下一代測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介（課堂PPT）

1、.1Next Generation Sequencing(NGS) 技術(shù)簡(jiǎn)介.2Sanger Sanger 測(cè)序測(cè)序Sanger 測(cè)序法仍然為基因測(cè)序行業(yè)內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)，但鳥(niǎo)槍測(cè)序法在技術(shù)上存在瓶頸。（價(jià)格昂貴、步驟繁瑣、效率低）.3NGS = Next Generation SequencingNGS = Next Generation SequencingNGS也稱(chēng)為高通量測(cè)序High-throughput Sequencing (HTS)第一代測(cè)序：Sanger Sequencing （Sanger測(cè)序）第二代測(cè)序： NGS = Massively Parallel Sequencing （

2、大規(guī)模平行測(cè)序）第三代測(cè)序： NGS = HTS, SingleMolecule Sequencing （高通量、單分子測(cè)序）.4目前目前NGSNGS的主要三種測(cè)序儀器的主要三種測(cè)序儀器三種測(cè)序儀在高通量水平、測(cè)序準(zhǔn)確度、存儲(chǔ)格式和技術(shù)方法上均有差異。.5羅氏/454基因組測(cè)序儀FLX系統(tǒng)焦磷酸測(cè)序法光學(xué)230-400在第二代中最高讀長(zhǎng)；比第一代的測(cè)序通量大樣品制備較難；難于處理重復(fù)和同種堿基多聚區(qū)域；試劑沖洗帶來(lái)錯(cuò)誤累積；儀器昂貴illuminaHiSeq2000/miSeq可逆鏈終止物和合成測(cè)序法熒光/光學(xué)2x150很高測(cè)序通量?jī)x器昂貴；用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分析的費(fèi)用很高ABI/SOLiD550

3、0 xlSOLiD系統(tǒng)連接測(cè)序法熒光/光學(xué)25-35很高測(cè)序通量；在廣為接受的幾種第二代平臺(tái)中，所要拼接出人類(lèi)基因組的試劑成本最低測(cè)序運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)；讀長(zhǎng)短，造成成本高，數(shù)據(jù)分析困難和基因組拼接困難；儀器昂貴公司公司平臺(tái)名平臺(tái)名稱(chēng)稱(chēng)測(cè)序方法測(cè)序方法檢測(cè)方檢測(cè)方法法大約讀大約讀長(zhǎng)長(zhǎng)(堿基堿基數(shù)數(shù))優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)相對(duì)局限性相對(duì)局限性三大測(cè)序平臺(tái)的技術(shù)特點(diǎn)和差異三大測(cè)序平臺(tái)的技術(shù)特點(diǎn)和差異.6Roche 454Roche 454測(cè)序原理測(cè)序原理Roche 454焦磷酸測(cè)序原理.7Roche 454Roche 454測(cè)序步驟測(cè)序步驟樣品處理主要是針對(duì)大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等

4、，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對(duì)于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。一、樣品處理一、樣品處理.8Roche 454Roche 454測(cè)序步驟測(cè)序步驟二、文庫(kù)制備二、文庫(kù)制備文庫(kù)制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫(kù)接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測(cè)序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。.9Roche 454Roche 454測(cè)序步驟測(cè)序步驟三、連接微珠三、連接微珠將富集到的文庫(kù)與測(cè)序磁

5、珠、各反應(yīng)物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應(yīng)體系形成油包水（water-in-oil）的穩(wěn)定乳濁液。在理想條件下，每一個(gè)液滴，或稱(chēng)微反應(yīng)器（microreactor）中將只包含一個(gè)磁珠和一條單鏈DNA，通過(guò)控制條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個(gè)理想的微反應(yīng)器。.10Roche 454Roche 454測(cè)序步驟測(cè)序步驟四、四、emRCRemRCRPCR擴(kuò)增后，每一個(gè)磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續(xù)的步驟。.11乳液乳液PCRPCR（emRCRemRCR）.12Roche 454Roche 454測(cè)序步驟測(cè)序步驟五、反應(yīng)板準(zhǔn)

