HBcAgDNA疫苗誘導(dǎo)小鼠(H2b)特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答.

1、HBcAg DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠(H2b)特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答摘要 目的 觀(guān)察HBcAg DNA疫苗(pJW4303/HBc)免疫C57BL/6小鼠 (H-2b)的特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。方法基因槍和肌肉注射兩種方法接種DNA 疫苗；ELISA 法檢測(cè)小鼠血清抗-HBc(IgG)及 IgG 亞類(lèi)(lgG1,lgG2a) ；51鉻 釋放法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞 HBcAg 特異性 CTL 活性。結(jié)果 該 DNA 疫苗體外可表達(dá) HBcAg 小鼠經(jīng)基因槍或肌肉注射接種該疫苗后血清抗-HBc 滴度分別達(dá) 1 : 328050 和 1 : 109 350;肌肉注射組抗-HBc 亞類(lèi)以 IgG2a 為主；兩

2、種方法接種小鼠 的特異性 CTL 殺傷率分別達(dá) 53.1%和 52.8%。結(jié)論 HBcAg DNA 疫苗在 H-2b小鼠 實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的細(xì)胞免疫和體液免疫原性。關(guān)鍵詞肝炎核心抗原，乙型DNA 疫苗小鼠Specific cellular and humoral immune resp on ses in H-2bmicein duced by DNA immuni zati on of HBV core geneHUANG Zuh u,LU Sha n, LIU Ni ng,et al.The First Affiliated Hospitalof Nanjing Medical Unive

3、rsity,Nanjing 210029Abstract Objective To observe the specific cellular and humoral immuneresponses in H-2bmice after DNA immunization of HBV core gen e.Methods The DNAvacci ne(pJW4303/HBc) was con structed by inserting HBV core gene fragment intothe reading frame of plasmid pJW4303.The immuni zati

4、on was performed by gene gunand in tramuscular injectio n in this experime nt.A nti-HBc(lgG)a nd itssubtypes(lgG1,lgG2a)i n mice sera were detected by ELISA.HBcAg specific cytotoxicT lymphocyte (CTL) activity was measured by51Chromium release assay.Results The expressi on of HBcAg was dem on strated

5、 byELISA and Western-blot in 293T cells tran sfected with pJW4303/HBc.The en d-po inttiters of serum an ti-HBc in immuni zed mice were 1 : 328 050 (gene gun method) and1: 109 350 (intramuscularmethod ).ln both groups of gene gun and in tramuscular immunization,IgG2a level wassightly higher than that

6、 of IgG1.HBcAg specific CTL activities were 53.1% in gene gungroup and 52.85%in in tramuscular group.C on clusi on The results showed that theDNA vacci ne of pJW4303/HBc had stro ng an tige necity in both cellular and humoralimmunity.Key words Hepatitis B core antigenDNA 疫苗（基因疫苗）是近幾年免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究的新興領(lǐng)域

7、，被稱(chēng) 之為DNA vaccine Mice疫苗的“第三次革命”。DNA 疫苗的顯著特點(diǎn)之一是目的基因進(jìn)入機(jī)體后 的表達(dá)產(chǎn)物系內(nèi)源性抗原，主要通過(guò) MHC4類(lèi)途徑激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，其中 特異性 CTL 應(yīng)答尤為突出。大量資料表明，慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病 毒（HBV）慢性攜帶者體內(nèi)針對(duì) HBV 勺特異性 CTL 應(yīng)答明顯低下，糾正這種 CTL 低 反應(yīng)狀態(tài)，對(duì)于機(jī)體有效地清除 HBV 至關(guān)重要。鑒于 HBV 核心區(qū)基因產(chǎn)物 HBcAg 是機(jī)體 CTL 的主要靶抗原，我們構(gòu)建了 HBcAg DNA 疫苗，并觀(guān)察了該 DNA 疫苗經(jīng)基因槍和肌肉注射法接種后 H-2b小鼠的特異性細(xì)胞和體液免疫

