糖化酶及其在酒類中的應(yīng)用

1、糖化酶及其在酒類中糖化酶及其在酒類中的應(yīng)用的應(yīng)用小組成員：費(fèi) 鵬 嚴(yán) 姍石勇軍 董智哲 王培培CONTENTS一、前言一、前言二、糖化酶的性質(zhì)二、糖化酶的性質(zhì)三、糖化酶活力測定三、糖化酶活力測定四、糖化酶的固定化四、糖化酶的固定化五、糖化酶在酒類五、糖化酶在酒類釀造釀造中的應(yīng)用中的應(yīng)用六、前景與展望六、前景與展望一、前言一、前言1糖化酶 糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase EC.3.2.1.3.)，又稱為淀粉- 1,4葡萄糖苷酶、-淀粉酶，是一種含甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白。它的分子量為6萬10萬，是糖苷水解酶的的第15族，是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外

2、酶，以不同的形式存在于不同的菌中。因?yàn)樵诎l(fā)酵行業(yè)中主要用作將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，所以習(xí)慣上被稱為糖化酶。2糖化酶的分布2323個(gè)屬，個(gè)屬，3535個(gè)種。個(gè)種。真菌3 3個(gè)屬，個(gè)屬，3 3個(gè)種。個(gè)種。細(xì)菌人的唾液與動(dòng)人的唾液與動(dòng)物胰腺物胰腺其他3糖化酶的結(jié)構(gòu)糖化酶一般包括催化域(catalyticdomain，CD)、淀粉結(jié)合域(Starch-binding domain，SBD)及連接CD與SBD的O-糖基化連接域(O-gly-cosylatedlinkerdomain)。4糖化酶多型性 糖化酶具有多型性，如Rhizopus nivenus可以產(chǎn)生5種活性成分。 陳冠軍、羅貴民等人從黑曲霉AS3

3、.4309變異株B-11的發(fā)酵液中分離出三種電泳均一的糖化酶G、G、G，其中 G、G能水解糊化的淀粉，但不能水解生淀粉或作用能力非常弱；而 G能夠水解生淀粉。這三種成分的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、化學(xué)組成、含糖量各異。類型類型相對分相對分子質(zhì)量子質(zhì)量等電點(diǎn)等電點(diǎn)含糖量含糖量最適溫最適溫度度G270003.388.7%70G530003.5918.3%70G670003.5213.6%70蛋白質(zhì)合成蛋白質(zhì)合成的修飾作用的修飾作用不同不同發(fā)酵中受到發(fā)酵中受到自身蛋白質(zhì)自身蛋白質(zhì)水解酶和糖水解酶和糖苷酶的作用。苷酶的作用。基因調(diào)控、基因調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的方式轉(zhuǎn)錄的方式不同。不同。多型性的原因5糖化酶的作用機(jī)制

4、2水解水解-1,4糖糖苷鍵苷鍵1水解水解-1,6糖糖苷鍵苷鍵構(gòu)型變化構(gòu)型變化,形成形成-D-葡萄糖葡萄糖二、糖化酶的性二、糖化酶的性質(zhì)質(zhì)11糖化酶的熱穩(wěn)定性 糖化酶一般對熱很穩(wěn)定，如熱硫化氫梭菌（CLostridium thermohydrosulfuricum ）糖化酶至于50%的淀粉溶液中，在70 下十分穩(wěn)定，即使在85下處理h其酶活性仍保持50%。 真菌產(chǎn)生的糖化酶熱穩(wěn)定性比酵母高，細(xì)菌產(chǎn)生的糖化酶耐高溫性能優(yōu)于真菌。2糖化酶的pH穩(wěn)定性 一般糖化酶都具有較窄的pH值適應(yīng)范圍，但最適pH一般為4.55.5。3糖化酶的底物特異性其底物親和其底物親和性與底物的性與底物的碳鏈長度呈碳鏈長度呈線

5、性關(guān)系，線性關(guān)系，碳鏈越長底碳鏈越長底物親和力就物親和力就越大；越大；糖化酶所水解的底物分子越大其水解速度就越快。酶的水解速度還受到底物分子排列上的下一個(gè)鍵影響，鄰近-1,4鏈的-1,6糖苷鍵較獨(dú)立的-1,6糖苷鍵更易被打開。三、糖化酶的活三、糖化酶的活力測定力測定1糖化酶的糖化酶的活力測定活力測定電泳活性染色法淀粉底物法 1g 固體酶粉固體酶粉(或或 1 mL 液體酶液體酶)于于 40 、pH 4.6 的條件下，的條件下，1h分解分解可溶性淀粉，產(chǎn)生可溶性淀粉，產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為一個(gè)酶活葡萄糖，即為一個(gè)酶活力單位，以力單位，以 U/g(U/mL)表示。表示。麥芽糖底物法 麥芽糖麥芽糖20

