生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)

1、應(yīng)用應(yīng)用AFLP技術(shù)分析植物基因組技術(shù)分析植物基因組實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握植物基因組、掌握植物基因組DNA的提取方法的提取方法2、了解、了解AFLP的實(shí)驗(yàn)原理、操作過(guò)程及其應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)原理、操作過(guò)程及其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1植物基因組植物基因組DNA的提取的提取2 植物基因組植物基因組DNA的的AFLP操作及結(jié)果分析操作及結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)背景：實(shí)驗(yàn)背景： 生物的多樣性主要包括四個(gè)層次即：遺傳多樣性、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和景觀多樣性。 而遺傳多樣性是其它多樣性的基礎(chǔ)，也可以說(shuō)，生物多樣性歸根到底就是遺傳多樣性。 那么遺傳多樣性又是如何檢測(cè)的呢？主要是因?yàn)樯锞哂卸鄻有灾饕且驗(yàn)樯锞哂卸鄻有?/p>

2、 ！？?。?（1）形態(tài)學(xué)標(biāo)記 （2）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 （3）生化標(biāo)記 （4）分子標(biāo)記a.多態(tài)性高；b.共顯性遺傳，在二倍體的生物中能區(qū)分純合與雜合狀態(tài)；c.在基因組中頻繁出現(xiàn)，甚至貫穿分布于整個(gè)基因組；d.選擇中性；e.容易獲得；f.容易操作，自動(dòng)化程度高；g.重復(fù)性好；h.所得數(shù)據(jù)可在實(shí)驗(yàn)室之間交流和比較分子標(biāo)記的歷史： 第一代分子標(biāo)記技術(shù) RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性） 第二代分子標(biāo)記技術(shù) RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA ）nAFLP （Ampl

3、ified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性） 事實(shí)上，還有很多分子標(biāo)記技術(shù)像SSR、ISSR、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）另外，還有現(xiàn)在號(hào)稱為第三代分子標(biāo)記的SNP（ 單核苷酸多態(tài)性) 等AFLP（Amplidied Fragment Length Polymorphism）是是1993年荷蘭科學(xué)家年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和和Vos發(fā)展起來(lái)的一種檢發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)測(cè)DNA多態(tài)性的新方法。多態(tài)性的新方法。基本原理基本原理是基因組是基因組DNA經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶酶切，形經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶酶切，形成分子量大小不等的隨機(jī)限制性酶切片段，將特定的人成分子

4、量大小不等的隨機(jī)限制性酶切片段，將特定的人工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段的兩端，形成一些工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段的兩端，形成一些帶接頭的特異片段，通過(guò)接頭序列和帶接頭的特異片段，通過(guò)接頭序列和PCR引物引物3端選擇端選擇性堿基的識(shí)別，對(duì)特異性片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。性堿基的識(shí)別，對(duì)特異性片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。結(jié)果只有那些兩端序列能與選擇性堿基配對(duì)的限制性酶結(jié)果只有那些兩端序列能與選擇性堿基配對(duì)的限制性酶切片段才能被擴(kuò)增；最后將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率切片段才能被擴(kuò)增；最后將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，尋找多態(tài)性擴(kuò)增片段。的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，尋

5、找多態(tài)性擴(kuò)增片段。引物由三部分組成：與人工接頭互補(bǔ)的核心堿基引物由三部分組成：與人工接頭互補(bǔ)的核心堿基序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列、引物序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列、引物3端的選擇端的選擇堿基序列（堿基序列（110 bp）。接頭與接頭相鄰的酶）。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列為結(jié)合位點(diǎn)。切片段的幾個(gè)堿基序列為結(jié)合位點(diǎn)。 AFLP的實(shí)驗(yàn)流程的實(shí)驗(yàn)流程 模板制備DNA的提?。⊿DS法和CTAB法） 酶切 連接 nPCR擴(kuò)增(PCR AMPLIFIED ) 預(yù)擴(kuò)增(Pre-amplified) 選擇性擴(kuò)增(Elective amplified) 擴(kuò)增片段通常用變性聚丙烯酰胺凝擴(kuò)增片段通常用變性聚