8、應(yīng)答。材料與方法一、HBcAg DNAS 苗的構(gòu)建將經(jīng)過(guò) 5端修飾的 HBV 核心區(qū)基因片段:3：（購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒 研究所）插入質(zhì)粒 pUC18（Promega 的 Pstl 和 BamH 酶切位點(diǎn)，克隆成功后，再 將該重組質(zhì)粒中含 HBV 核心區(qū)基因片段的 Hind III 和 BamH 酶切片段定向克隆 進(jìn)質(zhì)粒pJW4303 系真核表達(dá)質(zhì)粒， 含 CMVIP 刻早期啟動(dòng)子， 由美國(guó)馬薩諸塞大 學(xué)醫(yī)學(xué)中心 HLRobinson 教授惠贈(zèng)）的相應(yīng)克隆位點(diǎn)。該重組質(zhì)粒即為 HBcAg DNA 疫苗，命名為pJW4303/HBe二、pJW4303/HBc 體外表達(dá)產(chǎn)物的鑒定分別取純化的

9、 pJW4303/HBc 和 pJW4303 無(wú)目的基因的對(duì)照質(zhì)粒）約 20 卩 g，用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞（一種用于瞬間轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞系），72 小時(shí)后收 集并裂解細(xì)胞，低溫下離心取上清。該細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)間接 ELISA 法檢出HBcAg 經(jīng) Western-blot 證實(shí)在 21Kd 處有一清晰蛋白質(zhì)條帶，與 HBcAg 分子量 相符；對(duì)照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解產(chǎn)物未檢出HBcAg。三、pJW4303/HBc 和 pJW4303 的大量制備采用 QIAGEN Plasmid Purification（Giga）Kit（GIAGEN Inc.,Germany） 。 每2000mlHB1

10、01 轉(zhuǎn)化株菌液可獲高純度質(zhì)粒約 10mg四、小鼠來(lái)源、分組及血清標(biāo)本采集68 周齡雌性 C57BL/6（H2）小鼠由美國(guó)馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中 心提供。 共設(shè) 4 組， 每組 5 只小鼠， 耳洞法編號(hào)。 組別為 pJW4303/HBc 基因槍 組、 pJW4303基因槍組、pJW4303/HBc 肌內(nèi)注射組及 pJW4303 肌內(nèi)注射組。采用 毛細(xì)吸管眼靜脈采血法采集小鼠血清，-70C凍存。五、免疫方法及免疫程序（一） 基因槍法 基因槍為 Agrecetus Inc.（U.S.A） 產(chǎn)品，系高壓氦氣驅(qū)動(dòng)類(lèi)型。按 2 卩 m 質(zhì)粒 DNA 1mg 金顆粒（1 卩 g,BIORAD）的比

11、例分別制備含 pJW4303和 pJW4303/HBc 的基因槍專(zhuān)用細(xì)管狀子彈。每粒子彈含質(zhì)粒DNA 1 卩 g。每只小鼠每次在腹部皮膚 6 處不同部位接受注射，基因槍所用壓力為 400psi，接種劑 量為 6卩 g 質(zhì)粒 DNA 次小鼠。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，未設(shè)單純金顆粒對(duì)照組：4：。（二）肌內(nèi)注射法 取相應(yīng)質(zhì)粒 DNA 100 卩 g,以無(wú)菌生理鹽水稀釋至 100 卩 l。每只小鼠每次在其兩后肢四頭肌處各注射 50 卩 l，故接種劑量為 100 卩 g/次小鼠。（三）免疫程序 為 0 周、第 4 和第 8 周。每次免疫時(shí)接種方法及劑量相 同。每次免疫前及第 10 周時(shí)采集小鼠血清。六、抗 HBc

12、IgG 及 IgG 亞類(lèi)檢測(cè)（一） 抗-HBc-IgG 檢測(cè)以重組 HBcAg 南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)研究所張林元研究員惠贈(zèng)）0.1 卩 g/100 卩 I 孔包被 96 孔 ELISA 板（Corning）。待測(cè)小鼠血清作系列 3 倍稀釋?zhuān)? : 50, 1 ： 150, 1 : 4501 : 885735 0）。以生物素化羊抗鼠 IgG 和親 和素偶聯(lián) HRP（Vector Laboratory Inc.）檢測(cè)小鼠血清中抗 HBc 終點(diǎn)滴度?？笻Bc 高滴度血清采用 CORZYM 試劑盒（Abbott）作抗 HBc 定量測(cè)定，并轉(zhuǎn)換成 PEI（Paul Ehrlich In stitute） 單位。

