二維核磁共振譜介紹

1、第五講：二維核磁共振譜介紹第五講：二維核磁共振譜介紹Introduction of 2D NMR Spectroscopy 2DNMR1971年Jeener 首先提出 2DNMR 思想: 具有兩個時間變量的nmr1976年 Ernst小組成功實現(xiàn)了2DNMR實驗后，確定了二維核磁共振的理論基礎(chǔ)20世紀(jì)80年代：2DNMR加速發(fā)展用途： 解析復(fù)雜有機(jī)分子最有力的工具；溶液中分子的三維空間結(jié)構(gòu)的測定；分子動態(tài)過程的研究：多維NMR技術(shù)：研究生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸等）最有效的方法二維核磁共振譜的特點將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等核磁共振參數(shù)展開在二維平面上，這樣在一維譜中重疊在一個頻率坐標(biāo)軸上的信號分別在

2、兩個獨(dú)立的頻率坐標(biāo)軸上展開，減少了譜線的擁擠和重疊，提供了自旋核之間相互作用的新信息,獲得更多的信息 相干轉(zhuǎn)移譜和極化轉(zhuǎn)移譜基于耦合的相干轉(zhuǎn)移譜：核自旋間的J耦合（通過原子核間化學(xué)鍵電子的間接作用而發(fā)生的耦合，又稱間接耦合），與橫向磁化強(qiáng)度相聯(lián)系基于動力學(xué)過程的極化轉(zhuǎn)移譜：D耦合（不需要經(jīng)過介質(zhì)的空間相互作用，又稱直接耦合或偶極偶極耦合），與縱向磁化強(qiáng)度相聯(lián)系二維核磁共振實驗一維譜：一個脈沖頻率（一個頻率）的函數(shù)，一個變量，二維譜：兩個獨(dú)立的變量，nmr信號受這兩個變量的影響 兩個時間變量t1 t2_函數(shù)S（t1 ,t2） 兩次Fourier變換以兩個頻率為函數(shù)的2D-nmr譜二維NMR實驗：

3、通過特殊的脈沖序列來獲得自旋核之間各種信息的。二維NMR實驗的脈沖序列：一般由四個區(qū)域組成：預(yù)備期D1（preparation）,演化期t1(evolution),混合期tm和檢測期t2二維NMR實驗的關(guān)鍵：是引入了第二個時間變量演化期t1二維譜學(xué)原理：省略二維譜的表示方式堆積圖等高線圖堆積圖和等高線圖F1F2F1F2（a）堆積圖（b）等高線圖等高線圖的習(xí)慣表示橫坐標(biāo)F2維對應(yīng)真實采樣的t2維縱坐標(biāo)F1維對應(yīng)間接采樣的t1維二維實驗的脈沖序列二維實驗的脈沖序列預(yù)備期（D1） 使自旋體系恢復(fù)Boltzmann分布，而處于初始熱平衡狀態(tài)。理論上應(yīng)取D15T1（T1為縱向弛豫時間），但為節(jié)省時間，實

4、驗中一般取D1 =(23)T1。演化期（t1） 在預(yù)備期末，施加一個或多個90脈沖，使系統(tǒng)建立共振非平衡狀態(tài)。演化時間t1是以某固定增量t1為單位，逐步延遲t1。每增加一個t1，其對應(yīng)的核磁信號的相位和幅值不同。因此，由t1逐步延遲增量t1可得到二維實驗中的另一維信號，即F1域的時間函數(shù)?；旌掀冢?m） 由一組固定長度的脈沖和延遲組成。在混合期自旋核間通過相干轉(zhuǎn)移，使t1期間存在的信息直接影響檢測期信號的相位和幅值。根據(jù)二維實驗所提供的信息不同，也可以不設(shè)混合期。檢測期（t2） 在檢測期t2期間采集的FID信號是F2域的時間函數(shù)，所對應(yīng)的軸通常是一維核磁共振譜中的頻率軸，即表示化學(xué)位移的軸。但

