【課件】3.1重組DNA技術(shù)的基本工具（人教版2019選擇性必修3）

1、3.1 重組DNA技術(shù)的基本工具新教材人教版選擇性必修三【教學(xué)過程】Teaching Process1.概念圖3.教學(xué)總結(jié)、綜合2.課堂教 學(xué)內(nèi)容4.課堂練習(xí)鞏固典型習(xí)題規(guī)律總結(jié)探究實(shí)踐建立模型基本工具科技探索之路基因工程：是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫 重組DNA技術(shù)1.1.操作環(huán)境：操作環(huán)境：2.2.原理：原理：3.3.操作對(duì)象：操作對(duì)象：4.4.操作水平：操作水平：5.5.結(jié)果：結(jié)果：體外環(huán)境基因分子水平基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造

2、出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品科技探索之路定向改造生物性狀；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙6.6.意義意義：例1.人的胰島素基因能通過拼接并在受體細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)出相同蛋白質(zhì)-胰島素的理論基礎(chǔ)是？（1）大腸桿菌和人的遺傳物質(zhì)都是 。（2）不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，原因是 。 （3）同一種基因在不同生物體內(nèi)表達(dá)出來的蛋白質(zhì)相同，因?yàn)?。（4）遺傳信息的傳遞都遵循 。 (5) 為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？ 。 DNA中心法則基因的組成、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對(duì)方式相同所有生物共用一整套遺傳密碼科技探索之路 基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳

3、單位 遺傳信息的傳遞都遵循中心法則遺傳信息的傳遞都遵循中心法則 生物界共同一套遺傳密碼生物界共同一套遺傳密碼 番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。 DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。 到社會(huì)中去那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？ 這些“分子工具”各具有什么特征呢？ 到社會(huì)中去那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？ 這些“分子工具”各具有什么特征呢？工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶

4、：DNA連接酶：載體：準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞資料119701970年，史密斯（年，史密斯（H.D.Smith)H.D.Smith)等人首次從大腸桿菌中提取出了一等人首次從大腸桿菌中提取出了一種限制性內(nèi)切核酸酶（種限制性內(nèi)切核酸酶（restriction endonuclease)restriction endonuclease)。這種內(nèi)切核酸酶能。這種內(nèi)切核酸酶能夠識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列，并在特異性的位點(diǎn)上把雙鏈夠識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列，并在特異性的位點(diǎn)上把雙鏈DNADNA分子分子“切切割割”開（如圖開（如圖) )。DNADNA被切割后所

5、產(chǎn)生的交錯(cuò)的切口，也就是在每條鏈的被切割后所產(chǎn)生的交錯(cuò)的切口，也就是在每條鏈的一端留下的單鏈末端，叫做黏性末端。一端留下的單鏈末端，叫做黏性末端。1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具（1）來源：從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來（2）功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具（大部分限制酶切割結(jié)果為黏性末端）EcoREcoR識(shí)別的序列識(shí)別的序列切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)（1）來源：從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來（2）功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸

6、序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具（大部分限制酶切割結(jié)果為黏性末端）EcoREcoR識(shí)別的序列識(shí)別的序列切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)磷酸二酯鍵切點(diǎn)切點(diǎn)（3）切割部位：“切割”的是磷酸二酯鍵（1）來源：從微生物（主要是原核生物）體內(nèi)分離出來（2）功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。（3）作用部位：“切割”的是磷酸二酯鍵（4）切割結(jié)果：切口有兩種：黏性末端和平末端1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具（大部分限制酶切割結(jié)果為黏性末

7、端）EcoREcoR識(shí)別的序列識(shí)別的序列切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)切點(diǎn)（4）切割結(jié)果：大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由_個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由_個(gè)、_個(gè)或_的核苷酸組成648其他數(shù)量EcoR5 5G-A-A-T-T-CG-A-A-T-T-C3 33 3C-T-T-A-A-G5C-T-T-A-A-G5Sma5 5C-C-C-G-G-GC-C-C-G-G-G3 33 3G-G-G-C-C-C5G-G-G-C-C-C5BamH5 5G-G-A-T-C-CG-G-A-T-C-C3 33 3C-C-T-A-G-G5C-C-T-A-G-G5Taq5 5T-C-G-AT-C-G-A333 3A-G-C-