13、（二） 抗 HBcIgG 亞類(lèi)檢測(cè) 以小鼠 IgG1, IgG2a 標(biāo)準(zhǔn)品、 HRP 標(biāo)記的羊抗 鼠 IgG1或 lgG2a（Southern Biotechnology Associatesnc.）為主要試劑，分 別檢測(cè)單個(gè)小鼠血清中抗 HBcIgG1 和 IgG2a 水平，根據(jù) A（450nm）值計(jì)算 IgG2a/IgG1比值。七、特異性 CTL 功能測(cè)定PJW4303/HB （或 pJW4303 末次免疫 4 周（即第 12 周）時(shí)， 在麻醉狀態(tài)、 無(wú)菌 條件下取小鼠脾臟，制備單個(gè)細(xì)胞懸液，分別用或不用H-2b小鼠限制性 HBcAg特異性 CTL 表位多肽：句 （序列為 MGLKFRQL

14、 終濃度為 10 卩 g/ml） 作體外刺激，37C培養(yǎng) 6 天。繼以 EL4 細(xì)胞為靶細(xì)胞（用或不用上述多肽進(jìn)行過(guò)夜孵育）作51Cr 釋放試驗(yàn)（4 小時(shí)孵育法），測(cè)定 HBcAg 特異性 CTL 殺傷活性，效應(yīng)細(xì)胞：靶 細(xì)胞范圍為12 ： 10.5 ： 1。特異性 CTL 殺傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)孔 Cr 釋放值-自然 Cr 釋放值）/（最大 Cr 釋 放值-自然 Cr 釋放值）X100。一、各組小鼠血清抗 HBc 終點(diǎn)滴度見(jiàn)表 1。接種 pJW4303/HB（后小鼠產(chǎn)生了較高滴度的抗 HBo 基因槍組的終 點(diǎn)滴度 3 倍于肌內(nèi)注射組。經(jīng)定量檢測(cè)，終點(diǎn)滴度達(dá)1 : 109 350 及以上的血清標(biāo)

15、本中，抗 HBc 含量均大于 900PEI 單位。pJW4303 接種后小鼠僅有低滴度非特 異性抗體反應(yīng)（ 1 : 450）。二、單個(gè)小鼠血清抗 HBc 終點(diǎn)滴度的比較見(jiàn) 1?；驑尳M各小鼠血清抗 HBc 的滴度表 1 各組小組血清抗 HBc 的終點(diǎn)滴度組別采樣時(shí)間0 周 4 周8 周10 周PJW4303S因槍組50 150450450pJW4303/HBcS因槍組50 4050 109350 328050PJW4303 肌內(nèi)注射組50 150150450PJW4303/HB（肌內(nèi)注射組 50 405036450 1093501 個(gè)體小鼠血清抗 HBc 終點(diǎn)滴度高且均衡，4/5 達(dá) 1 :

16、328 050;而肌內(nèi)注射組的抗體滴度則普遍降低 3 倍，最低 者僅 1 :4 050o三、單個(gè)小鼠血清抗 HBc 亞類(lèi)比值見(jiàn)表 2。除基因槍組第 5 號(hào)小鼠外，兩組其余小鼠的抗 HBclgG2a/lgG1 比 值均大于 1,提示以 IgG2a 為主。比較兩組的平均 IgC2a/IgG1 比值，肌內(nèi)注射 組顯著高于基因槍組(PV0.05)。表 2 個(gè)體小鼠血清抗 HBcIgG 亞類(lèi)比值(IgG2a/IgG1)組別小鼠序號(hào)2345v.imagesessays311024054552398 (859 bytes) src=/med/ca no/201003/201003151 94608900 1

17、4 22sPJW4303/HBc121.22.9 1.51.550.8基因槍組I2021I90PJW4303/HBc14.10.12. 315.肌內(nèi)注射組423836955606*表中數(shù)值為 ELISA(A450nm 測(cè)定之 IgG2a/IgG1 比值 注：兩組相比差異有顯著性，PV0.05四、小鼠脾細(xì)胞 HBcAg 特異性 CTL 殺傷活性 見(jiàn) 2o2 小鼠脾細(xì)胞 HBcAg 特異性 CTL 殺傷活性PJW4303/HB(兩組小鼠均產(chǎn)生了較強(qiáng)的 CTL 殺傷活性(殺傷率大于 50%);基因槍 組又稍?xún)?yōu)于肌內(nèi)注射組。對(duì)照質(zhì)粒 PJW4303 接種后，基因槍組幾乎測(cè)不出 CT