6、備、上機(jī)測(cè)序五、反應(yīng)板準(zhǔn)備、上機(jī)測(cè)序454測(cè)序的反應(yīng)板稱(chēng)為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬(wàn)個(gè)由光纖組成的小孔，每個(gè)孔的直徑為29m，而測(cè)序磁珠的直徑為20m，因此每個(gè)孔中僅能容納一個(gè)磁珠。.13.14Roche 454Roche 454測(cè)序步驟測(cè)序步驟六、測(cè)序和分析六、測(cè)序和分析將磁珠與測(cè)序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測(cè)序。.15在454測(cè)序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲(chǔ)在單獨(dú)的試劑瓶中的，每步反應(yīng)四種堿基依次加入反應(yīng)池，當(dāng)堿基配對(duì)結(jié)合，就會(huì)釋放出一個(gè)焦磷酸（PPi），而這個(gè)焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發(fā)出光信號(hào)，從而讀取出這一位置的堿基

7、信息。.16IlluminaIllumina測(cè)序原理測(cè)序原理Illumina合成測(cè)序原理.17IlluminaIllumina測(cè)序流程測(cè)序流程.18橋式PCR.19合成法測(cè)序.20數(shù)據(jù)讀取.21ABI SOLiDABI SOLiD測(cè)序原理測(cè)序原理ABI SOLiD連接測(cè)序原理.22ABI SOLiDABI SOLiD測(cè)序流程測(cè)序流程制備DNA文庫(kù)乳液PCR/微珠富集連接酶測(cè)序:SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。這樣經(jīng)過(guò)五輪測(cè)序反應(yīng)后便可以得到所有的堿基序列SOLID的雙堿基編碼矩陣.23ABI SOLiD連接測(cè)序原理

8、探針的5末端標(biāo)記了1種顏色的熒光染料。探針3端15位為隨機(jī)堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對(duì)表征探針染料類(lèi)型，而35位的“n”為隨機(jī)堿基，68位的“z” 是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基。SOLiD測(cè)序反應(yīng)的每一輪測(cè)序反應(yīng)會(huì)連接第15位的堿基，同時(shí)切除第68位的堿基，同時(shí)記錄下第12位堿基決定的熒光顏色。.24ABI SOLiD連接測(cè)序原理.25ABI SOLiD連接測(cè)序原理兩個(gè)堿基共同決定一個(gè)顏色，可以極大的提高測(cè)序的準(zhǔn)確率。.26ABI SOLiD連接測(cè)序原理五輪測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位. 的順序把對(duì)應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來(lái)，就得到由“0，1，2，3”組成的SOLiD原始

9、顏色序列。.27454平臺(tái)的突出優(yōu)勢(shì)是讀長(zhǎng)。目前454系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過(guò)400 bp。雖然454平臺(tái)的測(cè)序成本比其他平臺(tái)要高很多，不過(guò)對(duì)于那些需要長(zhǎng)讀長(zhǎng)的應(yīng)用，如從頭拼接和環(huán)境微生物組學(xué)，它仍是最理想的選擇。 各個(gè)測(cè)序平臺(tái)的特點(diǎn)總結(jié)Roche 454Illumina1. 可擴(kuò)展的超高通量可擴(kuò)展的超高通量Genome Analyzer系統(tǒng)目前每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20 GB的高品質(zhì)過(guò)濾數(shù)據(jù)。經(jīng)優(yōu)化后通量還有望上升到95 GB，相當(dāng)于人類(lèi)基因組的30倍覆蓋度。2. 需要樣品量少需要樣品量少Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)（比如免疫沉淀、顯微切

10、割等）中。3. 簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化Genome Analyzer系統(tǒng)提供了最簡(jiǎn)單和簡(jiǎn)潔的工作流程。制備樣品文庫(kù)可以在幾小時(shí)內(nèi)完成，一個(gè)星期內(nèi)就能得到高精確度的數(shù)據(jù)。自動(dòng)化的流程不減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機(jī)器人操作或潔凈室。.281. 無(wú)以倫比的通量無(wú)以倫比的通量 目前SOLiD 3系統(tǒng)單次運(yùn)行能產(chǎn)生50 GB的人基因組序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺(tái)新一代測(cè)序系統(tǒng)都無(wú)法達(dá)到的2. 準(zhǔn)確性。準(zhǔn)確性。 新的超精確檢測(cè)模塊（ECC模塊）將提供高達(dá)99.99%的精確性；多達(dá)98%的可定位堿基的質(zhì)量值高于45；更多標(biāo)簽以提高靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍；高準(zhǔn)