6、丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增片段大小范圍選膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增片段大小范圍選擇應(yīng)用擇應(yīng)用4%一一10%的凝膠電泳。的凝膠電泳。 應(yīng)用放射自顯影、銀染、熒應(yīng)用放射自顯影、銀染、熒光測(cè)序儀等方法顯示結(jié)果，光測(cè)序儀等方法顯示結(jié)果，通過(guò)通過(guò)Gene-Scan, Gel-Compare等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。DNA的提取（SDS法和CTAB法） SDS是Sodium dodecyl sulfate的縮寫稱為十二烷基磺酸鈉， CTAB是Cetyl trimethyl ammonium bromide的縮寫十六烷基三甲基溴化氨， 兩種都是去污劑，它們都能破壞細(xì)胞膜使膜蛋白變性沉淀，故而使核酸釋放出

7、來(lái)，另外，它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。 酶切 為了使酶切片段大小分布均勻，一般采用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，一個(gè)用6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI )，另一個(gè)用4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶(常用MseI 、TaqI)。采用雙酶切的主要原因有：(1)多切點(diǎn)酶產(chǎn)生較小的DNA片段，而切數(shù)點(diǎn)較少的酶能夠減少擴(kuò)增片段的數(shù)目，因?yàn)閿U(kuò)增片段主要是多切點(diǎn)酶和切點(diǎn)數(shù)較少的酶組合產(chǎn)生的酶切片段，這樣就可以減少選擇擴(kuò)增時(shí)所需要的選擇堿基數(shù)。(2) 雙酶切可以對(duì)擴(kuò)增片段數(shù)進(jìn)行靈活調(diào)節(jié)。(3)通過(guò)少數(shù)引物可產(chǎn)生許多不同的引物組合，從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋。這樣，經(jīng)過(guò)酶切

8、后就形成了三種類型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一MseI片段、Mse工一MseI片段，由于AFLP技術(shù)革新成功的關(guān)鍵在于DNA的充分酶切，所以對(duì)模板質(zhì)量要求很高，要注意避免其它DNA污染和抑制物質(zhì)存在。連接 酶切后的DNA片段在T4 DNA連接酶作用下與兩種內(nèi)切酶相應(yīng)的特定接頭相連接，形成帶接頭的特異性片段。接頭為雙鏈，由兩部分組成，一部分是核心序列，一部分是酶特定序列(能與酶切片段粘端互補(bǔ))，通常在酶特定序列中變換了一個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基，保證了連接片段不能再被酶切。只有遵循“引物擴(kuò)增原則”設(shè)計(jì)的接頭才能得到滿意的擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增(P

9、CR AMPLIFIED ) 應(yīng)用與接頭相識(shí)別的引物進(jìn)行擴(kuò)增。AFLP引物由三部分組成：（1）5端的與人工接頭序列互補(bǔ)的核心序列(core sequence)（2）限制性內(nèi)切酶特定識(shí)別序列(enzyme-specific sequence) （3）3端的帶有選擇性堿基的粘性末端(selective extension)，其中AFLP接頭的設(shè)計(jì)(包括核心序列和酶特定序列)是關(guān)鍵之處，常用的多為EcoRI和MseI接頭，接頭和與接頭相鄰的酶切片段的堿基序列是引物的結(jié)合位點(diǎn)，合成的寡核苷酸接頭經(jīng)過(guò)94變性，37退火，4保存?zhèn)溆?；理論上每增加一個(gè)選擇性堿基，將只擴(kuò)增限制性片段的1/4，而在兩個(gè)引物上都

10、有三個(gè)選擇性堿基的情況下，則僅獲得1/4096的片段；也就是說(shuō)，只有那些兩端序列能與選擇堿基配對(duì)的限制酶切片段被擴(kuò)增。所以選擇性堿基是選擇用于擴(kuò)增的特定的限制性片段的一種精確而有效的方法；n預(yù)擴(kuò)增(Pre-amplified) 擴(kuò)增所用引物3端有一個(gè)選擇堿基，通過(guò)預(yù)擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增模板進(jìn)行初步篩選，一方面可以避免直接擴(kuò)增造成的指紋帶型背景拖尾現(xiàn)象，另一方面可以避免直接擴(kuò)增由引物3端3個(gè)選擇堿基誤配形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。 選擇性擴(kuò)增(Elective amplified)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)稀釋后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，使所需模板量不受限制。所用引物3端有3個(gè)選擇堿基的延伸，通過(guò)3個(gè)選擇堿基的變換獲得豐富的DNA片段。Ec

