RNAi制備siRNAs的方法

1、RNAi:制備siRNAs的方法越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA(smallinterferingRNAs,siRNAs)來抑制特定的哺乳動物基因表達。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑(RNAinterferencepathway)。RNAi的應(yīng)用包括功能基因組學，藥物靶篩選，細胞信號傳導通路分析等等。目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括?化學合成?體外轉(zhuǎn)錄?長片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)?siRNA表達載體或者病毒載體

2、在細胞中表達siRNAs?PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉(zhuǎn)染到細胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點。哪種是最好的方法，其實取決于實驗?zāi)康摹＿@里簡單介紹這5種方法，優(yōu)點和缺點，以及它們最適合的應(yīng)用。siRNA的設(shè)計除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA前都需要單獨設(shè)計siRNA序列。關(guān)于怎樣設(shè)計siRNA以及siRNA設(shè)計對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關(guān)設(shè)計原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說，每個目標序列設(shè)計34對siRNA

3、s,在后面的實驗中選擇最有效的那個。網(wǎng)上有提供免費的siRNA設(shè)計工具。體外制備化學合成盡管化學合成是最貴的方法，但是卻是最方便的一一研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成34對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素體外轉(zhuǎn)錄通過體外轉(zhuǎn)錄的方法可以合成si

4、RNAs,這樣的成本相對化學合成法而言比較低，是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。以SilencersiRNAConstructionKit為例，一旦得到DNAOligo模版(這個還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了)，只要24小時就可以，不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs,但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間一一畢竟，化學合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要

5、較低的濃度就可以達到化學合成siRNAs較高濃度得到的效果(0.5-20nMvs.50-100nMpertransfection，圖2)最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs,化學合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。Figure2.UseofChemicallySynthesizedandinVitroTranscribedsiRNAstoInduceGeneSilencing.siRNAstargeting?-Actinwerepreparedbychemicalsynthesis(Ambion)orbyinvitrotrans

6、criptionusingAmbion'sSilencer?siRNAConstructionKit.HeLacellswereplatedat30,000cellsperwellina24welltissuecultureplatecontainingglassslides.Figure2.UseofChemicallySynthesizedandinVitroTranscribedsiRNAstoInduceGeneSilencing.siRNAstargeting?-Actinwerepreparedbychemicalsynthesis(Ambion)orbyinvitrotr

7、anscriptionusingAmbion'sSilencer?siRNAConstructionKit.HeLacellswereplatedat30,000cellsperwellina24welltissuecultureplatecontainingglassslides.Thecellsweretransfected24hoursafterplating,using2lsiPORT?Lipid(Ambion)accordingtothemanufacturer'sprotocol,atafinalsiRNAconcentrationof75nM.Immunofluo

8、rescenceanalysiswasperformed96hrposttransfectionusingmouseanti-Human?-ActinprimaryantibodyandaFITCconjugatedanti-mouseIgGsecondaryantibody.PhotographsweretakenusingtheappropriatefluorescentfiltersandquantifiedusingMetaMorphsoftware.NotethatbothsiRNApreparationmethodsresultedin>_95%reductionin?-ac

9、tinproteinlevels.1. 用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法一一制備一份混合有各種siRNAs混合雞尾酒”就可以避免這個缺陷。這個方法是選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在體外消化，得到一眾siRNAs'混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的si

10、RNAs,通常能夠保證目的基因被有效地抑制。dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢(注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜)。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響(1-4)。Ambion公司曾經(jīng)用它的SilencersiRNACocktailKit(RNaseIII)試劑盒成功關(guān)閉幾個基因，包括c-fos,GAPDH,La,?-actin,和Ku-70。最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型不適用于：長時間的研究項

11、目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療Figure3.GeneSilencingwiththeSilencer?siRNACocktailKit.ApopulationofsiRNAstargeting200ntoftheKu-70mRNAwaspreparedwiththeSilencersiRNACocktailKit(RNaseIII)andtransfectedintoHeLacellsatafinalconcentrationof100nM.Cellswereanalyzed48hourslaterbyimmunofluorescence.Ku-70levelsw

12、erereduced86%incellstransfectedwiththesiRNAcocktail,comparedtonon-transfectedcontrols.體內(nèi)表達前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。2. siRNA表達載體多數(shù)的siRNA表達載體依賴3種RNA聚合酶III啟動子（polIII）中的一種，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達（1-4）。這3類

13、啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNApolIII啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。不過好好載體容易大量擴增，這個優(yōu)點足以彌補所有缺陷，特別是當載體在實驗中確實有效的時候。毫無疑問，siRNA表達載體的優(yōu)點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表

14、達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對轉(zhuǎn)染帶有篩選標記質(zhì)粒的細胞進行瞬時篩選，也有助于富集帶質(zhì)粒的細胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問題。最近多個廠家開始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便。最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達siRNA的細胞。長期研究。不適用于：篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作)不適用于：篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作

15、)不適用于：篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作)Figure4.LongTermSilencingofGFPwithpSilencer?2.1-U6hygro.HeLacellsexpressingcycle3GFPweretransfectedwithpSilencer2.1-U6hygrocontaininganinsertencodingansiRNAtargetingcycle3GFPorpSilencer2.1-U6hygrowithoutansiRNA-encodinginsert.Followingtransfection,thecellsw

16、ereselectedwithhygromycin.Threeweeksfollowingselection,thecellswereanalyzedforGFPexpressionbyfluorescencemicroscopy.Green:GFP.Blue:DAPIstainednuclei.GFPlevelswereremarkablyreduced(94%)incellstransfectedwiththeGFPsiRNA-encodingpSilencer2.1-U6hygrosiRNAExpressionVectorascomparedtothosetransfectedwitha

17、n"empty"siRNAexpressionvector.3. siRNA表達框架siRNA表達框架(siRNAexpressioncassettes,SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。這個方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一個RNApolIII啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA,一個RNApolIII終止位點。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定

18、的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配！如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究。這個方法的主要缺點是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中。如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備。SilencerExpresssiRNAExpressionCassetteKits提供人源和鼠源的U6啟動子或者人源H1啟動子元件可供選擇，并已經(jīng)過c-fos基因抑制的檢驗。最適用于：篩選siRNA序列，在

19、克隆到載體前篩選最佳啟動子不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）同intorc-FcsScranibietlanegativecontrolsiRNA(scramble)£-105casseiteMENostt-Hosaffli小結(jié)Figure5.VariableReductioninTargetGeneExpressionUsingSECswithDifferentPromoters.siRNAExpressionCassettesfeaturingthemouseU6(Mo-U6),humanU6(Hu-U6),andhumanH1(Hu-H1)promotersandencodingac-fos-specifichairpinsiRNAweretransfectedintoHeLacells.72hourspost-transfection,thecellswereassessedusingnuclearstainingw