隆線(xiàn)溞夏卵胚胎發(fā)育過(guò)程中形態(tài)及蛋白質(zhì),氨基酸組成和含量的變化

1、隆線(xiàn)溞夏卵胚胎發(fā)育過(guò)程中形態(tài)及蛋白質(zhì),氨基酸組成和含量的變化摘要：本文系統(tǒng)地觀察了隆線(xiàn)溞夏卵的胚胎發(fā)育.根據(jù)胚胎外部形態(tài)學(xué)特征,將其胚胎發(fā)育分為卵期,長(zhǎng)胚期,雙復(fù)眼期和單復(fù)眼期四個(gè)主要時(shí)期,并采用生物化學(xué)方法測(cè)定和分析了隆線(xiàn)溞夏卵胚胎發(fā)育過(guò)程中蛋白質(zhì)和氨基酸的組成.實(shí)驗(yàn)得知，可溶性蛋白和氨基酸含量的變化趨勢(shì)與隆線(xiàn)溞夏卵胚胎發(fā)育的特征密切相關(guān)，卵期可溶性蛋白和氨基酸含量呈下降趨勢(shì)，而長(zhǎng)胚期略有所上升，但從雙復(fù)眼期至胚胎準(zhǔn)備孵化期間又持續(xù)下降。隨著隆線(xiàn)溞夏卵胚胎的發(fā)育，可溶性蛋白的組成由大分子量的蛋白向小分子量的蛋白轉(zhuǎn)化；在所有的氨基酸中谷氨酸的含量最高，必需氨基酸中亮氨酸的含量最高。結(jié)果表明，蛋

2、白質(zhì)和氨基酸是隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育過(guò)程中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅用于胚胎發(fā)育組織和器官的構(gòu)建，而且為胚胎發(fā)育提供能量。關(guān)鍵詞：隆線(xiàn)溞；胚胎發(fā)育；蛋白質(zhì)；氨基酸1引言枝角類(lèi)（Cladocera）是一類(lèi)優(yōu)質(zhì)天然餌料，研究枝角類(lèi)的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖以進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)意義重大。在枝角類(lèi)種群、生長(zhǎng)、繁殖、發(fā)育及環(huán)境評(píng)價(jià)等方面，已有不少報(bào)道。對(duì)枝角類(lèi)胚胎發(fā)育的研究，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者多著眼于胚胎外部形態(tài)的發(fā)生，其發(fā)育過(guò)程中主要生化物質(zhì)的變化則未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。本文在研究隆線(xiàn)溞夏卵胚胎外部形態(tài)發(fā)生的基礎(chǔ)上，對(duì)其不同發(fā)育時(shí)期蛋白質(zhì)及氨基酸的組成和含量進(jìn)行了測(cè)定和分析，以期為深入研究枝角類(lèi)胚胎發(fā)育的機(jī)理積累基礎(chǔ)資料，

3、也為生產(chǎn)上提高母溞的產(chǎn)卵量及幼溞的成活率提供理論依據(jù)。2材料和方法2.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)隆線(xiàn)溞溞種于 2003 年 2 月購(gòu)于上海市大渡河路花鳥(niǎo)市場(chǎng)。鑒定后室溫培養(yǎng)，飼以枝角類(lèi)培養(yǎng)液（土壤 10.0g、兔子糞便 1.5g 和青菜2.0g 混合，加入 1L 水煮沸過(guò)濾）。根據(jù)水質(zhì)狀況定期更換培養(yǎng)液，使其大量繁殖。2.2 胚胎發(fā)育外部形態(tài)學(xué)觀察選取未懷卵的成熟孤雌溞進(jìn)行培養(yǎng)，每隔半小時(shí)觀察其卵巢發(fā)育情況，待卵巢較為膨大時(shí)分離單獨(dú)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察。母溞在蛻皮后即刻產(chǎn)卵，卵產(chǎn)入孵育囊后每隔一定時(shí)間拍照，測(cè)量胚胎的長(zhǎng)度和寬度。卵排入孵育囊內(nèi) 3h 后，小心將胚胎從孵育囊內(nèi)取出，放在盛有蒸餾水的