11、oR IMse I（限制性內(nèi)切酶）EcoR I接頭Mse I接頭EcoR I引物+AMse I引物+C（預(yù)擴(kuò)增）EcoR I引物+AACMse I引物+CAA （選擇擴(kuò)增）（連接）（電泳檢測(cè)）實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1 植物基因組植物基因組DNA的提取的提取2 DNA被限制性內(nèi)切酶切割，被限制性內(nèi)切酶切割，3 與與AFLP聚核苷酸接頭聚核苷酸接頭(adapter)連接；連接；4 利用利用PCR方法，通過(guò)變性、退火、延伸循環(huán)，方法，通過(guò)變性、退火、延伸循環(huán)，選擇性擴(kuò)增成套的限制性片段，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，選擇性擴(kuò)增成套的限制性片段，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，可使目的序列擴(kuò)增到可使目的序列擴(kuò)增到0.51g；5 利用聚丙

12、烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增的利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增的DNA片段；片段；6 銀染。銀染。 利用一套特別的引物在不需要知道利用一套特別的引物在不需要知道DNA序列的情況下，序列的情況下，可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量的片段。由于可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量的片段。由于AFLP擴(kuò)增擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可譜帶，而在另一品種中可能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導(dǎo)及能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增擴(kuò)增后得到的后得到的DNA多態(tài)性可作為一種分子標(biāo)記。所以說(shuō)多態(tài)性可作為一種分子標(biāo)記。所以說(shuō)AFLP技術(shù)是一種新的且功能強(qiáng)大的技術(shù)是一種

13、新的且功能強(qiáng)大的DNA指紋技術(shù)。指紋技術(shù)。實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：小麥幼苗或菊花等其它材料小麥幼苗或菊花等其它材料實(shí)驗(yàn)主要儀器：實(shí)驗(yàn)主要儀器：水浴鍋水浴鍋PCR儀儀高速離心機(jī)高速離心機(jī)電泳儀電泳儀DNA序列測(cè)定電泳槽序列測(cè)定電泳槽凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)移液器等移液器等實(shí)驗(yàn)方法與過(guò)程實(shí)驗(yàn)方法與過(guò)程 1引物和接頭引物和接頭(adapter)合成合成 引物和接頭合成是引物和接頭合成是AFLP技術(shù)中重要的步驟，引物技術(shù)中重要的步驟，引物和接頭的改進(jìn)是和接頭的改進(jìn)是AFLP較較RAPD、PCR最主要的變革。最主要的變革。引物可通過(guò)引物可通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀人工合成，自動(dòng)合成儀人工合成，AFLP引引物的設(shè)計(jì)

14、主要由接頭的設(shè)計(jì)決定，物的設(shè)計(jì)主要由接頭的設(shè)計(jì)決定，AFLP引物的一個(gè)引物的一個(gè)重要特征是所有引物起始于重要特征是所有引物起始于5殘基，殘基，5端是與接頭序端是與接頭序列相對(duì)應(yīng)的。列相對(duì)應(yīng)的。引物主要由引物主要由3部分組成：核心序列部分組成：核心序列(CORE)；酶特異序列酶特異序列(ENZ)；選擇性延伸序列；選擇性延伸序列(EXT)。如如EcoRIEcoRI引物和引物和MseIMseI引物引物(EXT(EXT用用NNNNNN表示，表示，N N表示任何堿基表示任何堿基) ) CORE CORE ENZ ENZ EXTEXT EcoRI EcoRI 5-5-GACTGCGTACGACTGCGTA

15、CC C AATTC AATTC NNN-3 NNN-3 MseI MseI 5-5-GATGAGTCCTGATGAGTCCTGAG GAG TAA TAA NNN-3 NNN-3 接頭一般由二部分組成：核心序列和酶特異序列，接頭一般由二部分組成：核心序列和酶特異序列，如如EcoRI接頭和接頭和MseI接頭：接頭：EcoRI-adapter: 5-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5MseI-adapter:5-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-52模板模板DNA制備制備DNA提取提取,雙酶切雙酶切,接頭連接接頭連接擴(kuò)增反應(yīng)