6、g/L， pH4.30，反應(yīng)溫度，反應(yīng)溫度 37 ，反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間30min下，每分鐘裂下，每分鐘裂解解1mol麥芽糖所需麥芽糖所需酶量酶量為一個(gè)酶活力單為一個(gè)酶活力單位位U。1淀粉底物法 糖化酶從淀粉分子非還原性末端開始，分解葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算出酶活力。2麥芽糖底物法 糖化酶水解麥芽糖生成- D-葡萄糖，在葡萄糖脫氫酶(GlucDH)試劑中加入變構(gòu)酶可將其轉(zhuǎn)化成- D-葡萄糖。在GlucDH 的作用下，-D-葡萄糖與NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)發(fā)生反應(yīng)生成 NADH，后者即等于葡萄糖

7、初始濃度，可用于分光光度法在340nm 測定其數(shù)值。3電泳活性染色法 采用Starch-Page在分離膠中加入淀粉作為糖化酶的作用底物，電泳結(jié)束后溫浴一定時(shí)間，糖化酶所在部位膠板中的淀粉被酶解，其余部分的淀粉依然存在，碘液染色后，糖化酶存在的部位呈現(xiàn)透明區(qū)域，且透明度與酶活力成正比，沒有被水解的部位則被染成藍(lán)色。四、糖化酶的固四、糖化酶的固定化定化其他包埋法共價(jià)結(jié)合法吸附法交聯(lián)法酶的固定化酶的固定化1包埋法 包埋法是指將糖化酶包埋在凝膠的微小空格內(nèi)或半透膜的微型膠囊中，載體的孔徑不能大于酶分子，以免糖化酶滲出。常用的載體有聚丙烯酰胺、三醋酸纖維、聚乙烯醇等，其中前兩者效果最好，而且被廣泛使用。

8、研究人研究人載體載體處理方法處理方法酶的性質(zhì)酶的性質(zhì)Demand等三醋酸纖維溶于二氯甲烷的三醋酸纖維和糖化酶在冷凍下混合攪拌制成乳濁液,在甲苯中凝固,得到多孔性的三醋酸纖維包埋的糖化酶。包埋率達(dá)90%,穩(wěn)定性良好,在45下作用于30%液化淀粉,得到98%的葡萄糖,工作3個(gè)月仍保持原活力。Tanara等海藻酸鈣用聚環(huán)乙亞胺和30%季胺化的聚環(huán)乙亞胺分別處理海藻酸鈣，然后用它包埋糖化酶包埋率高,但酶活力只有原來的21%30%。Thomas聚乙烯醇光化學(xué)交聯(lián)法固定糖化酶于聚乙烯醇表觀活力很低2共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)鍵結(jié)合是指酶的一些官能團(tuán)如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基等以共價(jià)鍵形式與不溶性載體結(jié)合。 常

9、用載體包括天然高分子(纖維素、淀粉、膠原及衍生物等)、合成高聚物(尼龍、多聚氨基酸等)和無機(jī)支持物(多孔玻璃、金屬氧化物等)。 這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)就是酶和載體結(jié)合極其牢固，即使用高濃度的底物或鹽類溶液，也不會(huì)使酶脫落。最大缺陷是常引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞了酶的活性中心。研究人研究人載體載體處理方法處理方法酶的性質(zhì)酶的性質(zhì)Weetall等多孔玻璃先用氧化鋯涂層多孔玻璃或多孔陶瓷,然后硅烷化,最后用重氮基、醛基和異硫氰基衍生物偶聯(lián)糖化酶。酶活較高,45下能連續(xù)生產(chǎn)3個(gè)酶半衰期,估計(jì)能使用5.3年。黎高翔纖維素對氨基苯磺酰乙基纖維素重氮化物偶聯(lián)糖化酶酶活力10000u/g載體,相對活力為15

10、%20%的糖化酶Skinnier等淀粉及衍生物酸性水解淀粉及其衍生物為載體固定糖化酶酸性水解淀粉聚丙烯腈接枝共聚物的酶活最高,失活率最低Stanley甲殼素、戊二醛活力為游離酶的67%3吸附法 吸附法是一種較古老的方法，其操作簡便，處理?xiàng)l件溫和，可回收利用。與共價(jià)結(jié)合法相比，該法制取的酶高級(jí)結(jié)構(gòu)很少發(fā)生改變，但與載體結(jié)合較差，外界條件變化容易引起酶解析。 吸附法也有許多不足，如酶量的選擇全憑經(jīng)驗(yàn)，pH值、離子強(qiáng)度、溫度、時(shí)間的選擇對每一種酶和載體都不同等。因此，其應(yīng)用受到限制。4交聯(lián)法 交聯(lián)法是用多功能試劑與酶蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，即有酶分子之間的交聯(lián)，也有一定的分子內(nèi)交聯(lián)。根據(jù)使用條件和添加材料