5、檢測期t2期間采集的FID信號都是演化期t1的函數(shù)，核進(jìn)動的磁化矢量具有不同的化學(xué)位移和自旋偶合常數(shù)，其FID信號是這些因素的相位調(diào)制的結(jié)果。因此，通過控制時間長度可使某期間僅表現(xiàn)化學(xué)位移的相位調(diào)制，而某期間又僅表現(xiàn)自旋耦合的相位調(diào)制，通過施加不同的調(diào)制就產(chǎn)生了各種不同的二維核磁共振譜。二維實驗的脈沖序列二維實驗中的參數(shù)設(shè)置參數(shù)表實驗參數(shù)的設(shè)定F2維中的參數(shù)設(shè)定參照一維方法進(jìn)行，采樣點數(shù)少于一維的，因此二維實驗的數(shù)字分辨率比一維實驗低得多F1維的采樣數(shù)要少于F2維，這是基于實驗時間的考慮二維實驗時間 =（等待時間+脈沖序列作用時間+F2維采樣時間）x F1維采樣點數(shù) x 累加次數(shù)F2維采樣時間

6、 = F2維采樣點數(shù) /（2 x 譜寬），但等待時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于F2維采樣時間二維譜上的精細(xì)結(jié)構(gòu)的辨認(rèn)主要靠F2維的分辨F1維由于不進(jìn)行真實采樣，沒有接收機(jī)增益的參數(shù)F2維采用正交的檢測方式，F(xiàn)1維有正交復(fù)數(shù)檢測和單通道實數(shù)檢測兩種方式，應(yīng)與Fourier變換方式相對應(yīng)處理參數(shù)的設(shè)定由于F1維采樣點的增加從測譜時間上考慮有困難，因此采用零充填的方法使變換點大于采樣點，提高數(shù)字分辨率，但是不能提高譜峰的分辨率，通常信號會出現(xiàn)譜峰拖長的現(xiàn)象利用窗函數(shù)進(jìn)行變跡處理：相移的正弦鐘函數(shù)、高斯函數(shù)或平方正弦鐘函數(shù)利用正弦鐘函數(shù)對截尾嚴(yán)重的FID進(jìn)行修飾，可以消除由于截尾時的高頻截斷造成的震蕩尾波F1維的間接采

7、樣方式有實數(shù)型和復(fù)數(shù)型兩種，F(xiàn)1維的Fourier變換方式應(yīng)與采樣方式相適應(yīng)二維Fourier變換應(yīng)先變換t2維然后再變換t1維，順序不可顛倒顯示方式分為絕對值顯示和相敏顯示兩種，絕對值顯示的峰有好的信噪比，相敏顯示有高的分辨率二維譜中的基線調(diào)整十分重要二維核磁共振譜的基本理論同核二維譜實驗異核二維譜實驗例題與練習(xí)常用的5種二維同核實驗COSYDQF-COSYTOCSYNOESYROESYCOSY實驗COSY實驗是最簡單的二維實驗，用途最為廣泛，脈沖序列由兩個90o脈沖組成脈沖序列：90o-t1- 90o-t2兩個時域長度由各維的采樣點數(shù)和譜寬決定采樣點間隔在譜寬確定以后依照Nyquist采樣

8、定律確定t1維中，采樣間隔表示為t1，又稱t1增量，也受Nyquist采樣定律制約，由F1維的譜寬決定混合時間混合時間10ms雜峰與雜峰的消除軸峰：沿F1維出現(xiàn)在參考頻率為零處，與演化期間因縱向弛豫而產(chǎn)生的縱向磁化強(qiáng)度有關(guān)。因為演化期的縱向弛豫不可避免，因此軸峰必然存在t1噪聲峰：沿F1維出現(xiàn)的雜峰，可由許多復(fù)雜因素引起，例如宏觀退磁場效應(yīng)和飽和效應(yīng)等鏡像峰：關(guān)于中心頻率對稱的峰，二維鏡像峰是復(fù)數(shù)Fourier變換所固有的消除或降低其強(qiáng)度的方法：相位循環(huán)（例如，COSY實驗的完整相位循環(huán)至少包括4次實驗，因此累加次數(shù)就是4的倍數(shù)）DQF-COSY實驗脈沖序列采用三個90o脈沖： 90o-t1-