8、T5A-G-C-T5無論是無論是6 6個(gè)堿基還是個(gè)堿基還是4 4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈線兩側(cè)的雙鏈DNADNA上的堿基是上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 ，這就是回文這就是回文序列。序列。能能被限制酶特異性識(shí)別的切割部位基本都具有被限制酶特異性識(shí)別的切割部位基本都具有回文序列回文序列：在切：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致一致。1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具A.形成的黏性末端（從5往3讀）為_B.一個(gè)限制酶切割一次斷兩個(gè)磷酸

9、二酯鍵形成_個(gè)黏性末端C.同一種限制酶切割形成的黏性末端_D.兩個(gè)黏性末端有_個(gè)游離的磷酸基團(tuán)AATT兩相同2 練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:Hind、Hind、 Hind粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia marcesens）Sma大腸桿菌（Escherichia coli R）EcoR1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具【思考1】下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)請(qǐng)回答下列問題：（1）請(qǐng)寫出同時(shí)用EcoR切割含目的基因的DNA的過程。（2）請(qǐng)寫出同時(shí)用

10、BamH和 Hind切割質(zhì)粒的過程。一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶限制酶切質(zhì)粒一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶DNA連接酶連接一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶重組質(zhì)粒一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶限制酶存在于原核生物中的作用是什么?原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效保證自身的安全限制酶為什么不會(huì)剪切原核生物本身的DNA?DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者DNA分子被修飾（甲基化），使限制酶不能將其切開【思考2】一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶【思考3】用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng)(1)獲取目的基因和切割載體時(shí),

11、通常使用同種限制酶,目的是 。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生 ，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是 。(2)獲取一個(gè)目的基因需限制酶切割 次,共產(chǎn)生 個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接兩4分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶【思考3】用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng) (3)選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則： 切割目的基因時(shí)： 。 切割質(zhì)粒時(shí)： 。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，便于篩選一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶【例1】用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)

12、粒，不能使用Sma切割，原因是 。構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，最好選擇限制酶BamH、Hind處理質(zhì)粒、外源DNA，這樣做的目的是 。Sma會(huì)破壞質(zhì)粒中的抗性基因以及破壞目的基因確保目的基因與質(zhì)粒的定向連接一.重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶【思考4】如圖是培育表達(dá)人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線 用圖2中的人乳鐵蛋白目的基因和圖1所示的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，選用的限制酶是 （從“EcoR”、“BamH/Hind”、“Sma/Hind”中選擇）不能選擇其他限制酶的理由分別是： 。 BamH/Hind若選EcoR會(huì)破壞質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)；若選Sma/Hind，則構(gòu)建的重組質(zhì)粒沒有標(biāo)記基因或復(fù)制原點(diǎn)一.重組D

13、NA技術(shù)的基本工具1.限制酶資料219671967年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種能年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)蓚€(gè)夠?qū)蓚€(gè)DNADNA片段連接起來的酶，可以用片段連接起來的酶，可以用它來修復(fù)它來修復(fù)DNADNA鏈的斷裂口，并把這種酶叫鏈的斷裂口，并把這種酶叫做做DNADNA連接酶。連接酶。19701970年，科學(xué)家們又提取年，科學(xué)家們又提取了一種具有更高活性的了一種具有更高活性的T4 DNAT4 DNA連接酶。當(dāng)連接酶。當(dāng)兩個(gè)兩個(gè)DNADNA片段的黏性末端彼此相臨，而且片段的黏性末端彼此相臨，而且它們的堿基能夠互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，它們的堿基能夠互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，DNADNA連接酶連接酶就能把它們之間的縫隙就能把它們

14、之間的縫隙“縫合縫合”起來（如起來（如圖）。圖）。一.重組DNA技術(shù)的基本工具2.DNA連接酶 將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。(1)作用:(2)分類種類Ecoli DNA連接酶T4 DNA連接酶來源功能特性相同點(diǎn)大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對(duì)較低）恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵一.重組DNA技術(shù)的基本工具2.DNA連接酶 旁欄思考（P72）：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什