4、小培養(yǎng)皿里，進(jìn)行體外孵化、拍照和測(cè)量，直到幼溞從孵育囊內(nèi)孵出。根據(jù)胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征變化，對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行分期。2.3 胚胎發(fā)育各時(shí)期蛋白質(zhì)的組成和含量測(cè)定取不同發(fā)育時(shí)期的胚胎，稱(chēng)濕重后加入 10 倍體積預(yù)冷的 PBS 溶液，冰浴勻漿，冷凍離心(12000rmin-1)30min，取上清液，分裝保存。一部分用于胚胎可溶性蛋白含量的測(cè)定，另一部分用于胚胎可溶性蛋白組成和分子量的測(cè)定。胚胎可溶性蛋白含量的測(cè)定以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，做 3 個(gè)平行組，取其平均值。胚胎可溶性蛋白組成和分子量的測(cè)定用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，方法如下：根據(jù)測(cè)得的胚胎各時(shí)期蛋白的濃度，用 PBS溶液

5、將各時(shí)期的蛋白溶液稀釋成相同的濃度，各取 30L 在沸水浴加熱 3min。電泳時(shí)用 15%的分離膠和 4%的濃縮膠，上樣量為 20L，在電泳槽中加 Tris-甘氨酸電泳緩沖液，60120V 電泳 2h，直到指示劑跑至膠板底部。用銀染法染色。選用低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，其組成為兔磷酸化酶 B(97400)、牛血清白蛋白(66200)、兔肌動(dòng)蛋白(43000)、牛碳酸酐酶(31000)、胰蛋白酶抑制劑(20100)和雞蛋溶菌酶(14400)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分離膠起點(diǎn)到蛋白帶中線(xiàn)距離作橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)分子量換算對(duì)數(shù)值作縱坐標(biāo)，畫(huà)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)待測(cè)蛋白遷移率計(jì)算蛋白分子量。2.4 胚胎發(fā)育各時(shí)期氨基酸組成和含

6、量的測(cè)定將各時(shí)期胚胎置于 70烘箱中烘干至恒重，精確稱(chēng)重后放入玻璃水解管中，采用鹽酸消解法，在 H853-50型氨基酸自動(dòng)分析儀上測(cè)定氨基酸的組成和含量。同時(shí)做 3 個(gè)平行組，取平均值。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算氨基酸含量的平均值( X )、方差(S)和變異系數(shù)(CV)。3結(jié)果3.1 胚胎發(fā)育的外部形態(tài)學(xué)特征在水溫 26下，從夏卵排入孵育囊到胚胎孵化，隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育共經(jīng)歷約 31h。根據(jù)胚胎發(fā)育的主要形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，將隆線(xiàn)溞夏卵的胚胎發(fā)育分為四個(gè)時(shí)期，其間又根據(jù)每個(gè)時(shí)期的發(fā)育特點(diǎn)，將隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育分為八個(gè)時(shí)期（-期）。3.1.1 卵期自夏卵排入孵育囊到外層卵膜破裂為止，共經(jīng)歷約 11h，可分為三個(gè)時(shí)期。

7、期 產(chǎn)出期。夏卵從卵巢排入孵育囊內(nèi)，外包一層透明卵膜，長(zhǎng)卵形，隨之變圓，直徑約 0.219mm。約半小時(shí)后，可見(jiàn)胚胎外圍一圈較透明，卵內(nèi)大部分區(qū)域較暗，不透明，中央有數(shù)個(gè)油滴狀物。該時(shí)期持續(xù)約 2h(圖版-1)。期 胚胎顯著增大為卵圓形，長(zhǎng)約 0.290mm，寬約 0.250mm。胚胎外圍一圈更透亮，中央油滴狀物愈加明顯，數(shù)量增多。整個(gè)期持續(xù)約 3h(圖版-2)。期 胚胎長(zhǎng)約 0.299mm，寬約 0.259mm。此時(shí)明顯可見(jiàn)內(nèi)外兩層卵膜，外圍亮帶逐漸消失，油滴狀物不明顯。約 2h 后，不透明的中央?yún)^(qū)域外周出現(xiàn)一圈球形的卵黃顆粒。持續(xù)約 45min 后，胚胎外圍出現(xiàn)第一個(gè)凹陷，隨后凹陷逐漸增多