9、 90o - 90o t2目的是為了降低對角峰的強(qiáng)度，從而使位于對角峰附近的交叉峰較易辨認(rèn)TOCSY（全相關(guān)譜）實驗TOCSY可以將每一個耦合網(wǎng)絡(luò)用一個方格網(wǎng)連接起來脈沖序列為一個90o脈沖加上一串自旋鎖定功能的組合脈沖： 90o-t1- 自旋鎖定-t2旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系實驗（有自旋鎖定過程，如TOCSY和ROESY）和實驗室坐標(biāo)系實驗（無自旋鎖定過程，如COSY、DQF-COSY和NOESY）NOESY實驗NOESY實驗是探測核間空間距離的實驗，依據(jù)的是核之間與距離6次方呈反比的Overhauser作用脈沖序列為三個90o脈沖：90o-t1- 90o tm- 90o t2混合時間tm應(yīng)該根據(jù)核的弛豫

10、時間而定J干擾峰的消除ROESY（旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的NOESY）實驗脈沖序列： 90o-t1- 自旋鎖定-t2脈沖序列與TOCSY中所示的序列完全相同，但是用于自旋鎖定的組合脈沖是不相同的，鎖定功率和鎖定時間也有較大的區(qū)別ROESY也不可避免地受到J耦合的干擾，而且難以用一般的方法予以消除異核二維NMR譜簡介異核二維NMR譜主要指的是檢測1H而同時間接觀測13C、15N等核的逆檢測二維相關(guān)譜記錄不靈敏核FID的HECSY實驗已被淘汰直接觀測靈敏核的FID，通過核間耦合間接地觀測不靈敏核的化學(xué)位移異核實驗?zāi)壳坝龅阶疃嗟氖?3C-1H耦合系統(tǒng)，此外15N-1H，29Si-1H系統(tǒng)也得到了廣泛的應(yīng)用常用

11、的3種二維異核實驗HMQCHMBCHSQCHMQC（異核多量子相關(guān)譜）實驗HMQC實驗是通過檢測1H信號而達(dá)到間接檢測13C或15N信號的一種方法是成功率最高的異核相關(guān)實驗，正逐步取代一維的不靈敏核檢測1H-13C HMQC實驗檢測的就是1H譜中的13C的衛(wèi)星峰當(dāng)樣品為天然豐度時，與12C或14N相連的1H主峰需要在實驗中用合適的方法濾去在4脈沖HMQC實驗中，濾去1H主峰是通過相位循環(huán)完成的，一般效率很高當(dāng)樣品濃度極低時，需要借助BIRD序列增強(qiáng)濾波功能HMQC脈沖序列雙線性旋轉(zhuǎn)去耦（bilinear rotation decoupling, BIRD）HMBC（異核多重鍵相關(guān)譜）實驗HMQ

12、C的嚴(yán)重缺陷：無法判定季碳的化學(xué)位移，需要通過長程耦合來辨認(rèn)歸屬HMBC實驗的脈沖序列是以HMQC實驗為基礎(chǔ)，本質(zhì)上說是借助較小耦合常數(shù)完成的HMQC實驗由于長程耦合常數(shù)之間的差值與耦合常數(shù)本身之比很大，旋進(jìn)過程中帶來的誤差就很大，給調(diào)整相位帶來了很大的困難，因此一般顯示為絕對值譜與HMQC實驗相比，HMBC實驗的信噪比要低很多，沿F1走向的t1噪聲峰特別強(qiáng)（可通過數(shù)學(xué)的方法消除）HMBC譜中一個氫峰可以和多個碳峰相關(guān)，主要用于解決四級碳信號的問題HMBC的脈沖序列HSQC（異核單量子相關(guān)譜）實驗在外形上與HMQC完全相同各項參數(shù)要求頗高，當(dāng)參數(shù)不是很完美時，很容易形成相位難調(diào)的情況在F1維的分辨率要比HMQC高，在三維NMR中得到比HMQC實驗廣得多的應(yīng)用HSQC的脈沖序列未知物結(jié)構(gòu)解析例一（1H NMR）未知物結(jié)構(gòu)解析例一（13C NMR）未知物結(jié)構(gòu)解析例一(DEPT-90)未知物結(jié)構(gòu)解析例一(DEPT-135)未知物結(jié)構(gòu)解析例一(COSY)未