中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)20150609

1、中東呼吸綜合征冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中東呼吸綜合征冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)王文玲王文玲中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所應(yīng)急技術(shù)中心2015年6月9日參考標(biāo)準(zhǔn)l 中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南l WHO: Laboratory Testing for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus：interim recommendations (revised) . (September 2014 ）l US CDC：Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Cli

2、nical Specimens from Patients Under Investigation (PUIs) for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) - Version 2MERS-CoV感染標(biāo)本采集對(duì)象感染標(biāo)本采集對(duì)象l 中東呼吸綜合征冠狀病毒感染疑似病例、臨床診斷病例及需要進(jìn)一步研究的確診病例；l 其它需要進(jìn)行MERS-CoV感染診斷或鑒別診斷者。標(biāo)本采集要求1. 從事MERS-CoV檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)，培訓(xùn)合格且具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在標(biāo)本采集過(guò)程中，采樣人員進(jìn)行安全防護(hù)。2. 住院病

3、例住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)專(zhuān)業(yè)人員指導(dǎo)下采集。3. 密切接觸者密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。4. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，結(jié)合病程再次采樣再次采樣。采集標(biāo)本采集標(biāo)本種類(lèi)和要求種類(lèi)和要求l 呼吸道（上、下呼吸道）和其他樣品（血清、尿液和糞便）、尸檢標(biāo)本。l 每個(gè)病例應(yīng)盡可能同時(shí)采集上、下呼吸道標(biāo)本，下呼吸道標(biāo)本最佳，建議同時(shí)采集糞便和尿液標(biāo)本。l 應(yīng)盡可能采取發(fā)病初期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本以確定是否感染，雙份血清樣品間隔1421天采集比較理想，第一份血清應(yīng)在發(fā)病第一周內(nèi)采集。但單份樣品的檢測(cè)對(duì)于確定疑似病例也有價(jià)值，如果只能采集一份樣品，應(yīng)該在出現(xiàn)癥狀后至少14天采

4、集。標(biāo)本的保存l 樣品采集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過(guò)程需合理。l 若呼吸道樣品72小時(shí)以上才能到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，強(qiáng)烈推薦將樣品儲(chǔ)存在-80并使用干冰進(jìn)行運(yùn)輸，應(yīng)避免樣品反復(fù)凍融。l 從全血分離的血清應(yīng)4儲(chǔ)存并運(yùn)輸，或用干冰、液氮冷凍并運(yùn)輸。由于無(wú)霜冰柜溫度波動(dòng)較大，應(yīng)避免使用無(wú)霜冰柜儲(chǔ)存呼吸道和血清樣品。u 院內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，標(biāo)本應(yīng)該放置在耐用、防滲透的二級(jí)容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。為減少任何標(biāo)本破、漏的風(fēng)險(xiǎn)，不要使用任何氣動(dòng)傳輸系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)任何可能疑似患者標(biāo)本。u 轉(zhuǎn)運(yùn)至CDC的MERS-CoV標(biāo)本應(yīng)該充分包裹，轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)不能開(kāi)蓋或分裝標(biāo)本。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)該符合三重包裝系統(tǒng)要求：內(nèi)層是主要的容器（一個(gè)可密封的標(biāo)本袋纏繞以可

5、吸收材料），第二層是防水、防滲漏的容器，外層是用于轉(zhuǎn)運(yùn)的包裝。MERS-CoV感染標(biāo)本包裝和運(yùn)輸 MERS-CoV感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法方法l核酸檢測(cè)：核酸檢測(cè)：為目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)MERS-CoV感染病例的主要檢測(cè)方法，采用Real-time PCR 進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)和診斷，患者呼吸道樣本中擴(kuò)增到特異性核酸，可確診MERS-CoV感染 。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列。l抗原抗體檢測(cè)抗原抗體檢測(cè):IgM捕獲法ELISA檢測(cè)血清特異性IgM抗體間接法ELISA或免疫熒光方法檢測(cè)IgG抗體利用假病毒進(jìn)行中和抗體檢測(cè)MERS-CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靶標(biāo)1.

