以多至三個(gè)、四個(gè)，參與融合的親株數(shù)并不限于一個(gè)，可以多至三個(gè)、四個(gè)，這足一般常規(guī)雜交所達(dá)不到的。這足一般常規(guī)雜交所達(dá)不到的。 （3）重組頻率特別高重組頻率特別高，因?yàn)橛芯垡叶?/p>

51、醇作助融劑。，因?yàn)橛芯垡叶甲髦趧?.1 原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性（4）可以和其他育種方法相結(jié)合）可以和其他育種方法相結(jié)合，把由其它方法得到的優(yōu)，把由其它方法得到的優(yōu)良性狀通過(guò)原生質(zhì)體融合再組合到一個(gè)單株中。良性狀通過(guò)原生質(zhì)體融合再組合到一個(gè)單株中。（5）可以用溫度、藥物、紫外線等處理、鈍化親株的一方）可以用溫度、藥物、紫外線等處理、鈍化親株的一方或雙方，或雙方，然后使之融合，再在再生菌落中篩選重組子。這然后使之融合，再在再生菌落中篩選重組子。這樣往往可以提高篩選效率。樣往往可以提高篩選效率。 由于以上優(yōu)點(diǎn)，利用原生質(zhì)體融合來(lái)培育工業(yè)新菌株已由于以上優(yōu)點(diǎn)，利用原生質(zhì)體融合來(lái)

52、培育工業(yè)新菌株已受到國(guó)內(nèi)外普遍重視。受到國(guó)內(nèi)外普遍重視。 5.2 原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟1. 選擇親株選擇親株 選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的兩個(gè)親株；選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的兩個(gè)親株； 親株帶上遺傳標(biāo)記；親株帶上遺傳標(biāo)記； 測(cè)定遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性。測(cè)定遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性。2. 原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備 一般采用酶解法除壁。根據(jù)微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的一般采用酶解法除壁。根據(jù)微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同，采用不同的酶，有時(shí)還要采取一些措施，如添加甘氨不同，采用不同的酶，有時(shí)還要采取一些措施，如添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高細(xì)胞壁對(duì)酶解的敏感性；酸、蔗糖或抗生

53、素等，以提高細(xì)胞壁對(duì)酶解的敏感性； 原生質(zhì)體對(duì)滲透壓極其敏感，低滲易引起細(xì)胞破裂。一原生質(zhì)體對(duì)滲透壓極其敏感，低滲易引起細(xì)胞破裂。一般將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中維持它的穩(wěn)定。般將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中維持它的穩(wěn)定。3. 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。在再生細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。在再生細(xì)胞的

54、菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。4. 原生質(zhì)體再生原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；原生質(zhì)體再生就是使原生質(zhì)體重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)； 為獲得較高的再生率，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免剪切力過(guò)大使原生質(zhì)體破裂；為獲得較高的再生率，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免剪切力過(guò)大使原生質(zhì)體破裂； 涂布時(shí)，原生質(zhì)體濃度不宜過(guò)高；涂布時(shí)，原生質(zhì)體濃度不宜過(guò)高； 菌齡、再生時(shí)的溫度、溶菌酶用量和溶壁時(shí)間等因素都會(huì)影響原生質(zhì)體的再生。菌齡、再生時(shí)的溫度、溶菌酶用量和溶壁時(shí)間等因素都會(huì)影響原生質(zhì)體的再生。5. 篩選優(yōu)良性狀融合重組子篩選優(yōu)良性狀融合重組子v原生質(zhì)體融

55、合后，來(lái)自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過(guò)交換并發(fā)生重組而形成的子代稱原生質(zhì)體融合后，來(lái)自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過(guò)交換并發(fā)生重組而形成的子代稱為為融合重組子。融合重組子。v融合重組子的檢出方法：融合重組子的檢出方法：直接法直接法 將融合液涂布在不補(bǔ)充親株生長(zhǎng)需要的生長(zhǎng)因子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩將融合液涂布在不補(bǔ)充親株生長(zhǎng)需要的生長(zhǎng)因子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。選出原養(yǎng)型重組子。間接法間接法 把融合液涂布在營(yíng)養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，把融合液涂布在營(yíng)養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。然后用影印法

56、將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。v篩選出來(lái)的融合重組子還需要對(duì)它們進(jìn)行生理生化及生產(chǎn)性能的測(cè)定。篩選出來(lái)的融合重組子還需要對(duì)它們進(jìn)行生理生化及生產(chǎn)性能的測(cè)定。本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 菌種分離篩選菌種分離篩選v第三節(jié)第三節(jié) 自然選育自然選育v第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種v第五節(jié)第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù)育種原生質(zhì)體技術(shù)育種v第六節(jié)第六節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué) 發(fā)酵工藝學(xué)發(fā)酵工藝學(xué)第六節(jié)第六節(jié) 基因工程技術(shù)育種基因工程技術(shù)育種一、概述一、概述二、基因工程育種的優(yōu)點(diǎn)二、基因工程育種的優(yōu)點(diǎn)二、基因工程技術(shù)育種的設(shè)計(jì)二、基因工程技

57、術(shù)育種的設(shè)計(jì)v如果將一種生物的如果將一種生物的 DNA中的某個(gè)遺傳密碼片斷連接到另外一種生物的中的某個(gè)遺傳密碼片斷連接到另外一種生物的DNA鏈上去，將鏈上去，將DNA重新組織一下，就可以按照人類的愿望，設(shè)計(jì)出新重新組織一下，就可以按照人類的愿望，設(shè)計(jì)出新的遺傳物質(zhì)并創(chuàng)造出新的生物類型，這與過(guò)去培育生物繁殖后代的傳統(tǒng)的遺傳物質(zhì)并創(chuàng)造出新的生物類型，這與過(guò)去培育生物繁殖后代的傳統(tǒng)做法完全不同。做法完全不同。v這種做法就像技術(shù)科學(xué)的工程設(shè)計(jì)，按照人類的需要把這種生物的這個(gè)這種做法就像技術(shù)科學(xué)的工程設(shè)計(jì)，按照人類的需要把這種生物的這個(gè)“基因基因”與那種生物的那個(gè)與那種生物的那個(gè)“基因基因”重新重新“施工施工”，“組裝組裝”成新的基成新的基因組合，創(chuàng)造出新的生物。這種完全按照人的意愿，由重新組裝基因到因組合，創(chuàng)造出新的生物。這種完全按照人的意愿，由重新組裝基因到新生物產(chǎn)生的生物科學(xué)技術(shù)，新生物產(chǎn)生的生物科學(xué)技術(shù)，就稱為就稱為“基因工程基因工程”，或者說(shuō)是，或者說(shuō)是“遺傳工遺傳工程程”。一、概述一、概述基因工程概基因工程概述述 基因工程是生物工程的一個(gè)重要分支，它和細(xì)胞工程、酶工程、蛋白基因工程是生物工程的一個(gè)重要分支，它和細(xì)胞工程