高速逆流色譜

1、高速逆流色譜及其應(yīng)用王莉 (貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴陽(yáng)，550003)摘要：高速逆流色譜是近年發(fā)展起來的，不使用固定相載體的新型液液逆流色譜。本文介紹了高速逆流色譜的工作原理，HSCCC在的分離方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。本文主要綜述了HSCCC在天然產(chǎn)物、生物醫(yī)藥和其他方面的應(yīng)用情況。關(guān)鍵詞：高速逆流色譜；天然產(chǎn)物；分離；應(yīng)用Application of High Speed Countercurrent ChromatographyWANG Li（School of Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 55000

2、3，China）Abstract: The high-speed countercurrent chromatography (HSCCC) is developing in recent year which without fixed carrier. The work principle，characteristics of HSCCC were introduced in this paper，which summarized the application and purification of HSCCC on the natural product，biomedicine and

3、 so on，especially the application on the fields of purification and isolation natural productKey words: HSCCC; natural product; isolation; application引言高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài)的支撐物或載體。它利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動(dòng)力學(xué)平衡，當(dāng)其中一相作為固

4、定相，另一相作為流動(dòng)相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。 由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特別適合于天然生物活性成分的分離。而且由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分離手段。 它相對(duì)于傳統(tǒng)的固-液柱色譜技術(shù)，具有適用范圍廣、操作靈活、高效、快速、制備量大、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。目前HSCCC技術(shù)正在發(fā)展成為一種備受關(guān)注的新型分離純化技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等領(lǐng)域，特別在天然產(chǎn)物

5、行業(yè)中已被認(rèn)為是一種有效的新型分離技術(shù)；適合于中小分子類物質(zhì)的分離純化。1 高速逆流色譜原理高速逆流色譜是建立在一種特殊的流體動(dòng)力學(xué)平衡的基礎(chǔ)上，利用螺旋管的高速行星式運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的不對(duì)稱離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時(shí)保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵連續(xù)輸入另一相(流動(dòng)相)，此時(shí)在螺旋柱中任何一部分，兩相溶劑反復(fù)進(jìn)行著混合和靜置的分配過程。流動(dòng)相不斷穿過固定相，隨流動(dòng)相進(jìn)入螺旋柱的溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，按分配系數(shù)的大小次序被依次洗脫。高速逆流色譜儀器的裝置如圖1所示，它的公轉(zhuǎn)軸水平設(shè)置，螺旋管柱距公轉(zhuǎn)軸R處安裝，兩軸線平行。通過齒輪傳動(dòng)，使螺旋管柱實(shí)現(xiàn)在繞儀器中心軸線公轉(zhuǎn)的同時(shí)，繞自

6、轉(zhuǎn)軸作相同方向相同角速度的自轉(zhuǎn)。圖 1 高速逆流色譜儀器裝置示意圖Fig.1 Illustrative diagram of instrument installation of HSCCC在對(duì)管柱里兩相溶劑狀態(tài)進(jìn)行頻閃觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，在用選定溶劑體系的下相作流動(dòng)相的條件下，管柱里會(huì)出現(xiàn)如圖2所示的分布區(qū)帶。在達(dá)到穩(wěn)定的流體動(dòng)力學(xué)平衡態(tài)后，柱中呈現(xiàn)兩個(gè)絕然不同的區(qū)域：在靠近離心軸心大約有四分之一的區(qū)域，呈現(xiàn)兩相的激烈混合(混合區(qū))；其余區(qū)域兩溶劑相分成兩層(靜置區(qū))，較重的溶劑相在外部，較輕的溶劑相在內(nèi)部，兩相形成一個(gè)線狀分界面。然后根據(jù)各自的分配系數(shù)不同而先后被洗脫出來，達(dá)到分離的目的。圖2 高

7、速逆流色譜螺旋管內(nèi)溶劑體系的區(qū)域分布圖Fig.2 Diagram of distribution of solvent system in the rotating coil in HSCCC2 HSCCC的應(yīng)用2.1 HSCCC在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用隨著當(dāng)前生物醫(yī)藥等研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，越來越多的天然產(chǎn)物(包括對(duì)一些具有高附加值的天然活性分子)的提取分離，特別是藥物中間體的合成過程中有效成分的分離，都需要建立快速、高效的現(xiàn)代分離方法，而高速逆流色譜法對(duì)于加強(qiáng)上述領(lǐng)域的藥物開發(fā)支持體系提供了一條嶄新的途徑。2.1.1 氟嗎啉原藥中有機(jī)雜質(zhì)的分離氟嗎啉(flumorph)是沈陽(yáng)化工研究院創(chuàng)制開發(fā)的含

