酶工程動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶ppt課件

1、第三章第三章 動、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶動、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶 與微生物細(xì)胞相比，動物細(xì)與微生物細(xì)胞相比，動物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培育工藝。性，需采用各自不同的培育工藝。 植物細(xì)胞構(gòu)造 植物、動物、微生物細(xì)胞的特性比較植物、動物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類細(xì)胞種類植物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞動物細(xì)胞動物細(xì)胞細(xì)胞大小細(xì)胞大小/um20030011010100倍增時間倍增時間/h120.3-615營養(yǎng)要求營養(yǎng)要求簡單簡單簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜光照要求光照要求大多數(shù)要求大多數(shù)要求不要求不要求不要求不要求對剪切力對剪切力敏感敏感大多數(shù)不敏感大多數(shù)不

2、敏感非常敏感非常敏感主要產(chǎn)物主要產(chǎn)物色素、藥物、色素、藥物、香精、酶等香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫苗、激素、疫苗、激素、單克隆抗體、單克隆抗體、酶等酶等三者之間的差別主要有：三者之間的差別主要有：植物細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞。微生物細(xì)胞。動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的消費(fèi)周期比微生動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的消費(fèi)周期比微生物長。物長。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營養(yǎng)要求較簡植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營養(yǎng)要求較簡單。單。植物細(xì)胞的生長以及次級代謝物的消費(fèi)植物細(xì)胞的生長以及次級代謝物的消費(fèi)要求一定的光照。要求一定的光照。植物細(xì)胞和動物細(xì)胞對剪切力敏

3、感。植物細(xì)胞和動物細(xì)胞對剪切力敏感。植物、微生物和動物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)植物、微生物和動物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不一樣。物各不一樣。一、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶一、植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶從外植體中從外植體中選育植物細(xì)胞選育植物細(xì)胞高產(chǎn)穩(wěn)定高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞細(xì)胞培育培育各種產(chǎn)物各種產(chǎn)物 1.1.植物細(xì)胞培育的特點(diǎn)植物細(xì)胞培育的特點(diǎn) 提高產(chǎn)率和產(chǎn)質(zhì)量量提高產(chǎn)率和產(chǎn)質(zhì)量量 縮短周期縮短周期 易于管理易于管理 2.2.培育基特點(diǎn)培育基特點(diǎn) 需求大量無機(jī)鹽需求大量無機(jī)鹽 需多種維生素和激素需多種維生素和激素 氮源普通為無機(jī)氮氮源普通為無機(jī)氮 普通以蔗糖為碳源普通以蔗糖為碳源運(yùn)用最廣的是運(yùn)用最廣的是MSMS培育基和培育基和LSL

4、S培育基培育基 MSMS培育基是培育基是19621962年為煙草細(xì)胞培育年為煙草細(xì)胞培育而設(shè)計(jì)的培育基。而設(shè)計(jì)的培育基。LSLS培育基是在其根底培育基是在其根底上演化而來的。上演化而來的。P82P82表表3-33-33.3.培育工藝：培育工藝：懸浮細(xì)胞培育懸浮細(xì)胞培育工藝流程工藝流程外植體外植體細(xì)胞的獲取細(xì)胞的獲取細(xì)胞培育細(xì)胞培育分別分別純化產(chǎn)物純化產(chǎn)物外植體選擇和處置外植體選擇和處置選取那些無病蟲害、生長旺盛、生長規(guī)選取那些無病蟲害、生長旺盛、生長規(guī)那么植株，把莖、葉、根、芽，花、果那么植株，把莖、葉、根、芽，花、果實(shí)等切成小片段或小塊。用實(shí)等切成小片段或小塊。用70%-75%70%-75%