11、確性的原始讀序，支持無(wú)參考序列的數(shù)據(jù)分析。 各個(gè)測(cè)序平臺(tái)的特點(diǎn)總結(jié)ABI SOLiD.29公司公司平臺(tái)名平臺(tái)名稱(chēng)稱(chēng)測(cè)序方法測(cè)序方法檢測(cè)方檢測(cè)方法法大約讀大約讀長(zhǎng)長(zhǎng)(堿基堿基數(shù)數(shù))優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)相對(duì)局限性相對(duì)局限性太平洋生物科學(xué)公司（PacBio）PacBio RS實(shí)時(shí)單分子DNA測(cè)序熒光/光學(xué)1000高平均讀長(zhǎng)，比第一代的測(cè)序時(shí)間降低；不需要擴(kuò)增；最長(zhǎng)單個(gè)讀長(zhǎng)接近3000堿基并不能高效地將DNA聚合酶加到測(cè)序陣列中；準(zhǔn)確性一次性達(dá)標(biāo)的機(jī)會(huì)低（81-83%）；DNA聚合酶在陣列中降解；總體上每個(gè)堿基測(cè)序成本高（儀器昂貴）；Complete GenomicsGeXP遺傳分析系統(tǒng)復(fù)合探針錨雜交和連接技術(shù)熒

12、光/光學(xué)10在第三代中通量最高；在所有測(cè)序技術(shù)中，用于拼接一個(gè)人基因組的試劑成本最低；每個(gè)測(cè)序步驟獨(dú)立，使錯(cuò)誤的累積變得最低低讀長(zhǎng)； 模板制備妨礙長(zhǎng)重復(fù)序列區(qū)域測(cè)序；樣品制備費(fèi)事；尚無(wú)商業(yè)化供應(yīng)的儀器Ion Torrent/Life Technology個(gè)人基因組測(cè)序儀（PGM） 合成測(cè)序法以離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管檢測(cè)pH值變化100-200對(duì)核酸堿基的摻入可直接測(cè)定；在自然條件下進(jìn)行DNA合成（不需要使用修飾過(guò)的堿基）一步步的洗脫過(guò)程可導(dǎo)致錯(cuò)誤累積；閱讀高重復(fù)和同種多聚序列時(shí)有潛在困難；第三代測(cè)序平臺(tái)的比較差異.30太平洋生物科學(xué)公司（PacBios）實(shí)時(shí)單分子測(cè)序方案示意圖。A. 單個(gè)零點(diǎn)啟動(dòng)模式波導(dǎo)納米結(jié)構(gòu)的側(cè)面圖， 每個(gè)納米結(jié)構(gòu)含一個(gè)DNA聚合酶分子，固定于底部的玻璃面上。波導(dǎo)納米結(jié)構(gòu)和共焦成像系統(tǒng)確保只對(duì)底部進(jìn)行熒光檢測(cè)。 B. 顯示了熒光標(biāo)記的核苷酸底物摻入測(cè)序模板的過(guò)程。相應(yīng)的瞬時(shí)熒光探測(cè)分為5個(gè)步驟。太平洋生物科學(xué)公司.31Life Technology公司IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序芯片技術(shù)圖示。A. 該芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的逐層顯示圖。上層為單個(gè)的DNA聚合反應(yīng)的微池，底部?jī)蓪訕?gòu)成場(chǎng)效應(yīng)晶體管離子傳感器。每個(gè)微池有其相對(duì)應(yīng)的場(chǎng)效應(yīng)晶體管探頭，以鑒別每一個(gè)pH值的變化。B. 側(cè)面圖：微池中，DNA聚合酶將兩個(gè)重復(fù)的TTP核苷酸摻入測(cè)序片段中。