8、氟二苯丙烯酰嗎啉類殺菌劑，化學(xué)名稱為4-3-(3, 4-二甲氧基苯基)-3-(4-氟苯基)丙烯酰嗎啉。氟嗎啉有2種互變異構(gòu)體z型和E型。王遠(yuǎn)1等應(yīng)用高速逆流色譜，選擇正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比1：l：1：1 )為兩相體系對(duì)氟嗎啉原藥進(jìn)行分離純化，并用高效液相色譜法測(cè)定分離物的純度。結(jié)果表明：經(jīng)過高速逆流色譜1次分離，除活性組分氟嗎啉外共分離得到3個(gè)純度超過95的有機(jī)雜質(zhì)。2.1.2 分離純化續(xù)隨子種子中七葉內(nèi)酯藥理實(shí)驗(yàn)表明：七葉內(nèi)酯具有抗炎、抗菌止咳、祛痰、平喘等藥理作用2?，F(xiàn)代研究證明：續(xù)隨子種子中含有香豆素類成分，其中七葉內(nèi)酯具有促進(jìn)血液循環(huán)的作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有增加尿量和

9、促進(jìn)尿酸從組織中排出的效果，這與中醫(yī)的逐水消腫作用一致3余霞等4建立了HSCCC技術(shù)分離純化續(xù)隨子種子中七葉內(nèi)酯的方法。將續(xù)隨子種子的乙酸乙酯萃取物直接進(jìn)行高速逆流色譜分離，考察了不同溶劑系統(tǒng)的分離效果。結(jié)果表明，最佳的溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水(體積比為4：3：2)，以其上相為固定相，下相為流動(dòng)相。從200 mg續(xù)隨子種子乙酸乙酯萃取物中分離得到80 mg七葉內(nèi)酯，純度為99.04。HSCCC技術(shù)可高效分離純化續(xù)隨子種子中的七葉內(nèi)酯，為得到高純度的七葉內(nèi)酯提供了制備技術(shù) 。2.1.3 分離制備麥角甾醇純品蝙蝠蛾擬青霉最早是從冬蟲夏草樣品(昆蟲為蟲草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus

10、 Oberthiir的幼蟲(僵蟲)上分離得到的，其菌絲粉在化學(xué)成分、藥理作用及臨床效果上與天然蟲草基本一致，具有補(bǔ)肺益腎、秘精益氣之功效?，F(xiàn)代研究表明，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體中的主要化學(xué)成分有麥角甾醇(ergosterol)、麥角甾醇過氧化物、正二十五烷酸、大豆素、對(duì)羥基苯乙酸甲酯、類生物堿物質(zhì)等，其中麥角甾醇是主要有效成分。麥角甾醇是脂溶性維生素 D2的前體，當(dāng)受到紫外線照射時(shí)可轉(zhuǎn)化為維生素D2，它是一種重要的醫(yī)藥化工原料，可用于可的松、黃體酮等藥物的生產(chǎn)，在食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中應(yīng)用廣泛。章能勝等5建立了用高速逆流色譜從蝙蝠蛾擬青霉中高效、快速分離制備高純度麥角甾醇的方法。將蝙蝠蛾擬青霉的乙酸

11、乙酯提取物直接進(jìn)行高速逆流 色譜分離，考察了不同溶劑系統(tǒng)的分離效果。結(jié)果表明，最佳的溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比為 6：1.7：6：0.3)，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，轉(zhuǎn)速為850rmin，流速為2 mLmin，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。制備所得的麥角甾醇經(jīng)紫外光譜(UV)和高分辨質(zhì)譜(HRMS)鑒定及與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照定性；純度經(jīng)高效液相色譜( HPLC)分析為99.2 (峰面積歸一化法)。該方法制備麥角甾醇簡(jiǎn)便、快速，所得產(chǎn)物的純度高，適合于麥角甾醇對(duì)照品的制備。2.2 HSCCC在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用2.2.1 生物堿類生物堿是重要的天然含氮化合物，對(duì)疾病治療和藥物開發(fā)等具有重

12、要意義。近年來，用HSCCC已成功分離了多種生物堿。分離生物堿成分常用的溶劑體系是正已烷-乙酸乙酯-甲醇 (或者乙醇、正丁醇)-水體系及三氯甲烷-甲醇-水體系6。程悅7等應(yīng)用高速逆流色譜法分離制備了苦茶中的苦茶堿。以正己烷-二氯甲烷-甲醇-水 (體積比為1：5：4：2 )為兩相溶劑系統(tǒng)，在主機(jī)轉(zhuǎn)速800 rmin、流速2.0 mLmin、檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm條件下進(jìn)行分離制備。所得流分經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，與對(duì)照品進(jìn)行比較，并通過質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，從2.22 g苦茶總生物堿提取物中分離得到了3個(gè)化合物，分別為可可堿5 mg，苦茶堿389 mg，咖啡堿41 mg