15、么？DNA連接酶 DNA聚合酶催化兩個(gè)脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵不需要模板 需要DNA的一條鏈為模板游離的DNA片段 單個(gè)的脫氧核苷酸形成完整的DNA分子 形成DNA的一條鏈基因工程 DNA復(fù)制 相同點(diǎn) 不同點(diǎn) 模板 作用對(duì)象 作用結(jié)果 用途 一.重組DNA技術(shù)的基本工具2.DNA連接酶化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)都是催化形成磷酸二酯鍵都是催化形成磷酸二酯鍵相同點(diǎn) 資料419731973年，美國科學(xué)家科恩（年，美國科學(xué)家科恩（S.Cohen)S.Cohen)等人從大腸桿菌中提取出了兩種質(zhì)粒，一種含等人從大腸桿菌中提取出了兩種質(zhì)粒，一種含有卡那霉素抗性基因，另一種含有四環(huán)素抗性有卡那霉

16、素抗性基因，另一種含有四環(huán)素抗性基因。他們將這兩種基因分別基因。他們將這兩種基因分別“切割切割”下來，下來，并拼接在同一個(gè)質(zhì)粒上，然后導(dǎo)入大腸桿菌，并拼接在同一個(gè)質(zhì)粒上，然后導(dǎo)入大腸桿菌，產(chǎn)生了既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的大腸桿菌。產(chǎn)生了既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的大腸桿菌。一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體（1）作用: （2）作為運(yùn)載體需具備的條件: 等（3）種類將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存 有1個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選對(duì)受體細(xì)胞無害一.重組DNA技術(shù)的基本工具3

17、.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體種類用途不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別（4）噬菌體的衍生物或某些動(dòng)植物病毒作為運(yùn)載體利用的原理是 .病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染具有一定的 性。利用病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染性物種（組織）特異【例2】若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用 作為載體，其原因是 。噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體霍亂弧菌中含有質(zhì)粒，但 （填“能”、“不能

18、”）用來做載體，因?yàn)檫x擇的載體應(yīng)該 。對(duì)受體細(xì)胞無害不能（6）質(zhì)粒來源：來源于許多 等生物，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的 （化學(xué)本質(zhì)），故質(zhì)粒有 個(gè)游離的磷酸基團(tuán)氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上稱為 ，還有如： 等；其作用是 。細(xì)菌和酵母菌雙鏈環(huán)狀DNA分子0標(biāo)記基因用于鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體最好回答：最好回答：將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來（6）質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)： 。 DNA分子復(fù)制的起點(diǎn)一.重組DNA技術(shù)的基本工具3

19、.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。細(xì)菌質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌擬核之外的細(xì)胞質(zhì)DNA分子，侵入宿主細(xì)胞后 A.有的可以獨(dú)立地進(jìn)行自我復(fù)制， B.有的則整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，隨著宿主細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。若質(zhì)粒DNA分子的切割末端為 ， 則與之連接的目的基因切割末端應(yīng)為 ；可使用 把質(zhì)粒和目的基因連接起來。ATGCGCCGCGT ADNA連接酶重組DNA分子請(qǐng)?jiān)趦蓮埣埳戏謩e寫上下面兩段DNA序列： 請(qǐng)你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。然后,用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部

20、切開后,將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處,并用透明膠條將切口粘連起來。 1. 1.剪刀和透明膠條分別代表哪剪刀和透明膠條分別代表哪種種“分子工具分子工具” ?” ?一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。重組DNA分子請(qǐng)?jiān)趦蓮埣埳戏謩e寫上下面兩段DNA序列： 請(qǐng)你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。然后,用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開后,將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處,并用透明膠條將切口粘連起來。 2.2.你制作的黏性末端的堿基能你制作

21、的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)？如果不能，可能是不能互補(bǔ)配對(duì)？如果不能，可能是什么原因造成的？什么原因造成的？一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體根據(jù)學(xué)生實(shí)際操作的情況進(jìn)行指導(dǎo)。如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。重組DNA分子請(qǐng)?jiān)趦蓮埣埳戏謩e寫上下面兩段DNA序列： 請(qǐng)你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。然后,用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開后,將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處,并用透明膠條將切口粘連起來。一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體