16、中的模板擴(kuò)增反應(yīng)中的模板DNA可以用基因組可以用基因組DNA也可以用也可以用cDNA。首先，采用首先，采用CTAB法提取植物基因組法提取植物基因組DNA，然后雙酶切目，然后雙酶切目的的DNA，如，如EcoRI/MseI兩種酶。然后用兩種酶。然后用T4 DNA連接酶，將連接酶，將EcoRI和和MseI接頭與酶切片段連接起來(lái)，連接后，稀釋接頭與酶切片段連接起來(lái)，連接后，稀釋10倍，倍，-20貯存。則模板貯存。則模板DNA可用于擴(kuò)增反應(yīng)?？捎糜跀U(kuò)增反應(yīng)。AFLP反應(yīng)對(duì)模板反應(yīng)對(duì)模板DNA濃度不是很敏感，在濃度不是很敏感，在25ng甚至甚至25pg時(shí)，均可以觀察到多態(tài)性帶，但為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，時(shí)，均可

17、以觀察到多態(tài)性帶，但為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，DNA濃度不能太低，而且模板濃度不能太低，而且模板DNA最好純一些，以防干擾實(shí)最好純一些，以防干擾實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)。3DNA擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)AFLP擴(kuò)增一般使用二對(duì)引物，擴(kuò)增的條件依賴于擴(kuò)增一般使用二對(duì)引物，擴(kuò)增的條件依賴于AFLP引物的選擇性核苷酸的性質(zhì)，擴(kuò)增反應(yīng)需經(jīng)過(guò)幾十引物的選擇性核苷酸的性質(zhì)，擴(kuò)增反應(yīng)需經(jīng)過(guò)幾十次循環(huán)。次循環(huán)。當(dāng)引物無(wú)或有一個(gè)選擇性核苷酸時(shí)，當(dāng)引物無(wú)或有一個(gè)選擇性核苷酸時(shí)，AFLP只需只需20個(gè)循環(huán)，個(gè)循環(huán)，每一次循環(huán)分為以下幾步：每一次循環(huán)分為以下幾步：94，DNA樣品變性樣品變性30秒，秒，56退火退火1分鐘，分鐘，72延伸延伸1分鐘。

18、分鐘。當(dāng)引物有當(dāng)引物有2或或3個(gè)選擇性核苷酸時(shí)，個(gè)選擇性核苷酸時(shí)，AFLP反應(yīng)是反應(yīng)是36個(gè)循環(huán)。個(gè)循環(huán)。第第1個(gè)循環(huán)是：個(gè)循環(huán)是：94DNA變性變性30秒，秒，65退火退火30秒，秒，72延伸延伸1分鐘；第分鐘；第2到到13個(gè)循環(huán)，個(gè)循環(huán)，DNA退火溫度每次遞減退火溫度每次遞減0.7，其余步驟同第一個(gè)循環(huán)；第，其余步驟同第一個(gè)循環(huán)；第1436循環(huán)，退火溫循環(huán)，退火溫度是度是56，其余步驟同第一個(gè)循環(huán)，其余步驟同第一個(gè)循環(huán) 。對(duì)于復(fù)雜基因組對(duì)于復(fù)雜基因組DNA，AFLP擴(kuò)增不同于簡(jiǎn)單基因組，擴(kuò)增不同于簡(jiǎn)單基因組，要分兩步進(jìn)行，即第一步是預(yù)擴(kuò)增，用一對(duì)要分兩步進(jìn)行，即第一步是預(yù)擴(kuò)增，用一對(duì)AFL