5、乙醇，乙醇，0.1%0.1%升汞消毒，無菌水漂洗。升汞消毒，無菌水漂洗。外植體：外植體： 從植株取出，經(jīng)過預(yù)處置后，用于植從植株取出，經(jīng)過預(yù)處置后，用于植物組織培育的植物組織包括根、莖、葉、物組織培育的植物組織包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等的片段或小塊。芽、花、果實(shí)、種子等的片段或小塊。愈傷組織：愈傷組織： 將上述外植體植入誘導(dǎo)培育基中，于將上述外植體植入誘導(dǎo)培育基中，于2525左右培育一段時間，從外植體的切口左右培育一段時間，從外植體的切口部位長出小細(xì)胞團(tuán)。部位長出小細(xì)胞團(tuán)。水稻的外植體幼水稻的外植體幼胚和愈傷組織胚和愈傷組織外植體外植體愈傷組織愈傷組織植物細(xì)胞獲取植物細(xì)胞獲取 直接分

6、別法直接分別法 愈傷組織誘導(dǎo)法愈傷組織誘導(dǎo)法 原生質(zhì)體再生法原生質(zhì)體再生法細(xì)胞懸浮培育：轉(zhuǎn)新培育基，在生物反細(xì)胞懸浮培育：轉(zhuǎn)新培育基，在生物反響器中進(jìn)展培育響器中進(jìn)展培育分別純化：生化技術(shù)分別純化：生化技術(shù)機(jī)械法機(jī)械法酶法酶法 培育條件的影響與控制培育條件的影響與控制溫度：室溫溫度：室溫2525pHpH：微酸性范圍。即：微酸性范圍。即pH 5.0-6.0pH 5.0-6.0通氣與攪拌通氣與攪拌光照的控制：強(qiáng)度和時間有一定要光照的控制：強(qiáng)度和時間有一定要求求前體的添加飼喂前體的添加飼喂刺激劑的運(yùn)用刺激劑的運(yùn)用4.4.植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶實(shí)例植物細(xì)胞培育產(chǎn)酶實(shí)例 以大蒜細(xì)胞培育消費(fèi)超氧化物歧以大蒜細(xì)胞

7、培育消費(fèi)超氧化物歧化酶化酶SODSOD為例為例(1)(1)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實(shí)、豐滿、無病蟲害的大選取結(jié)實(shí)、豐滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%70%乙醇消乙醇消毒毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然，然后無菌水漂洗后無菌水漂洗3 3次。次。 在無菌條件下，切成在無菌條件下，切成0.5cm30.5cm3的小的小塊，植入含有塊，植入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 的半固體的半固體MSMS培育基中，在培育基中，在2525，6

8、00lux600lux，12h/d12h/d光照條件下培育光照條件下培育18d18d，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每誘導(dǎo)得到愈傷組織，每1818天繼代一次。天繼代一次。(2)(2)大蒜懸浮細(xì)胞培育大蒜懸浮細(xì)胞培育 將上述在半固體將上述在半固體MSMS培育基上培育培育基上培育18d18d的愈傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有的愈傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 芐基芐基腺嘌呤腺嘌呤 的液體的液體MSMS培育基中，參與滅菌培育基中，參與滅菌的玻璃珠，的玻璃珠，2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照

9、條光照條件下震蕩培育件下震蕩培育18d18d，使愈傷組織分散成為，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。 然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的液體的液體MSMS培育基中，培育基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照條件下震蕩培光照條件下震蕩培育育18d18d。(3)(3)酶的分別純化酶的分別純化 細(xì)胞培育完成后，搜集細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞培育完成后，搜集細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞破碎、提取、分別得到超氧