6、目前病毒核酸的檢測(cè)方法主要有：檢測(cè)E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a 、 N2基因四種。2. 這些方法均高度敏感，推薦upE檢測(cè)用于初篩;檢測(cè)ORF1b基因的方法不如針對(duì)ORF1a的方法敏感，但比其更加特異;N2基因檢測(cè)具有較高的靈敏性。3. 另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個(gè)適合測(cè)序驗(yàn)證的靶序列。巢式巢式PCRPCR普通普通PCRPCRPCRPCR產(chǎn)物電泳或測(cè)序產(chǎn)物電泳或測(cè)序逆轉(zhuǎn)錄，獲得逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNAcDNA核酸提取核酸提取標(biāo)本采集標(biāo)本采集PCRPCR檢測(cè)檢測(cè)熒光熒光定量定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)方案待

7、檢樣品待檢樣品upE 特異性RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性陰性O(shè)RF1a RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性陰性確確 診診RdRp測(cè)序或N 測(cè)序陰性抗原檢測(cè)抗體檢測(cè)病毒分離陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)流程繼續(xù)采樣，如有必要應(yīng)送樣至有MERS-CoV檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)的參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)入選病例rRT-PCR upE基因進(jìn)行篩查實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性陰性rRT-PCR ORF1a、ORF1b或N基因區(qū)進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)陰性陰性，但如果臨床和流行病學(xué)證據(jù)充分，繼續(xù)采樣重復(fù)檢測(cè)陰性陽(yáng)性RdRp或N區(qū)測(cè)序?qū)嶒?yàn)陰性顯示為其他序列顯示MERS-CoV確診病例確診病例upEupE-Fwd 5-GCAACGCGCGATTCAGTT-3upE-Rev 5-GCCTCTACACGGGA

8、CCCATA-3upE-Prb 5FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3ORF1bORF1b-Fwd 5-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3ORF1b-Rev 5-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3ORF1b-Prb 5FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3ORF1aORF1a-Fwd 5- CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3ORF1a-Rev 5- CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3ORF1a-Prb 5FAM- TTGCAAATTGGCTTGCCCCC

9、ACT-TAMRA 3N2N2-Fwd 5- GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3N2-Rev 5- TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3N2-Prb 5FAM- ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3分子檢測(cè)引物與探針Y=-3.56x+39.19R2=0.9881e6 1e4 1e3 1e2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果判斷陰性: 無(wú)Ct值或Ct為40。陽(yáng)性：Ct值37, 可報(bào)告為陽(yáng)性。Ct值在37-40之間的樣本建議重做, 若重做結(jié)果Ct值 37，該樣本判斷為陽(yáng)性, 否則為陰性。MERS-CoV核酸檢測(cè)結(jié)果報(bào)告核酸檢測(cè)結(jié)果報(bào)告在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)樣本為

10、陽(yáng)性，需要滿足以下兩個(gè)條件的其中一個(gè)：1.至少兩種MERS-CoV特異性PCR結(jié)果陽(yáng)性；2.一種PCR結(jié)果為陽(yáng)性，另外一種PCR產(chǎn)物序列測(cè)序，與MERS-CoV序列相符。當(dāng)針對(duì)MERS-CoV的兩種不同的檢測(cè)方法結(jié)果不一致的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)采用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果判讀檢測(cè)結(jié)果判讀陰性結(jié)果也不能排除臨床病人的感染，一些因素可能產(chǎn)生假陰性，包括：1.樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；2.樣本收集的過(guò)早或過(guò)晚；3.沒(méi)有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；4.技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異，PCR抑制等。當(dāng)PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，但臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特點(diǎn)提示是MERS-C

11、oV感染時(shí)，可采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。雙份血清標(biāo)本能夠滿足血清學(xué)檢測(cè)的要求。我國(guó)首例輸入性中東呼吸綜合征病例的我國(guó)首例輸入性中東呼吸綜合征病例的實(shí)驗(yàn)室快速確診實(shí)驗(yàn)室快速確診 2015年5月27日晚10時(shí)世界衛(wèi)生組織向中國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委通報(bào)，韓國(guó)1例確診中東呼吸綜合征（MERS）病例的密切接觸者經(jīng)香港入境廣東省惠州市。 5月28日下午，經(jīng)廣東省疾控中心對(duì)病例標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，初篩結(jié)果為陽(yáng)性。 樣本接收時(shí)間：2015.5.29日凌晨1點(diǎn)40分（中國(guó)疾控中心病毒病所） 實(shí)驗(yàn)室確診結(jié)果上報(bào)： 2015.5.29日凌晨5點(diǎn)40分疑似疑似MERS-CoV感染的實(shí)驗(yàn)室快速確診感染的實(shí)驗(yàn)室快速確診樣本來(lái)源：KIM

