野外采樣實(shí)驗(yàn)

1、野外取樣實(shí)驗(yàn)方案 202204 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯孔匀粭l件下東南景天不同生育期間，其內(nèi)生菌多樣性的動(dòng)態(tài)變化。2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇在東南景天的 苗期、開花期、成熟期 ，于浙江衢州鉛鋅礦山采集具有代 表性 5 個(gè)樣點(diǎn)的超累積生態(tài)型東南景天， 混合為一個(gè)樣品并將其連同根際土壤放 入無(wú)菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鮮活狀態(tài)，帶回實(shí)驗(yàn)室，然后進(jìn)行 后續(xù)處理。3. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1 powersoil 試劑盒提取根際土壤菌 DNA 2 可培養(yǎng)植物內(nèi)生菌別離 3 CTAB 法提取植物內(nèi)生菌 DNA 4 植物重金屬含量測(cè)定 5 土壤理化性質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)一 powersoil 試劑盒提取根際土壤菌 DNA1. 實(shí)驗(yàn)

2、目的powersoil 試劑盒提取根際土壤菌 DNA ，保存，待之后送檢2. 實(shí)驗(yàn)步驟 1 獲取東南景天根際土壤小心把東南景天從土壤中取出， 用鑷子夾取粘附在根表的土壤。 每個(gè)樣點(diǎn)夾 取約3g 土壤，取1g立即提取DNA，余下裝入封口袋，？-20C保存。取出的東南景天外表洗凈， 晾干。測(cè)量鮮重后， 殺青，烘干。測(cè)量干重后， 研磨，待測(cè)。植物重金屬含量， 3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)，共需要植物根莖葉鮮重各 5g2選取 Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad,CA試劑盒提取土壤樣品DNA。具體操作步驟如下：1

3、稱取約0.25g 土壤樣品，放入研磨珠套管PowerBead TubeS，渦旋混勻。 2套管中參加60卩IC1溶液裂解緩沖液，顛倒數(shù)次，渦旋5s混勻。3將套管放入水平渦旋振蕩儀，在最大速度振蕩 10min。4取出套管，在室溫下10000 >g離心30s。5把上清液約400500小轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管。6加250卩IC2容液抑制物去除液至離心管中，渦旋 5s, 4C下放置5min , 在室溫下 10000>g 離心 1min。7將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過(guò)600卩,1同時(shí)防止吸出 沉淀物。8加200卩I C3§液抑制物去除液至離心管中，渦旋混勻，4C下

4、放置5min, 在室溫下 10000>g 離心 1min。9將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過(guò)750卩,1同時(shí)防止吸出 沉淀物。10加1.2mL C4溶液高鹽溶液至離心管中，渦旋混勻，從離心管中抽取約650卩溶液至離心過(guò)濾管Spin FilterL11在室溫下10000 離心1min，取出管中過(guò)濾柱，棄去液體，過(guò)濾柱放回管 中。12參加第10步離心管中約650卩溶液，重復(fù)第(11)步操作，參加第10步離心管 中剩余的溶液，重復(fù)第 11 步操作。13加500卩l(xiāng) C5溶液乙醇淋洗緩沖液至離心過(guò)濾管中，在室溫下10000 >>離心30s,棄去管中液體。14在室溫下

5、10000>g 離心 1min。15取出過(guò)濾柱小心放入新的2mL離心管中，防止任何 C5溶液濺到過(guò)濾柱上。16參加60卩I C豁液DNA洗脫液或無(wú)菌超純水至過(guò)濾柱白色薄膜中，在 室溫下 10000>g 離心 30s。17棄去離心柱，提取完成。分裝-20 T保存，待下一步應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)二 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的別離純化保存1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 別離東南景天內(nèi)生菌，記錄菌落數(shù)，菌落種類數(shù)，菌落形態(tài)，優(yōu)勢(shì)菌菌落 數(shù)。 2菌落純化，保存菌種。2. 儀器和試劑內(nèi)生菌別離1需要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿 150 個(gè)其中在 15 個(gè)培養(yǎng)皿中放入濾紙150mL 燒杯 75 個(gè)研砵 15 個(gè) 2 需要高溫濕熱滅菌的儀