8、，凹陷之間逐漸形成的許多突起，即為頭原基和附肢原基等。整個(gè)期持續(xù)約h(圖版-3)。3.1.2 長(zhǎng)胚期胚胎從最外層卵膜破裂發(fā)育至出現(xiàn)兩個(gè)紅色眼點(diǎn)，共經(jīng)歷約8h，其間又可分為兩個(gè)時(shí)期。期 胚胎不斷長(zhǎng)大，外層卵膜從一端開(kāi)始快速破裂，瞬間將胚胎彈出，外層卵膜脫落。此時(shí)胚胎仍外包一層很薄的卵膜，即內(nèi)層卵膜。胚胎開(kāi)始縱向伸長(zhǎng)，長(zhǎng)約0.342mm，寬約 0.241mm。胚胎內(nèi)卵黃顆粒量增多。中央的油滴開(kāi)始消散。此時(shí)胚胎外圍的頭原基與附肢原基已清晰可辨，第二觸角原基明顯且分節(jié)。此后胚胎不斷縱向增長(zhǎng)，卵黃顆粒不斷增多，并向頭原基移動(dòng)，頭部增長(zhǎng)明顯。期持續(xù)約h(圖版-4)。期 胚胎停止增長(zhǎng)，隨后開(kāi)始收縮，胚內(nèi)物質(zhì)

9、與內(nèi)層卵膜間間距增大，縱向收縮明顯。經(jīng)h 左右，胚胎與內(nèi)層卵膜間隙達(dá)到最大，整個(gè)胚胎長(zhǎng)約 0.364mm，寬約 0.250mm。此時(shí)胚胎頭部已形成，五對(duì)胸肢原基和殼瓣原基已清晰可辨，第二觸角內(nèi)、外肢分開(kāi)。隨后胚胎又開(kāi)始增長(zhǎng)，與卵膜間的距離減小。約h后，第二觸角變粗壯，卵黃顆粒向頭部推進(jìn)，殼瓣原基越發(fā)顯著，將胸肢原基蓋住。整個(gè)期持續(xù)約h(圖版-5)。3.1.3 雙復(fù)眼期胚胎出現(xiàn)兩個(gè)紅色的眼點(diǎn)發(fā)育至兩個(gè)眼點(diǎn)愈合變黑，共經(jīng)歷h，其間可分為兩個(gè)時(shí)期。期 胚胎頭部出現(xiàn)一對(duì)紅色眼點(diǎn)，二者分開(kāi)。胚胎開(kāi)始略微地旋轉(zhuǎn)，30min 后，胚胎在縱向上已經(jīng)將卵膜頂滿(mǎn)，胚胎長(zhǎng)約 0.386mm，寬約 0.259mm。此

10、時(shí)心臟在背部輕微博動(dòng)，接著第二觸角開(kāi)始抖動(dòng)。整個(gè)期持續(xù)約h(圖版-6)。期 一側(cè)的第二觸角伸出卵膜，3min 后，另一側(cè)的第二觸角也伸出，此時(shí)第二觸角發(fā)育基本完全，內(nèi)、外肢均已分節(jié)，并有觸角剛毛。整個(gè)胚胎開(kāi)始不斷運(yùn)動(dòng)。接著殼刺出現(xiàn)，兩個(gè)紅色眼點(diǎn)逐漸靠近，胚胎頭部開(kāi)始變尖。數(shù)分鐘后，眼點(diǎn)更加靠攏，心臟博動(dòng)加快，殼瓣基本發(fā)育完全，兩側(cè)伸長(zhǎng)變?yōu)橄蚋姑婧媳?，身體成為側(cè)扁，此時(shí)胚胎長(zhǎng)約 0.518mm，寬約 0.263mm。胚胎已經(jīng)十分活潑，且能夠快速游動(dòng)。此期末，胚體中央卵黃顆粒逐漸變少；胚胎尾部向后突出；眼點(diǎn)逐漸愈合變黑。整個(gè)期持續(xù)約h(圖版-7)。3.1.4 單個(gè)復(fù)眼期期 即準(zhǔn)備孵化期，胚胎長(zhǎng)約