19、P引物，引物，AFLP引物只有一個(gè)選擇性核苷酸，擴(kuò)增后，反應(yīng)混合引物只有一個(gè)選擇性核苷酸，擴(kuò)增后，反應(yīng)混合物稀釋物稀釋10倍，倍，DNA用作模板，進(jìn)行第二次擴(kuò)增用作模板，進(jìn)行第二次擴(kuò)增第二次擴(kuò)增的引物是具有第二次擴(kuò)增的引物是具有3個(gè)選擇性核苷酸的引物。兩個(gè)選擇性核苷酸的引物。兩步法有以下好處，一是可減少步法有以下好處，一是可減少“Smear”背景污染；二背景污染；二是可為是可為AFLP反應(yīng)提供大量的模板反應(yīng)提供大量的模板DNA。 4 制膠制膠測(cè)序凝膠板的制備測(cè)序凝膠板的制備玻璃板的處理：銀染測(cè)序的玻璃板一定要非常清潔。實(shí)驗(yàn)玻璃板的處理：銀染測(cè)序的玻璃板一定要非常清潔。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，先用溫水和去污

20、劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃過(guò)程中，先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導(dǎo)致凝膠染色時(shí)背景偏高。每次上遺留的去污劑微膜可能導(dǎo)致凝膠染色時(shí)背景偏高。每次鋪膠前均需分別嚴(yán)格處理長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板。鋪膠前均需分別嚴(yán)格處理長(zhǎng)玻璃板和短玻璃板。（1）長(zhǎng)玻璃板的處理）長(zhǎng)玻璃板的處理 a) 用浸透親和硅烷溶液用浸透親和硅烷溶液(1ml左右左右)的鏡頭紙擦拭清洗過(guò)的長(zhǎng)玻的鏡頭紙擦拭清洗過(guò)的長(zhǎng)玻璃板。長(zhǎng)玻璃板經(jīng)粘合溶液處理可將凝膠化學(xué)交聯(lián)于玻璃板上；璃板。長(zhǎng)玻璃板經(jīng)粘合溶液處理可將凝膠

21、化學(xué)交聯(lián)于玻璃板上；b) 五分鐘后用吸水棉紙沾五分鐘后用吸水棉紙沾95%乙醇洗長(zhǎng)玻璃板乙醇洗長(zhǎng)玻璃板3次，以除去多次，以除去多余余Sigmacote溶液。溶液。（2）短玻璃板的處理）短玻璃板的處理 a) 更換手套，避免與親和硅交叉污染；更換手套，避免與親和硅交叉污染；b) 用浸透剝離硅烷溶液用浸透剝離硅烷溶液(1.5ml)的鏡頭紙擦拭清洗過(guò)并已經(jīng)自的鏡頭紙擦拭清洗過(guò)并已經(jīng)自然干燥的整個(gè)玻璃板板面；然干燥的整個(gè)玻璃板板面；c) 五分鐘后，用干凈紙頭單向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方五分鐘后，用干凈紙頭單向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次向擦拭。重復(fù)三次,每次均須換用干凈的紙，以除去多余

22、的粘合每次均須換用干凈的紙，以除去多余的粘合溶液；溶液；d) 實(shí)驗(yàn)中根據(jù)溫度等實(shí)際情況調(diào)整剝離硅烷的涂量。這一步對(duì)實(shí)驗(yàn)中根據(jù)溫度等實(shí)際情況調(diào)整剝離硅烷的涂量。這一步對(duì)于在銀染操作過(guò)程中防止凝膠撕裂至關(guān)重要。于在銀染操作過(guò)程中防止凝膠撕裂至關(guān)重要。（3）測(cè)序板處理的注意事項(xiàng)）測(cè)序板處理的注意事項(xiàng) 在單向擦玻璃板時(shí)不要過(guò)度用力在單向擦玻璃板時(shí)不要過(guò)度用力,否則會(huì)帶走過(guò)多粘合硅烷否則會(huì)帶走過(guò)多粘合硅烷,使凝膠不能很好地粘附；使凝膠不能很好地粘附；b) 一定要更換手套，防止粘染粘合硅烷一定要更換手套，防止粘染粘合硅烷,否則將導(dǎo)致凝膠撕裂；否則將導(dǎo)致凝膠撕裂； c) 用過(guò)的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或