12、 MYEONGSHIK (韓國(guó)）廣東省惠州市樣本類(lèi)型：鼻咽拭子(3份） 血清(1份）采樣日期：2015.5.28實(shí)驗(yàn)室復(fù)核檢測(cè)流程：BSL-3實(shí)驗(yàn)室：分裝滅活 BSL-2實(shí)驗(yàn)室：核酸提取 熒光定量RT-PCR (三個(gè)靶標(biāo)UpE、ORF1b和N2) 結(jié)果判定與報(bào)告 廣東省廣東省CDC疑似疑似MERS-CoV感染的復(fù)核檢測(cè)感染的復(fù)核檢測(cè)UpE檢測(cè)擴(kuò)增檢測(cè)擴(kuò)增曲線曲線ORF1b檢測(cè)擴(kuò)增檢測(cè)擴(kuò)增曲線曲線N2檢測(cè)擴(kuò)增檢測(cè)擴(kuò)增曲線曲線靶標(biāo)靶標(biāo)鼻咽拭子鼻咽拭子血血（）（）（）（）（）（）（）（）1 12 23 3UpE 34.1833.933.84No CtNo CtNo CtNo Ct25.51ORF1b

13、 35.8535.1634.73No CtNo CtNo CtNo Ct27.95N2 31.2131.2730.7636.5No CtNo CtND21.34疑似疑似MERS-CoV感染的送檢樣本復(fù)核檢測(cè)感染的送檢樣本復(fù)核檢測(cè)熒光定量熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果（檢測(cè)結(jié)果（Ct 值值）結(jié)論l 采用upE/ORF1b/N2 三個(gè)靶標(biāo)，進(jìn)行三種熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，在對(duì)照成立的基礎(chǔ)上，三管咽拭子樣本檢測(cè)結(jié)果皆為陽(yáng)性。l 基于N2靶標(biāo)的熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，血清標(biāo)本呈弱陽(yáng)性。l 結(jié)論：廣東疑似MERS-CoV病人實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確定為MERS-CoV感染陽(yáng)性。上海上海輝瑞合作研發(fā)試劑盒（單管雙靶

14、標(biāo)輝瑞合作研發(fā)試劑盒（單管雙靶標(biāo)）應(yīng)用）應(yīng)用驗(yàn)證驗(yàn)證MERS-CoV RNA雙色檢測(cè)試劑盒ORF1b/upE （FAM/VIC）1 34 2 樣品編號(hào)樣品編號(hào)CT值值1陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照22.5822.582咽拭子樣本咽拭子樣本36.3536.35樣品編號(hào)樣品編號(hào)CT值值3陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照22.5422.544咽拭子樣本咽拭子樣本33.1733.17基于濁度儀和羥基萘酚藍(lán)顏色變化的簡(jiǎn)單快速基于濁度儀和羥基萘酚藍(lán)顏色變化的簡(jiǎn)單快速和靈敏的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和靈敏的環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)RT-LAMP檢測(cè)方法的特異性濁度圖和顯色圖特異性高，檢測(cè)下限分別為每管反應(yīng)500與1000拷貝，有望應(yīng)用

15、于MERS-CoV感染的快速篩選，具有在基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場(chǎng)推廣和應(yīng)用的潛力RT-PCR擴(kuò)增RdRp或N基因后測(cè)序檢測(cè)MERS-CoVRdRpSeq assay:EMC-SeqRdRP-Rev: GCA TWG CNC WGT CAC ACT TAG GEMC-SeqRdRP-Fwd: TGC TAT WAG TGC TAA GAA TAG RGCEMC-SeqRdRP-Rnest: CAC TTA GGR TAR TCC CAW CCC AW=A/T, N=A/C/T/G, R=A/GFragment size: first round : 242bp (including primers

16、),second round 228 bp (including primers)Nseq assay:EMC-SeqN-Fwd: CCT TCG GTA CAG TGG AGC CAEMC-SeqN-Rev: GAT GGG GTT GCC AAA CAC AAA CEMC-SeqN-Fnest: TGA CCC AAA GAA TCC CAA CTA CFragment size: first round : 306-312 bp (including primers),second round 279-285 bp (including primers)Reference:Corman/

17、Mller et al.; Eurosurveillance, Volume 17, Issue 49, 06 December 2012通用引物檢測(cè)冠狀病毒冠狀病毒通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳One-step RT-PCR assays (OneStep RT-PCR kit； QIAGEN) 反應(yīng)條件：1. 反轉(zhuǎn)錄: 50 for 30min 2. PCR擴(kuò)增: 95 for 15 min (激活)，50 cycles (30 sec at 94 ；30 sec at 48 ；1min at 72 )，最后延伸 72 for 10min。引物對(duì)序列：引物對(duì)序列：Cor-FW (5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3) Cor-RV (5-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3)IFA抗原片檢測(cè)MERS-CoV特異抗體中和抗體檢測(cè)中和抗體檢測(cè)利用利用MERS-CoV假病毒體系進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單而假病毒體系進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單而不受不受BSL-3實(shí)驗(yàn)室的限制（實(shí)驗(yàn)室的限制（Virology Journal.20