11、0.536mm，寬約0.307mm。眼點(diǎn)已完全愈合變黑成單個(gè)復(fù)眼。彎曲的殼刺彈出，內(nèi)膜脫落。身體中央的腸管已經(jīng)基本成型。第二觸角和胸肢已經(jīng)長(zhǎng)成，殼瓣變硬，邊緣已出現(xiàn)小刺。胚胎發(fā)育成熟，即將從孵育囊內(nèi)孵出成為第一齡幼體。此期約經(jīng)歷3h(圖版-8)。3.2 胚胎發(fā)育各期可溶性蛋白質(zhì)含量和組成的變化 3.2.1 可溶性蛋白含量的變化隆線(xiàn)溞夏卵整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中，可溶性蛋白含量總體呈下降的趨勢(shì)（圖 1）。在產(chǎn)出期，胚胎的蛋白含量最高，占樣品濕重的 19.68。從產(chǎn)出期到第期蛋白含量迅速降低了 4.05%，到第期下降至 13.04%。但至長(zhǎng)胚期（第、期），蛋白含量逐漸上升，分別升至 15.11%、17.

12、38%。隨后的胚胎發(fā)育期，蛋白含量又逐漸下降，至準(zhǔn)備孵化期下降到最低點(diǎn)，僅占胚胎濕重的8.80%，比產(chǎn)出期下降了 10.88%3.2.2 可溶性蛋白組成和分子量的變化隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育八個(gè)時(shí)期可溶性蛋白 SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明(圖 2)，從胚胎產(chǎn)出期至準(zhǔn)備孵化期，電泳圖譜上的條帶逐漸增多，即可溶性蛋白的種類(lèi)或組成都逐漸增加，但胚胎發(fā)育各時(shí)期主要蛋白的組成都極為相近，只是同分子量的蛋白條帶在不同的發(fā)育時(shí)期含量不同。卵期的第、和時(shí)期，蛋白條帶數(shù)明顯較少，即蛋白質(zhì)的種類(lèi)相對(duì)較少，僅分子量在 105.6119.7KD 間的蛋白帶含量特別高，而分子量小的蛋白條帶不明顯。其中，第期的蛋白質(zhì)圖譜中，分子

13、量約為 58.7KD 和 24.4KD 的兩蛋白條帶在后面幾個(gè)時(shí)期未出現(xiàn)，即使出現(xiàn)含量也極低，第、時(shí)期蛋白組成基本相似。從長(zhǎng)胚期開(kāi)始，蛋白條帶數(shù)明顯增多。長(zhǎng)胚期的第、時(shí)期除個(gè)別蛋白條帶有差異外，大多數(shù)蛋白條帶較為相似，僅含量有所差異，分子量在 106.6120.7KD 和 19.823.4KD 間的蛋白帶含量較高。雙復(fù)眼期的第、時(shí)期蛋白條帶基本相一致，和長(zhǎng)胚期一樣在分子量約為 19.823.4KD 間的蛋白帶含量較高。到單復(fù)眼期，即準(zhǔn)備孵化期(期)，蛋白條帶與前面幾個(gè)發(fā)育時(shí)期差異較大，大分子量的蛋白條帶(分子量66.2KD)明顯減少，以小分子量(分子量4.3 隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育過(guò)程中氨基酸含量及組