23、塑料刮刀刮去。玻用過(guò)的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗?；蛘吣z用璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡浸泡3060min后除去；后除去；d) 為防止交叉污染為防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長(zhǎng)玻用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長(zhǎng)玻璃板的工具分開璃板的工具分開, 如果出現(xiàn)交叉污染如果出現(xiàn)交叉污染, 以后制備的凝膠可能撕以后制備的凝膠可能撕裂或變得松馳。裂或變得松馳。凝膠的制備：凝膠的制備： （1） 固定玻璃板固定玻璃板用用0.4mm厚的邊條置于長(zhǎng)玻璃板左右兩側(cè)，將短玻璃板壓于厚的邊條置于長(zhǎng)玻璃板左右兩側(cè)，將短玻璃板壓于其上。在

24、長(zhǎng)玻璃板的一側(cè)插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾其上。在長(zhǎng)玻璃板的一側(cè)插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。子固定住。（2）制備測(cè)序凝膠）制備測(cè)序凝膠(6%)先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和和10TBE緩沖緩沖液，再用雙蒸水調(diào)終體積至液，再用雙蒸水調(diào)終體積至99.2ml，并用，并用0.45mm的濾膜過(guò)的濾膜過(guò)濾，然后再加過(guò)硫酸銨和濾，然后再加過(guò)硫酸銨和TEMED。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(PAG)由丙烯酰胺由丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙和亞甲基雙丙烯酰胺烯酰胺(Bis)聚合而成。在凝膠聚合中，丙烯酰胺單聚合而成。在凝膠聚合中，丙烯酰胺單體

25、分子中的雙鍵先打開，相互連接形成脂肪族長(zhǎng)鏈分體分子中的雙鍵先打開，相互連接形成脂肪族長(zhǎng)鏈分子，再由交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺隨機(jī)地與長(zhǎng)鏈上的子，再由交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺隨機(jī)地與長(zhǎng)鏈上的游離功能機(jī)團(tuán)反應(yīng)，構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。游離功能機(jī)團(tuán)反應(yīng)，構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。打開丙烯酰胺雙鍵必需的自由基由引發(fā)劑過(guò)硫酸銨打開丙烯酰胺雙鍵必需的自由基由引發(fā)劑過(guò)硫酸銨(APS)提供。凝膠聚合反應(yīng)的催化劑為四乙基乙二胺提供。凝膠聚合反應(yīng)的催化劑為四乙基乙二胺 (TEMED)。 （3）灌制膠板）灌制膠板將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全

26、。一般在膠灌制倒完后，靜止放置使之聚合完全。一般在膠灌制后后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應(yīng)使分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應(yīng)使用高濃度的用高濃度的TEMED和過(guò)硫酸銨。和過(guò)硫酸銨。 4）凝膠制備過(guò)程中的注意事項(xiàng)）凝膠制備過(guò)程中的注意事項(xiàng)a) 使用夾子固定玻璃板時(shí)，最好夾子的力量使用夾子固定玻璃板時(shí)，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過(guò)程中稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過(guò)程中出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象。出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象。 b) 溶解尿素時(shí)不必加熱。如果確需加熱則應(yīng)溶解尿素時(shí)不必加熱。如果確需加熱則應(yīng)等溶液完全冷卻后，方可加入等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED和過(guò)硫和過(guò)硫酸銨。酸

27、銨。c) 灌制凝膠的過(guò)程中要嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡，否則灌制凝膠的過(guò)程中要嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡，否則影響測(cè)序的結(jié)果。影響測(cè)序的結(jié)果。 5凝膠電泳凝膠電泳擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，熱變性擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，熱變性,低溫冷卻低溫冷卻,每個(gè)每個(gè)DNA樣品取樣品取2l，在，在5%變性聚丙烯酰胺凝膠變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，在常壓、上電泳，在常壓、110W下，電泳下，電泳2小時(shí)小時(shí)預(yù)電泳預(yù)電泳（1）當(dāng)凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過(guò)來(lái)，把有齒的一頭插入）當(dāng)凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過(guò)來(lái)，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。（本實(shí)驗(yàn)中采用常規(guī)的梳子，不必如此）凝膠中，形成加樣孔。（本實(shí)驗(yàn)中采用常規(guī)的梳子，不必如此