22、細(xì)胞的載體 3. 3.你插入的你插入的DNADNA片段能稱得上片段能稱得上一個(gè)基因嗎？一個(gè)基因嗎？不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。（1）質(zhì)粒與擬核中的DNA有哪些相同點(diǎn)：（至少寫出兩點(diǎn)） 。 。 。（2）質(zhì)粒 （是/不是）一種細(xì)胞器。（3）細(xì)胞膜上的載體蛋白與基因工程中的載體的區(qū)別 化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體： ?；蚬こ讨械妮d體可能是物質(zhì)，如 ；也可是生物，如 ；也可是噬菌體的衍生物。 功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是 ;基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”,把 ?；瘜W(xué)本質(zhì)和結(jié)構(gòu)相同能夠自我復(fù)制具有遺傳效應(yīng)或都能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成等不是蛋白質(zhì)質(zhì)粒動(dòng)植物病毒協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出

23、細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞【例3】辨析填空一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體【例4】在基因工程中，已知限制酶的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GGATCC，限制酶的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GATC。根據(jù)下圖示判斷下列操作錯(cuò)誤的是( )A.質(zhì)粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割B.用限制酶切割獲得目的基因時(shí)，有四個(gè)磷酸二酯鍵被水解C.限制酶和限制酶切割后獲得的黏性末端相同D.質(zhì)粒中標(biāo)記基因便于篩選出目的基因已經(jīng)表達(dá)的細(xì)胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA連接酶連接的重組DNA還能用上面兩種酶切割DE一.重組DNA技術(shù)的基本工具【例5】某線性DNA分子含有3000個(gè)堿基對(duì)(bp)，先用限制

24、酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。下列有關(guān)說法正確的是()a酶切割產(chǎn)物(bp)b酶再次切割產(chǎn)物(bp)1600；1100；300800；300A.在該DNA分子中，a酶與b酶的識(shí)別序列分別有3個(gè)和2個(gè)B.a酶與b酶切出的黏性末端不能相互連接C.a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵不相同D.用這兩種酶和DNA連接酶對(duì)該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后，DTCTAGGAGATCC序列會(huì)明顯增多一.重組DNA技術(shù)的基本工具【例6】若要用上圖質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒,需要對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行改造,構(gòu)建新的限制酶切位點(diǎn)。在構(gòu)建新的限制

25、酶切位點(diǎn)的過程中需要使用的酶是（ ）A限制酶Pst、DNA連接酶、DNA聚合酶 B.限制酶EcoR、DNA連接酶、DNA聚合酶C.限制酶EcoR、限制酶Pst、DNA聚合酶D.限制酶Pst、限制酶EcoR、DNA連接酶B一.重組DNA技術(shù)的基本工具3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1 鐮刀型細(xì)胞貧血癥的病因是血紅蛋白基因的堿基序列發(fā)生了改變。檢測(cè)這種堿基序列必須使用的酶是 A解旋酶BDNA連接酶C限制性核酸內(nèi)切酶DRNA聚合酶鐮刀型細(xì)胞貧血癥是鐮刀型細(xì)胞貧血癥是DNADNA中一個(gè)中一個(gè)CTTCTT變成變成CAT,CAT,即其中一個(gè)堿基即其中一個(gè)堿基T T變成變成A,A,以致產(chǎn)生病變以致產(chǎn)生病變. .致

26、使血紅蛋白致使血紅蛋白鏈中鏈中N N端第端第6 6個(gè)氨基酸由個(gè)氨基酸由谷氨酸（谷氨酸（GluGlu）轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(Val) (Val) 限制酶識(shí)別特定限制酶識(shí)別特定DNADNA序列序列C二.能力提升不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同；【解析：酶具有專一性，識(shí)別的序列相同解析：酶具有專一性，識(shí)別的序列相同】二.能力提升你能用DNA連接酶將他們連接起來嗎？2和 ； 3和 ；1和 ； 4和 。7658旋轉(zhuǎn)180度二.能力提升判斷兩個(gè)末端是否為同一種限制酶切割產(chǎn)生的方法：將其中一個(gè)末端旋轉(zhuǎn)180度，若與另一個(gè)完全相同，則說明兩個(gè)末端是用同一種限制酶切割2 已知EcoR的