13、，純度均在99以上，系首次采用高速逆流色譜法對(duì)苦茶中的苦茶堿進(jìn)行分離。該法具有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)。Tang8等以乙酸乙酯-n-正丁醇-甲醇-2鹽酸(3.5：1.5：2：4.5)為兩相系統(tǒng)從黃花烏頭中分離開出GFT，GFU兩種生物堿，并且兩種生物堿的純度都大于95。2.2.2 黃酮類黃酮類化合物多存在于高等植物和蕨類植物中，常以游離或與糖結(jié)合成苷的形式存在，在花、葉、果實(shí)等組織中多為苷類，而在木質(zhì)部組織中多為游離苷元。主要包括黃酮、異黃酮、二氫黃酮、兒茶精、花色素等及各種衍生物。分離極性較大的黃酮苷類成分時(shí)，一般應(yīng)用正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水溶劑系統(tǒng)，并適當(dāng)增加體系的極性。分離游離的黃酮類

14、化合物常用氯仿-甲醇-水體系。利用HSCCC技術(shù)能夠有效地分離黃酮類化合物。已見報(bào)道用氯仿-甲醇-水(4：3：2 )體系分別分離了陳皮和沙棘中的橙皮苷和茨非醇9；用氯仿-甲醇-水(4：3：2)體系曾從芫花總黃酮中分離得到羥基芫花素、洋芹素、木樨草素”10；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：3：l：6)體系從紅茶分離了茶黃素11；用氯仿-甲醇-水(10：7：3)分離了雪蓮中的黃酮類成分12；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9：l：5：5)從掌葉大黃的根莖中分離出大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃酚和大黃素”13。用乙酸乙酯-正丁醇-水( 2：l：3) 溶劑系統(tǒng)，可以從葛根粗提物中進(jìn)一步分離包括葛

15、根素在內(nèi)的七個(gè)異黃酮化合物14。2.2.3 木脂素和香豆素類 報(bào)道用正己烷-甲醇-水( 6：5：5 ) 溶劑系統(tǒng)從江花五味子果實(shí)的核的乙醇萃取物中分離了2個(gè)結(jié)構(gòu)十分相似的木脂素的成分-schisanhend及其乙酸化物15；氯仿-甲醇-水( 13：7：8 ) 的兩相體系分離并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧香豆素、7-羥基-6-甲氧基香豆素和7-羥基香豆素16。 2.3 HSCCC的其他應(yīng)用HSCCC也廣泛應(yīng)用于其他研究領(lǐng)域。胡江涌等17采用超微回流提取方法提取土豆葉中的茄尼醇，用HSCCC對(duì)粗提物中的茄尼醇進(jìn)行分離純化。以正己烷-甲醇作為兩相溶劑系統(tǒng)，以其下相為流動(dòng)相，上相為固定相，

16、從60mg茄尼醇粗提物中分離得到了5mg純度為98.7%的茄尼醇。并進(jìn)一步對(duì)茄尼醇進(jìn)行大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜解析，研究了茄尼醇的大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜的一級(jí)電離規(guī)律和二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律。肖陽(yáng)等18選擇溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，采用水中直接蒸餾的方法提取小茴香精油，并用氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)（GC-MS）確認(rèn)香精油結(jié)構(gòu)。夏興等19 采用HSCCC技術(shù)，對(duì)真菌HCCB00106 的雄甾烯二酮（4AD）轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了分離研究，在選定體系中底物4AD、雜質(zhì)及主要產(chǎn)物得到了較好的分離，主要產(chǎn)物為睪內(nèi)酯（17-氧代-D-擴(kuò)環(huán)-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮）。3. 展望HSCCC儀器價(jià)格低廉、性能可靠、分析成本低

17、、易于操作，是一種適用于中藥和天然產(chǎn)物研究的現(xiàn)代化儀器。經(jīng)過多年的發(fā)展，HSCCC作為一種分析及制備技術(shù)日趨成熟和完善，將其應(yīng)用于天然產(chǎn)物分離的研究方興未艾。目前，盡管HSCCC還有許多理論和技術(shù)問題需要深入的研究，還存在一些不足之處，如消耗溶劑多、檢測(cè)限較低、靈敏度較差等20；但由于HSCCC與其他色譜分離技術(shù)相比具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，隨著各種相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，HSCCC將會(huì)在天然藥物化學(xué)的相關(guān)研究中發(fā)揮更為重要的作用。 參考文獻(xiàn)1 王遠(yuǎn), 張立, 胥維昌, 等. 高速逆流色譜在氟嗎啉原藥雜質(zhì)分離中的應(yīng)用. 農(nóng)藥, 2009, 48(5), 341-343.2 Sheng P, Du

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