28、）（2）立即將膠板固定在測(cè)序凝膠槽中，一般測(cè)序凝膠槽的上下槽是分開的，因）立即將膠板固定在測(cè)序凝膠槽中，一般測(cè)序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。緩沖液。（3）稀釋）稀釋10TBE緩沖液至緩沖液至1TBE，將該緩沖液加入上下二個(gè)電泳槽中，去，將該緩沖液加入上下二個(gè)電泳槽中，去除產(chǎn)生的氣泡，接上電源準(zhǔn)備預(yù)電泳。除產(chǎn)生的氣泡，接上電源準(zhǔn)備預(yù)電泳。（4）先將水浴加熱至）先將水浴加熱至55后進(jìn)行預(yù)電泳。后進(jìn)行預(yù)電泳。（5）按）按30V/cm的電壓預(yù)電泳的電壓預(yù)電泳20-30分鐘（恒功率分鐘（恒功率80-90W,約約30min）。預(yù)電

29、泳）。預(yù)電泳的過(guò)程是去除凝膠的雜質(zhì)離子，同時(shí)使凝膠板達(dá)到所需的溫度。高溫電泳可防止的過(guò)程是去除凝膠的雜質(zhì)離子，同時(shí)使凝膠板達(dá)到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區(qū)形成的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。豐富區(qū)形成的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。（6）預(yù)電泳的注意事項(xiàng)）預(yù)電泳的注意事項(xiàng) a) 用鯊魚齒梳制作加樣孔時(shí)，應(yīng)注意將齒尖插入膠中用鯊魚齒梳制作加樣孔時(shí)，應(yīng)注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬(wàn)注意不左右，千萬(wàn)注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結(jié)果；能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結(jié)果；b) 應(yīng)時(shí)刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳應(yīng)時(shí)刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏

30、，否則極易造成短路而損壞電泳儀；儀；c) 厚度小于厚度小于0.4mm的膠可能導(dǎo)致信號(hào)太弱。的膠可能導(dǎo)致信號(hào)太弱。上樣及電泳上樣及電泳（1）關(guān)閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預(yù)電泳時(shí)擴(kuò)散出）關(guān)閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預(yù)電泳時(shí)擴(kuò)散出來(lái)的尿素。來(lái)的尿素。（2）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物:甲酰胺上樣液（甲酰胺上樣液（98%甲酰胺，甲酰胺，10mmEDTA，0.25%溴溴酚蘭酚蘭,二甲苯菁）二甲苯菁）8:3混合，混合，95變性變性8min，然后立即冰浴。如果樣品長(zhǎng)時(shí)，然后立即冰浴。如果樣品長(zhǎng)時(shí)間不用，則應(yīng)重新處理。加樣時(shí)不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地間不用，則應(yīng)重新處理

31、。加樣時(shí)不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍(lán)色樣品。吸取礦物油下的藍(lán)色樣品。AFLP選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物95變性變性8min，然后立，然后立即冰浴。即冰浴。（3）立即用毛細(xì)管進(jìn)樣器吸取樣品，加入樣品孔中。加樣完畢后，立即電）立即用毛細(xì)管進(jìn)樣器吸取樣品，加入樣品孔中。加樣完畢后，立即電泳。開始可用泳。開始可用30V/cm進(jìn)行電泳，進(jìn)行電泳，5分鐘后可提高至分鐘后可提高至40-60V/cm，并保持恒，并保持恒壓狀態(tài)。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)壓狀態(tài)。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)55cm長(zhǎng)，長(zhǎng)，0.4mm厚的凝膠板，在厚的凝膠板，在2500V恒壓狀態(tài)恒壓狀態(tài)下電泳下電泳2小時(shí)即可走到底部，同時(shí)在電泳過(guò)