18、L 活性，肌肉注射組則有低水平非特異性反應(yīng)。討論DNA 疫苗作為一種全新的高效免疫方法，已在許多難治性感染性疾病、自 身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病和腫瘤性疾病的預(yù)防及治療領(lǐng)域顯示出誘人的應(yīng)用 前景：1。DNA疫苗可刺激機(jī)體特異性 CTL 功能的特性給 HBV 慢性持續(xù)感染的治 療帶來(lái)新的希望。Kuhober 和 Geissler 等6,7作了 HBcAg DNA 疫苗肌內(nèi)注射法 免疫小鼠的初步觀(guān)察。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用基因槍和肌內(nèi)注射方法，觀(guān)察了自行構(gòu) 建的 HBcAg DNA 疫苗接種后H-2b小鼠的特異性免疫應(yīng)答。就特異性體液免疫反應(yīng)而言，基因槍組和肌肉注射組小鼠在接種 PJW4303/HBC后，抗

19、 HBc 終點(diǎn)滴度均達(dá) 1 : 10 萬(wàn)以上，經(jīng)定量檢測(cè)，兩組小鼠 血清抗 HBc 含量均大于 900PEI 單位。Geissler 等 將其構(gòu)建的 HBcAg DNA 疫 苗用肌內(nèi)注射法接種小鼠，其血清抗 HBc 含量?jī)H為 56PEI 單位。我們推測(cè)本 研究所以獲得高滴度的抗 HBc反應(yīng)，可能是由于 1.所采用的 HBV 核心區(qū)基因片 斷經(jīng) 5端修飾而具高效表達(dá)能力：3:;2.所選用的載體質(zhì)粒 pJW4303 是一種哺 乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)載體8； 3. 沒(méi)有采用預(yù)先注射肌肉壞死劑的方法，避免 了局部炎癥對(duì)免疫應(yīng)答的干擾； 4. 3 次免疫之間的間隔為 4 周，使免疫應(yīng)答 更為充分。一般認(rèn)為，

20、機(jī)體的 Th1 型免疫反應(yīng)可促進(jìn)病原體的清除，而 Th2 型免疫反 應(yīng)則可加重機(jī)體的病理?yè)p害：切。Feltquate 等發(fā)現(xiàn)，DNA 疫苗經(jīng)基因槍法接 種后宿主以Th2 型（IgG1 為主）反應(yīng)多見(jiàn)，而經(jīng)肌內(nèi)注射法接種后則 Th1 型 （IgG2a 為主）反應(yīng)多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上報(bào)告有同有異。同者是肌肉注射法 接種后表現(xiàn)為 IgG2a 占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，為典型的 Th1 型反應(yīng)；異者是本實(shí)驗(yàn)中基因 槍法接種后亦以 IgG2a 占優(yōu)勢(shì)，傾向于 Th1 型反應(yīng)。我們認(rèn)為這種差異可能與 DNA 疫苗中目的基因及其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能、宿主對(duì)其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不盡相 同有關(guān)。pJW4303/HBc 能否誘導(dǎo)小鼠

21、產(chǎn)生良好的特異性 CTL 活性，這是本研究的核 心問(wèn)題所在。結(jié)果表明，該 DNA 疫苗無(wú)論用基因槍法或肌內(nèi)注射法接種小鼠 后，在效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞=12：1 時(shí)，小鼠脾細(xì)胞的 HBcAg 特異性 CTL 殺傷率即 達(dá)到 50%以上，說(shuō)明該 DNA 疫苗具有良好的細(xì)胞免疫原性，確可刺激宿主產(chǎn)生 較強(qiáng)的 CTL 反應(yīng)。這一結(jié)果為我們進(jìn)一步探索該 DNA 疫苗在治療主要因機(jī)體 CTL 功能低下所致 HBV 慢性持續(xù)感染方面的應(yīng)用前景奠定了初步的實(shí)驗(yàn)研究基 礎(chǔ)。本課題受衛(wèi)生部科學(xué)研究基金資助 （編號(hào) 961347）作者單位 ：210029 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院傳染病科 （黃祖瑚、劉寧 ）；美 國(guó)馬薩

22、諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心 （盧山、王世霞 ）參考文獻(xiàn)1Robinson HL, Torres CAT. DNA vaccine. Seminars in Immunology,1997,9:271-283.2Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. AnnRew Immunol, 1995,13;29-60.3葉廷安，詹美云 . 通過(guò)乙型肝炎病毒核心基因 5端的修飾使核心抗原在大 腸桿菌中高效表達(dá) .病毒學(xué)報(bào)， 1988， 4：312-318.4Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, et al.

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