10、化物歧細(xì)胞破碎、提取、分別得到超氧化物歧化酶。化酶。二、動物細(xì)胞培育產(chǎn)酶二、動物細(xì)胞培育產(chǎn)酶 1.1.動物細(xì)胞培育的特點(diǎn)動物細(xì)胞培育的特點(diǎn)動物細(xì)胞可以產(chǎn)生各種有效高價動物細(xì)胞可以產(chǎn)生各種有效高價值的物質(zhì)值的物質(zhì)需添加抗生素常用青霉素和鏈需添加抗生素常用青霉素和鏈霉素結(jié)合霉素結(jié)合細(xì)胞生長速度慢細(xì)胞生長速度慢細(xì)胞體積大，無細(xì)胞壁維護(hù)，對細(xì)胞體積大，無細(xì)胞壁維護(hù)，對剪切力敏感。剪切力敏感。反響過程本錢高，產(chǎn)品價錢貴反響過程本錢高，產(chǎn)品價錢貴細(xì)胞具有錨地依賴性。宜采用貼細(xì)胞具有錨地依賴性。宜采用貼壁培育壁培育原代細(xì)胞普通繁衍原代細(xì)胞普通繁衍5050代代2.2.培育方式培育方式 (1)(1)懸浮培育懸浮

11、培育(2)(2)貼壁培育貼壁培育 滾瓶培育滾瓶培育 微載體培育微載體培育(microcarrier culture)(microcarrier culture)(3)(3)固定化細(xì)胞培育固定化細(xì)胞培育包埋包埋(entrapment)(entrapment)和中空纖維和中空纖維(microencapsulation)(microencapsulation)培育培育3.工藝控制工藝控制 工藝流程工藝流程 種質(zhì)細(xì)胞種質(zhì)細(xì)胞 體細(xì)胞；雜交瘤細(xì)胞體細(xì)胞；雜交瘤細(xì)胞 分散成懸浮細(xì)胞分散成懸浮細(xì)胞 細(xì)胞懸浮或貼細(xì)胞懸浮或貼壁培育壁培育 搜集搜集 分別純化分別純化 產(chǎn)物產(chǎn)物 胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化培育條件的

12、影響與控制培育條件的影響與控制溫度：普通控制在溫度：普通控制在36.5.36.5.pHpH值：普通控制在值：普通控制在7.0-7.67.0-7.6的微堿性范圍內(nèi)。的微堿性范圍內(nèi)。浸透壓浸透壓: : 應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)浸透壓一樣。應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)浸透壓一樣。溶解氧：根據(jù)情況隨時調(diào)理。溶解氧：根據(jù)情況隨時調(diào)理。4.產(chǎn)酶實(shí)例產(chǎn)酶實(shí)例以人黑色素瘤細(xì)胞培育消費(fèi)組織纖溶以人黑色素瘤細(xì)胞培育消費(fèi)組織纖溶酶原激活劑為例酶原激活劑為例纖溶酶原纖溶酶原 纖溶酶纖溶酶纖溶酶原激活劑纖溶酶原激活劑種質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶處置，分散，pH7.4磷酸鹽洗滌。稀釋成細(xì)胞懸浮液接種到反響器中，與37 CO2培育箱中，長成致密單層去培育液，用pH

13、7.4磷酸鹽沖洗細(xì)胞換無血清Eagle培育液，繼續(xù)培育每3-4天，取出培育液分別純化再加新穎Eagle培育液，繼續(xù)培育親和層析進(jìn)展分別細(xì)胞消費(fèi)滾瓶培育安裝細(xì)胞消費(fèi)滾瓶培育安裝 第一章作業(yè)：1.1.概念概念 酶活力單位酶活力單位 酶比活力酶比活力2.2.酶工程的主要義務(wù)和主要內(nèi)容是什么？酶工程的主要義務(wù)和主要內(nèi)容是什么？3.3.寫出酶活力測定的普通步驟。寫出酶活力測定的普通步驟。 第二章第二章作業(yè)：作業(yè)：1.1.概念：產(chǎn)物阻遏；分解代謝物阻遏；酶合成的概念：產(chǎn)物阻遏；分解代謝物阻遏；酶合成的誘導(dǎo)誘導(dǎo)2.2.提高酶產(chǎn)量的策措施有哪些？提高酶產(chǎn)量的策措施有哪些？3.3.試述發(fā)酵過程中對溶解氧進(jìn)展控制的必要性及試述發(fā)酵過程中對溶解氧進(jìn)展控制的必要性及其根據(jù)。其根據(jù)。4.4.影響酶生物合成方式的主要要素是什么