27、識(shí)別序列和切點(diǎn)是GAATTC，BamH的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GGATCCEcoRBamH同一個(gè)DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同；【解析：酶具有專一性，識(shí)別的序列不同解析：酶具有專一性，識(shí)別的序列不同】二.能力提升2 已知BamH的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GGATCC，Sau3A的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GATCBamHSau3A同一個(gè)DNA分子用不同限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同,(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配對(duì)連接成鏈）GCGCCGCG總結(jié)：產(chǎn)生相同的黏性末端不一定都是用同一種限制酶切割二.能力提升2 已知BamH的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GGATCC，Sau3A的識(shí)別序列和切點(diǎn)是

28、GATCBamH不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互補(bǔ)則可以相互重新配對(duì)連接Sau3A總結(jié)：兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端二.能力提升用這兩種酶和DNA連接酶對(duì)該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后，序列會(huì)明顯 （增多、減少、不變）TCTAGGAGATCC增多總結(jié)：兩種同尾酶切割的DNA片段連接后，原來的酶切位點(diǎn)將不存在，不能再被原來的限制酶識(shí)別二.能力提升【例1】基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，已知BamH的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GGATCC，Sau3A的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GATC酶切結(jié)果：BamH， 。Sau3A， 。形成一個(gè)切口形成兩個(gè)DNA片段使用 （限制酶

29、）提取目的基因Sau3A二.能力提升【例2】在DNA 測(cè)序工作中，需要將某些限制性內(nèi)切酶的限制位點(diǎn)在 DNA上定位，使其成為 DNA 分子中的物理參照點(diǎn)。這項(xiàng)工作叫做“限制酶圖譜的構(gòu)建”。假設(shè)有以下一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)：用限制酶 Hind，BamH和二者的混合物分別降解一個(gè) 4kb（1kb即1千個(gè)堿基對(duì)）大小的線性DNA 分子，降解產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳，在電場(chǎng)的作用下，降解產(chǎn)物分開，如下圖所示。據(jù)此分析，這兩種限制性內(nèi)切酶在該DNA 分子上的限制位點(diǎn)數(shù)目是以下哪一組？ AHind1個(gè)，BamH2 個(gè) BHind2個(gè)，BamH3個(gè)CHind2個(gè)，BamH1 個(gè) DHind和BamH各有2 個(gè)二.能力提升A【

30、例3】限制性內(nèi)切酶能識(shí)別特定的DNA序列并進(jìn)行剪切，不同的限制性內(nèi)切酶可以對(duì)不同的核酸序列進(jìn)行剪切。現(xiàn)以3種不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)一6.2kb大小的線狀DNA進(jìn)行剪切后。用凝膠電泳分離各核酸片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示。請(qǐng)問：3種不同的限制性內(nèi)切酶在此DNA片段上相應(yīng)切點(diǎn)的位置（ ）二.能力提升請(qǐng)問：3種不同的限制性內(nèi)切酶在此DNA片段上相應(yīng)切點(diǎn)的位置（ ）D6.2kb大小的線狀DNA二.能力提升使用的限制酶EcoBBamH HinD含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況含青霉素的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況二.能力提升 3 重組質(zhì)粒的篩選二.能力提升 3 重組質(zhì)粒的篩選【例4】為制備目的基因Y（圖19）與質(zhì)粒X（圖20

31、）的重組DNA，將質(zhì)粒X與含Y的DNA片段加入含有限制性核酸內(nèi)切酶BgI與BamH的反應(yīng)混合物中，酶切后的片段再加入含有連接酶的反應(yīng)體系中。其中，質(zhì)粒X含有l(wèi)eu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR使用BgI II處理重組質(zhì)粒，可以得到 。A長(zhǎng)度為3300bp的環(huán)狀DNA B長(zhǎng)度為3300bp的線形DNA C長(zhǎng)度為2800bp和500bp的線DNA D長(zhǎng)度為2800bp的環(huán)狀DNAA二.能力提升【例4】為制備目的基因Y（圖19）與質(zhì)粒X（圖20）的重組DNA，將質(zhì)粒X與含Y的DNA片段加入含有限制性核酸內(nèi)切酶BgI與BamH的反應(yīng)混合物中，酶切后的片段再加入含有連接