6、器R2A培養(yǎng)基3000mL，分裝至15個(gè)250mL三角瓶磷酸緩沖溶液150mL，至于200mL滅菌瓶試管+蒸餾水 2*3*5=30 支試管2000mL 蒸餾水，裝入 1000mL 三角瓶1mL 槍頭兩盒其中 30 個(gè)需要剪缺口 錫箔紙 50 張 3 其他試劑99%酒精、 35%雙氧水、 3%次氯酸鈉內(nèi)生菌純化保存 1 需要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿 50 個(gè)2需要高溫濕熱滅菌的儀器50%甘油150mL約150個(gè)菌種用量，倒入200mL滅菌瓶。150 個(gè)凍存管，用保鮮袋包裝。R2A固體培養(yǎng)基1000mL，分裝至5個(gè)250mL三角瓶。R2A液體培養(yǎng)基1000mL，分裝至50個(gè)50mL三角瓶。3. 實(shí)驗(yàn)步

7、驟3.1植物樣品外表消毒滅菌燒杯：15個(gè)植物樣5=75個(gè)制作 2000mL 無(wú)菌水。分別取4g植物樣在自來(lái)水下沖洗 一一99%酒精1min一一 35%雙氧水+3% 次氯酸鈉 30min 無(wú)菌水沖洗三次。取g植物樣用錫箔紙包裝，做3個(gè)重復(fù)，液氮速凍，-80 C保存3.2可培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)及純化保存1細(xì)菌的培養(yǎng)基配方R2A培養(yǎng)基1000ml蒸餾水，酵母粉、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、葡萄糖、可溶性淀粉、KH2PO4、MgSO4 7H2O:、丙酮酸鈉，配制R2A培養(yǎng)基3000mL，分裝至15個(gè)250mL三角瓶，高溫濕熱滅菌121°C,20mi n。2磷酸緩沖溶液滅菌處理磷酸緩沖溶液：氯化鈉；2P

8、O4; 2HPO4; 100ml蒸餾水；PH值。配制磷酸緩沖溶液150mL，至于200mL滅菌瓶，高溫濕熱滅菌121C ,20min。3研磨把消毒后的葉、莖和根，分別放在滅菌的研缽中，研磨成汁，參加3ml的磷酸緩沖溶液，攪拌均勻，靜置10分鐘，再攪拌。4稀釋2*3*5=30支試管從研缽中取1ml的溶液分別稀釋10倍、100倍5涂布分別從原液、10倍、100倍的溶液中取200微升到細(xì)菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每 個(gè)梯度做3個(gè)平行。用酒精浸泡，燒的時(shí)間長(zhǎng)一些，葉、莖，考慮用不同的三 角刮刀15個(gè)植物樣*3個(gè)濃度*3個(gè)重復(fù)=135個(gè)平板6平板培養(yǎng)一星期后，計(jì)數(shù)，并記錄其菌落形態(tài)。同時(shí)，根據(jù)菌落特征。7菌種純

9、化保存約50個(gè)菌種用量配制50%甘油150mL約150個(gè)菌種用量，倒入200mL滅菌瓶。準(zhǔn)備150個(gè)凍存管，用保鮮袋包裝。配制R2A固體培養(yǎng)基1000mL，分裝至5個(gè)250mL三角瓶，配制R2A液體培養(yǎng)基 1000mL，分裝至50個(gè)50mL三角瓶。以上儀器試劑使用高溫濕熱滅菌 121C ,20min。挑選不同的菌落到新的培 養(yǎng)基, 純化 1次。挑單個(gè)菌落到R2A液體培養(yǎng)基中，30 C、160r/min，搖床12-16小時(shí)，搖到 對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)末期，測(cè)OD值，取700 uL菌液并加300 uL 50%甘油于甘油管中，保存，每個(gè)菌保存 3 個(gè)甘油管實(shí)驗(yàn)三 CTAB 法提取植物內(nèi)生菌 DNA1. 實(shí)驗(yàn)