14、成的變化和蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)大體相同，隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育過(guò)程中總氨基酸的含量變化也大致呈下降趨勢(shì)，這與兩者的水解順序，即氨基酸來(lái)源于蛋白質(zhì)水解有關(guān)?？偘被岷吭诼【€(xiàn)溞胚胎發(fā)育的卵期呈下降趨勢(shì)，而在長(zhǎng)胚期略微升高，可能是胚胎經(jīng)過(guò)快速卵裂，消耗了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，很可能利用這個(gè)休息期積累和合成一些關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸)，從而為胚胎進(jìn)一步的快速發(fā)育作物質(zhì)和能量準(zhǔn)備，這與蛋白質(zhì)含量在此時(shí)期增長(zhǎng)的原因是相同的?？偘被岷繌碾p復(fù)眼期到準(zhǔn)孵化期呈下降趨勢(shì)，可能是胚胎構(gòu)建組織與器官消耗了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育過(guò)程中必需氨基酸和非必需氨基酸的變異系數(shù)相對(duì)較大，其含量變化也較大，但總體呈下降趨勢(shì)，與總氨基

15、酸的變化趨勢(shì)大體相接近。在所檢測(cè)的必需氨基酸中，亮氨酸 Leu 和賴(lài)氨酸 Lys 的含量最高(占總氨酸的5.06%和 3.94%)。這是因?yàn)樯矬w的代謝中，二者均可分解成乙酰輔酶 A 和乙酰乙酸，它們是溝通糖類(lèi)與脂類(lèi)代謝的重要中間物質(zhì)。隆線(xiàn)溞胚胎內(nèi)的非必需氨基酸中谷氨酸 Glu 含量最高，胱氨酸 Cys 最低。這是因?yàn)?Glu 可與水產(chǎn)動(dòng)物的蛋白代謝物 NH3 結(jié)合，經(jīng)谷氨酰胺酶分解成游離 NH3 排出體外；另外 Glu 在酶的催化下，可生成相應(yīng)的酮戊二酸，而酮戊二酸又是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物。Glu 很可能在胚胎發(fā)育時(shí)期溝通糖、脂、核酸、蛋白質(zhì)代謝的三羧酸循環(huán)反應(yīng)比較活躍，因此含量最高

16、。Cys 的疏基是一種不太穩(wěn)定的基團(tuán)，反應(yīng)性能高，在胚胎發(fā)育的各種代謝活動(dòng)中，或在氨基酸測(cè)定的過(guò)程中易轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)。因此 Cys 較大的變異系數(shù)且與總氨基酸的相關(guān)性不明顯，很可能與其自身的特點(diǎn)有關(guān)。根據(jù)隆線(xiàn)溞胚胎形態(tài)發(fā)育以及胚胎發(fā)育過(guò)程中生化成分變化規(guī)律的研究，隆線(xiàn)溞胚胎發(fā)育的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均是由卵巢累積的，為提高母溞的產(chǎn)卵量和幼溞的成活率，建議在母溞的培育中要保證充足的食物供給，以提高卵子的數(shù)量和質(zhì)量；同時(shí)溞卵排入孵育囊后，盡可能保持水環(huán)境的穩(wěn)定，以免發(fā)育未成熟的胚胎自孵育囊內(nèi)排出，降低胚胎成活率。京都名師論文中心成立于 2000 年，是中國(guó)最頂級(jí)的論文工作平臺(tái)，致力于為全國(guó)各類(lèi)客戶(hù)提供論文

17、指導(dǎo)、發(fā)表論文服務(wù)，以提供高品質(zhì)職稱(chēng)論文服務(wù)為己任，是全國(guó)唯一一家依托北京各大高校學(xué)術(shù)資源、設(shè)置在北京大學(xué)校內(nèi)的論文發(fā)表服務(wù)機(jī)構(gòu)。一直以來(lái)，京都名師論文網(wǎng)致力于對(duì)高品質(zhì)教師職稱(chēng)論文、教師職稱(chēng)論文范文的傳承與傳播，對(duì)中國(guó)高品質(zhì)原創(chuàng)論文事業(yè)的推動(dòng)，已得到社會(huì)各界的廣泛認(rèn)可和贊譽(yù)。參考文獻(xiàn)1 施心路, 史新柏，微齒喜馬拉雅低額溞的生殖與發(fā)育，動(dòng)物學(xué)報(bào),42(3): 287-296，19962 N. N. Khmeleva, A. P. Golubev, A. Kidava, Growth andreproduction of Daphnia magna under changingphotoperi

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