32、酶的反應(yīng)體系中。其中，質(zhì)粒X含有l(wèi)eu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR要篩選含有重組質(zhì)粒的Z細(xì)胞，應(yīng)選擇 的培養(yǎng)基。 含卡那霉素但不含亮氨酸的培養(yǎng)基二.能力提升【例5】某質(zhì)粒上有Sal、Hind、BamH三種限制酶切割位點(diǎn)，同時(shí)還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程如圖所示：二.能力提升（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用Sal酶切，酶切產(chǎn)物用_ 催化連接后，一個(gè)DNA片段的連接結(jié)果有_種。DNA連接酶2載體自身連接、目的基因自身環(huán)化載體自身連接、目的基因自身環(huán)化二.能力提升（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用Sal酶切

33、，酶切產(chǎn)物用_ 催化連接后，兩個(gè)DNA片段的連接結(jié)果有_種。DNA連接酶3載體載體- -載體、目的基因載體、目的基因- -目的基因、載體目的基因、載體- -目的基因目的基因二.能力提升【例6】研究人員利用Ti質(zhì)粒構(gòu)建pH5/H3共表達(dá)重組質(zhì)粒（如下圖)。設(shè)計(jì)思路是：獲得H5基因和H3基因，先將H5基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(僅含有Nhe和Xho酶切位點(diǎn)）上，再將H3基因插入，獲得重組質(zhì)粒。為達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，需在H5基因兩端分別引入_和_酶切位點(diǎn)。通常酶切位點(diǎn)的引入方法是在PCR過程中，通過設(shè)計(jì)使其出現(xiàn)在_中，進(jìn)而出現(xiàn)在H5基因中。NheCla、Xho引物二.能力提升二.能力提升解析

34、：解析：DNA的粗提取與鑒定 DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。例如， DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L.的NaCl溶液。在一定溫度下， DNA遇二苯膠試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。 目的要求 1.了解DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)，理解DNA粗提取和鑒定的原理。 2.學(xué)會(huì)DNA粗提取的方法以及用二苯膠試劑對(duì)DNA進(jìn)行鑒定。 材料用具 1.材料：新鮮洋蔥（也可以選擇香焦、菠菜、菜

35、花和豬肝等作為實(shí)驗(yàn)材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。研磨液和二苯胺試劑的配制方法參見本書附錄2。 2.用具：燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網(wǎng)、三腳架、火柴、刀片和天平等。三.探究實(shí)踐 方法步驟 1. 稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 2.在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1 500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，再取上清液放人燒杯中。 3.

36、在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2-3 min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA，用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或者將溶液倒入塑料離心管中，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA )晾于。 4.取兩支20 mL的試管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 ml，將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4 mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。DNA的粗提取與鑒定三.探究實(shí)踐

37、方法步驟材料的獲材料的獲取與研磨取與研磨析出析出DNADNADNADNA的鑒定的鑒定DNADNA鑒定鑒定的結(jié)果的結(jié)果DNA的粗提取與鑒定三.探究實(shí)踐 結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？ 觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。 二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功； 如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。DNA的粗提取與鑒定三.探究實(shí)踐 結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？ 3.與其他同學(xué)提取的DNA進(jìn)行比較，看看實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何不同，分析產(chǎn)生差異的原因。本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。DNA的粗提取與鑒定三.探究實(shí)踐本實(shí)驗(yàn)可以采取分組的方式進(jìn)行?？梢赃x取不同的實(shí)驗(yàn)材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法；對(duì)同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果；如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等；看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。 進(jìn)一步探究 本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)DNA進(jìn)行了粗提取，請(qǐng)?jiān)陂嗁Y料，了解實(shí)驗(yàn)室提取純度較高的DN