10、目的利用 CTAB 法提取植物內(nèi)生菌 DNA ，保存待測(cè)。2. 實(shí)驗(yàn)原理十六烷基三甲基溴化銨 (hexadecyltrimethylammo nium bromide, CTAB )是 一種陽(yáng)離子去污劑， 具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。 在高離子強(qiáng)度的溶液中 (>0.7mol/L NaCl)，CTAB 與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合 物，只是不能沉淀核酸。通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì) 后參加乙醇沉淀即可使核酸別離出來(lái)。3. 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)分 3 批完成1 液氮；2 研缽 6 個(gè)，干熱滅菌；3 CTAB DNA 提取液：a. 100 mM Tris-HCl (p

11、H8.0) 提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；b. 20 mM EDTA (pH8.0)螯合 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase 活性；c. 1.4 M NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使 DNA蛋白復(fù)合物DNP充分溶解；d. 2 % (w/v) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) 溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合 核酸，使核酸便于別離；e. 1% PVP 40,000 (polyvinyl pyrrolidone) (聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的絡(luò)合物， 能 與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)， 有效去除多酚， 減少 DNA 中酚的污染； 同 時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除

12、多糖。將上述試劑混合后，滅菌 20 分鐘，常溫保存；4 酚氯仿異戊醇 按照酚:氯仿:異戊醇=48:48:4 的比例配置 蛋白質(zhì)變性，同時(shí) 抑制了 DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵 已斷,蛋白分子外表又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚 相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的優(yōu)點(diǎn)： 1.有效變性蛋白質(zhì)； 2抑制了 DNase的降解作用。缺點(diǎn)： 1.能溶解 10-15%的水，從而溶解一局部 poly(A)RNA 。2.不能完全抑 制 RNase 的活性；5) 氯仿異戊醇 按照氯仿 :異戊醇=96:4 的比例配置。能克服酚的缺點(diǎn)； 加速有機(jī) 相與液相分層。最

13、后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚酚易溶于氯仿 中；6) 異丙醇 沉淀 DNA ；7) 70%的酒精 清洗 DNA ；8) 2 mL 與 1.5 mL 的離心管各 18 個(gè)，高溫濕熱滅菌。4. 實(shí)驗(yàn)步驟1收集大約100 mg的植物樣品，在使用前保存于-80 C 。2 將樣品放于研缽中，配合液氮，快速將樣品磨成粉末狀，將粉末盡量收集于 一個(gè) 2 mL 的離心管中。3將步驟2中的離心管中參加0.9 mL CTAB，漩渦震蕩均勻，于65 C中水浴20-30 分鐘。4 水浴后，參加 0.9 mL 氯仿異戊醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻， 12000 rpm 離心 8 分鐘。5將離心后上清液510 yL轉(zhuǎn)至另一干凈

14、的1.5 mL離心管中，參加340 上清液體積的 2/3異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻至有沉淀產(chǎn)生 ， 12000 rpm 離心 8 分鐘。6離心后棄掉液體，用0.7 mL 70 %的酒精清洗，12000 rpm離心2分鐘，小心 地棄掉廢液，防止將 DNA 倒出。7 重復(fù)步驟 6。8 于通風(fēng)櫥中將酒精晾干，至透明狀即可。9參加50卩滅菌水或TE水pH8.0 TE可延長(zhǎng)DNA保存時(shí)間，將DNA于-20 C、-80 C長(zhǎng)期保存。5. 考前須知：1) 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先預(yù)熱水浴鍋。3. 2) 在對(duì) DNA 質(zhì)量要求不是特別高的情況下，用氯仿異戊醇即可，不用酚氯 仿異戊醇。實(shí)驗(yàn)四 植物重金屬含量及土壤理化性質(zhì)測(cè)定1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?回校后保存植物樣及土壤，待后續(xù)檢測(cè)。2. 實(shí)驗(yàn)步驟 在獲取根際土壤后，將取出的東南景天外表洗凈，晾干。測(cè)量鮮重后，殺青，烘干。測(cè)量干重后，研磨，待測(cè)。植物重金屬含量， 3 個(gè)重復(fù)，每個(gè) 重復(fù)，共需要植物根莖葉鮮重各 5g。內(nèi)生菌別離試驗(yàn)后，取出土壤約lOOg,風(fēng)干，研磨，過(guò)20目篩，保存 待測(cè)