32、程中，電流可穩(wěn)定地從小時(shí)即可走到底部，同時(shí)在電泳過(guò)程中，電流可穩(wěn)定地從28mA降降至至25mA。(4)結(jié)束電泳結(jié)束電泳待二甲苯菁至三分之二玻璃板長(zhǎng)度處待二甲苯菁至三分之二玻璃板長(zhǎng)度處,停止電泳停止電泳.銀染的原理銀染的原理 是利用銀離子是利用銀離子(Ag+)滲入凝膠中與滲入凝膠中與DNA分子結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)分子結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物。然后在堿性條件下，用甲醛作為還原劑使金屬銀析出，合物。然后在堿性條件下，用甲醛作為還原劑使金屬銀析出，呈現(xiàn)黑褐色銀沉淀而現(xiàn)顯出呈現(xiàn)黑褐色銀沉淀而現(xiàn)顯出DNA分子條帶。分子條帶。 6 銀染或放射自顯影銀染或放射自顯影得到被擴(kuò)增的得到被擴(kuò)增的DNA譜帶，通過(guò)比較即可找出不同

33、樣品譜帶，通過(guò)比較即可找出不同樣品DNA譜帶的差異。譜帶的差異。 染色過(guò)程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個(gè)盤子，大小與玻染色過(guò)程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個(gè)盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質(zhì)量的水洗滌盤子。璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質(zhì)量的水洗滌盤子。（1）電泳完畢后用一個(gè)塑料片子小心地分開兩板，凝膠應(yīng)該牢固地）電泳完畢后用一個(gè)塑料片子小心地分開兩板，凝膠應(yīng)該牢固地附著在長(zhǎng)玻璃板上。附著在長(zhǎng)玻璃板上。（2）固定凝膠：將凝膠）固定凝膠：將凝膠(連玻璃板連玻璃板)放入塑料盤，用固定溶液（醋酸溶放入塑料盤，用固定溶液（醋酸溶液）浸沒(méi)液）浸沒(méi),充分振蕩充分

34、振蕩20分鐘或至樣品中染料完全消失，膠可在固定溶分鐘或至樣品中染料完全消失，膠可在固定溶液中保存過(guò)夜液中保存過(guò)夜(不振蕩不振蕩)。保留固定溶液，用于終止顯影反應(yīng)。保留固定溶液，用于終止顯影反應(yīng)。作用作用使膠轉(zhuǎn)化為酸性狀態(tài)使膠轉(zhuǎn)化為酸性狀態(tài),銀離子好與銀離子好與DNA結(jié)合結(jié)合該步驟不足該步驟不足,會(huì)使硝酸銀結(jié)合的特異性降低會(huì)使硝酸銀結(jié)合的特異性降低,造成染色本底造成染色本底過(guò)高過(guò)高,故膠色發(fā)深故膠色發(fā)深 。（3）洗膠：用超純水振蕩洗膠）洗膠：用超純水振蕩洗膠2次，每次次，每次8分鐘。從水中取出，當(dāng)轉(zhuǎn)分鐘。從水中取出，當(dāng)轉(zhuǎn)移至下一溶液時(shí)拿著膠板邊沿靜止移至下一溶液時(shí)拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使

35、水流盡，再進(jìn)行下一秒，使水流盡，再進(jìn)行下一次洗滌。次洗滌。(4）凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動(dòng)）凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動(dòng)30分鐘。分鐘。(5) 顯影顯影顯影液的配制：在已冷卻至顯影液的配制：在已冷卻至10的碳酸鈉溶液的碳酸鈉溶液(或或NaOH)中，加入中，加入37%甲醛甲醛(3ml)和和10mg/ml的硫代硫酸鈉溶液的硫代硫酸鈉溶液(400l)。往染色盤中倒入預(yù)冷的反應(yīng)液。往染色盤中倒入預(yù)冷的反應(yīng)液1升，放在一邊，其余反應(yīng)液仍放在冰浴中。升，放在一邊，其余反應(yīng)液仍放在冰浴中。b) 膠從染色液中取出，放在一邊，染色液回收到燒杯中，盤清洗后加入超純水。膠從染色液中取出，放在一邊，染色液回收到燒杯中，盤清洗后加入超純水。c) 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。凝膠從超純水轉(zhuǎn)秒。凝膠從超純水轉(zhuǎn)移到顯影溶液的總時(shí)間不能長(zhǎng)于移到顯影溶液的總時(shí)間不能長(zhǎng)于5-10秒。浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則導(dǎo)致信號(hào)微弱或喪秒。浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則導(dǎo)致信號(hào)微弱或喪失信號(hào)。若浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)失信號(hào)。若浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可重復(fù)用染色液