菌種的傳代與保藏1

1、菌種的傳代與保藏菌種的傳代與保藏內(nèi)蒙自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所 菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種. .微生物具有生命活力，在傳代過(guò)程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，是微生物學(xué)基礎(chǔ)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是藥品微生物工作中的一項(xiàng)常用技術(shù)。 一、菌種保藏的意義 如藥品中的控制菌檢查使用的陽(yáng)性對(duì)照菌須防止因多次傳代而使陽(yáng)性對(duì)照菌的典型生物學(xué)特征發(fā)生變化及菌株的死亡，保證達(dá)到菌種長(zhǎng)期正確的形態(tài)； 如藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)過(guò)程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以達(dá)到進(jìn)一步鑒定的目

2、的，保證用藥安全。二、菌種代號(hào)的意義 國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是 CMCC（F）或 CMCC（B） CMCC 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心 B 代表細(xì)菌， F 代表真菌。 大腸桿菌 CMCC (B) 44102 乙型副傷寒沙門(mén)桿菌 CMCC (B) 50094 銅綠假單胞菌 CMCC (B)10104 金黃色葡萄球菌 CMCC (B)26003 生孢梭菌CMCC(B)64941 白色念珠菌CMCC(F)98001三、常用菌種保藏方法(一) 菌種保藏的原理 根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減

3、低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。 低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。 選擇保藏方法時(shí)，首先應(yīng)考慮方法能否長(zhǎng)期地保持菌種原有的特性，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時(shí)使用,以提高保藏效果。（二）菌種保藏步驟 挑選特征典型的純菌菌落；確定保藏的合適菌體形態(tài)； 選擇最適宜的保藏方法；定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。1.1.瓊脂斜面低溫保存法 （1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，

4、把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔 23個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年 一年。有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。 （2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。大腸桿菌斜面 金黃色葡萄球菌斜面 生孢梭菌 白色念珠菌需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基 真菌培養(yǎng)基各類菌種保藏條件及時(shí)間菌 種培 養(yǎng) 基保存溫度傳 種 時(shí) 間細(xì) 菌一般多用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基46芽孢桿菌36個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂46一般46個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或

5、麥芽汁瓊脂等46每 4 個(gè) 月 移 植 一 次（每2個(gè)月移植一次）（3）特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用。 缺點(diǎn)是保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。（4）注意事項(xiàng)： 保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。 保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過(guò)多，影

6、響菌種存活。 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。 2、液體石蠟保存法： 本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長(zhǎng)菌種的保藏期。（1）方法： 將菌種接種于斜面或穿刺于0.3 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。 取 化 學(xué) 純 的 液 體 石 蠟 裝 在 試 管 中 ， 每 管1015ml，加棉塞，瓶口包上紙，121高壓滅菌30min，取出置37溫箱或 110 170 烤箱中 1 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。 將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1 為宜，將試管直立，放入4

7、冰箱中保藏。 適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。 液體石蠟對(duì)各類菌種保藏效果菌 種菌株數(shù)保存時(shí)間（年）存活率（%）細(xì)菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3（3）特點(diǎn)： 本方法簡(jiǎn)便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法， 該法主要使菌種與空氣隔絕。（4）注意事項(xiàng)： 保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征 后，方可進(jìn)行保藏。 保藏過(guò)程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移種。 使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一 邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培 養(yǎng)，待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上 即可使用。將

8、沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會(huì)影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1 為宜。 制備無(wú)菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。3、半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%） 4、40%甘油保存法： 四、試驗(yàn)用菌種的培養(yǎng)傳代方法 程序： 凍干菌復(fù)蘇接種（斜面） （菌種傳代）（營(yíng)養(yǎng)肉湯） 制備菌懸液 對(duì)照菌液 檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國(guó)藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。 菌種的復(fù)蘇與保存在專用無(wú)菌室或超凈工作

9、臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。 1 菌種的復(fù)蘇 把凍干菌種管、滅菌1ml 滴管、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化工作臺(tái)。先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。 取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開(kāi)，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接

10、種的營(yíng)養(yǎng)肉湯及營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面置3537培養(yǎng)2224 h。 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3 代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。 2 菌種的傳代與保存 方法（1）： 菌斜面 菌斜面（保存） 培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無(wú)冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái)。 點(diǎn)燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無(wú)名指、小

11、指及掌部夾住棉塞，撥開(kāi)棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。 堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開(kāi)棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動(dòng)，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。 取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。 將已接種畢的細(xì)菌管置3537培養(yǎng)2224小時(shí)，霉菌管一般置2025霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。 方法2：菌斜面 營(yíng)養(yǎng)肉湯 分離平板 菌斜面 如果菌落形態(tài)不典型可純

12、化，按下列方法傳代（分離菌落） ： 用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌), 置3537培養(yǎng)1824小時(shí)后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置3537培養(yǎng)1824小時(shí)，用接種針選典型菌落劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置3537培養(yǎng)1824小時(shí)。一般同時(shí)接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。常用分離平板： 大腸埃希菌EMB瓊脂平板銅綠假單胞菌溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基l金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基l沙門(mén)菌SS瓊脂平板 3 菌懸液的制備 取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺(tái)，放置室溫后

13、, 用接種環(huán)取菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。4 對(duì)照用菌液制備 取上述培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻，為10-2 以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在 50 100 個(gè)。用平板計(jì)數(shù)。 此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽(yáng)性對(duì)照，可在1天內(nèi)使用。菌種菌種工作菌種培養(yǎng)基菌懸液對(duì)照菌液大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液沙門(mén)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液金黃色葡萄球

14、菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液銅綠假單胞菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液生孢梭菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液白色念珠菌真菌瓊脂斜面真菌培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液五、菌種保管 菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。 菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。 各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無(wú)污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。 購(gòu)置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具

15、備清單，并定期向部門(mén)負(fù)責(zé)人報(bào)告。 1.1.瓊脂斜面低溫保存法 （1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔 23個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年 一年。有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。 （2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。（3）特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用。 缺點(diǎn)是保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。（

16、4）注意事項(xiàng)： 保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。 保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。 必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。 每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。 保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖，其他菌類含糖小于 2 %為宜，以免產(chǎn)酸過(guò)多，影響菌種存活。 銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。 液體石蠟對(duì)各類菌種保藏效果菌 種菌株數(shù)保存時(shí)間（年）存活率（%）細(xì)菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3 取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開(kāi)，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營(yíng)養(yǎng)肉湯及營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面置3537培養(yǎng)2224 h。 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3 代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。 2 菌種的傳代與保存 方