質(zhì)粒DNA提取、純化和鑒定

1、質(zhì)粒DNA提取、純化和鑒定 一、實驗原理 細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但兩者變性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12.0的堿性溶液中，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。當(dāng)用pH值4.6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清的質(zhì)粒DNA，可用無水

2、乙醇和鹽溶液，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯fang抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。 簡言之：在細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA釋放到溶液中，當(dāng)PH為12時，DNA的氫鍵斷開，由于質(zhì)粒DNA為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所以兩條鏈沒有分離，而染色體DNA兩條鏈完全分開，氫鍵斷開而分離。當(dāng)PH值恢復(fù)到中性時，質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中-除去染色體DNA、大分子RNA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合

3、物纏連成白色絮狀沉淀，離心分離。 加入乙醇后，上清質(zhì)粒DNA凝聚成沉淀，會有RNA存在，加入RNA酶，使RNA降解。-去除RNA分子。 二、實驗儀器 微量取液器（20、200、1000微升）、臺式高速離心機(jī)、恒溫震蕩搖床、高速蒸汽消毒器（滅菌鍋）、渦旋震蕩器、電泳儀、瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。 三、實驗步驟 堿變性法提取質(zhì)粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。 細(xì)菌的培養(yǎng)和收集 將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中,37培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌

4、落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中,37振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。(培養(yǎng)箱、搖床) 質(zhì)粒DNA少量快速提取 1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4下12000g離心30秒。（移液器、離心機(jī)） 2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。 3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。（移液器） 4、加入新配制的溶液200μl,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。（移液器） 5、加入150μl預(yù)冷的

5、溶液,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4下12000g離心5-10分鐘。（移液器、離心機(jī)） 6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯fang(1:1),振蕩混勻,4下12000g離心5分鐘。 7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12000g離心10分鐘。（冰箱、離心機(jī)） 8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml70乙醇洗沉淀一次,4下12000g離心5-10分鐘。 9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。

6、10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，儲于-20冰箱中。 *溶液一：重懸菌體，提供緩沖環(huán)境。 溶液二：氫氧化鈉和SDS裂解菌體細(xì)胞壁、在細(xì)胞膜上穿孔，釋放細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒。 溶液三：中和氫氧化鈉、SDS中的鈉被鉀替換，吸附菌體產(chǎn)生沉淀。 DNA鑒定 實驗儀器 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，旋渦振蕩器，水浴鍋，1.5mL離心管，50mL離心管，不同型號的吸頭，微量移液器，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，電子天平，手套，紫外燈，Eppendorf管等。 DNA純度檢測 （1）取40mLTAE（1×）于300mL錐形瓶中，加入0.4g瓊脂糖，放入微波爐內(nèi)使其熔化，60時倒入準(zhǔn)備好的制膠槽中。（微波爐、制膠槽、梳子） （2）取5.0μl純化DNA加入1.0μl上樣緩沖液，混