11、的不同，可以獲得不同物理性質(zhì)的固定化酶。 常用交聯(lián)試劑有戊二醛、1, 5二氟2,4二硝基苯等，一般價(jià)格昂貴。此法很少單獨(dú)使用，一般都將其作為其它方法的輔助手段，以達(dá)到更好的固定效果。5其他 除采用上述幾種方法固定糖化酶外。目前較為先進(jìn)的就是幾種方法的連用、雙酶法和超濾膜法。 日本學(xué)者Fuji等研究表明,-淀粉酶和糖化酶的混合酶在水解淀粉的過程中具有協(xié)同作用,即在混合酶系統(tǒng)中所生成的葡萄糖量是單獨(dú)使用兩種酶所得葡萄糖量的二倍多。這就為淀粉一步轉(zhuǎn)化成葡萄糖奠定了理論基礎(chǔ)。 超濾膜開始應(yīng)用于固定化，不但能進(jìn)行相分離，而且能提供界面接觸和酶一起構(gòu)成表面催化劑，并可制成各種形式的反應(yīng)器。 Darnoko

12、等報(bào)道擠壓的木薯淀粉在超濾膜反應(yīng)器中連續(xù)糖化2.5 h，在55下淀粉轉(zhuǎn)化率為97%，產(chǎn)率是間歇式24h操作產(chǎn)率的1011倍，并且葡萄糖的純度高。五、糖化酶在酒五、糖化酶在酒類中的應(yīng)用類中的應(yīng)用 糖化酶的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大， 特別是在食品生產(chǎn)行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。我國傳統(tǒng)釀酒生產(chǎn)大多使用淀粉質(zhì)原料, 以曲為糖化劑，采用固態(tài)發(fā)酵法, 但成本高，出酒率低。糖化酶的應(yīng)用使糧醅入酵后發(fā)酵升溫快，幅度大, 提高原料的出酒率，縮短發(fā)酵周期。1糖化酶在濃香型白酒中的作用 彭燕等研究了在濃香型白酒加入TH-AADY和活性酵母對白酒出酒率和品質(zhì)的影響：結(jié)論： 添加THAADY及糖化酶,使酒醅發(fā)酵更徹底、更充分,提

13、高了出酒率。 同時(shí)，使酵母先占優(yōu)勢,抑制了醋酸菌的生長。醋酸菌都是典型的好氣菌,添加THAADY及糖化酶(Yes.A)可以保證酒醅入池后,酵母菌迅速繁殖,消耗了氧氣,抑制了酒醅中醋酸菌的生長繁殖,從而減少了酒醅中乙酸及乙酸乙酯的生成,使酒中乙酸乙酯含量降低,突出了濃香型酒的主體香己酸乙酯的特征。 在轉(zhuǎn)型時(shí),可以大大縮短轉(zhuǎn)型期。1研研究究人人研究的酒研究的酒類類糖化酶的應(yīng)用糖化酶的應(yīng)用結(jié)論結(jié)論覃雪珍湘泉濃香型白酒在混蒸混燒工藝中添加TT-AADY和糖化酶有助于提高己酸乙酯的含量，抑制乙酸乙酯的生成，取得了產(chǎn)量與質(zhì)量的雙贏。王衛(wèi)國黃酒通過正交試驗(yàn)對糖化酶在黃酒釀造中的影響因素進(jìn)行了研究出酒率高達(dá)9

14、2.06%，感官鑒定也得到了優(yōu)化。趙金松清香型小曲白酒在傳統(tǒng)工藝中加入糖化酶淀粉糖化更加徹底，出酒率提高了5%，酒質(zhì)風(fēng)味不變，降低成本的同時(shí)也得到了更好的經(jīng)濟(jì)效益劉子章大曲酒將撒曲步驟改為加糖化酶出酒率提高了4.03%11.62%，降低了成本，取得了明顯的經(jīng)濟(jì)效益六、前景與展望六、前景與展望雖然糖化酶的研究已經(jīng)進(jìn)行了多年, 但是依然存在許多問題等待解決,糖化酶的研究方向?qū)⒓性谝韵聨讉€(gè)方面：特性改良特性改良利用利用酶分子酶分子修飾技術(shù)、修飾技術(shù)、酶的非水相酶的非水相催化技術(shù)催化技術(shù)，促進(jìn)酶的優(yōu)促進(jìn)酶的優(yōu)化生產(chǎn)和高化生產(chǎn)和高效應(yīng)用效應(yīng)用菌株選育菌株選育將精確的分子將精確的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于菌株選育用于菌株選育