目的基因的克隆與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)24 目的基因的克隆與鑒定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目的基因DNA分子增殖及其鑒定的原理和方法。 重組DNA（基因克?。┦疽鈭D 載體DNA(限制性內(nèi)切酶切開)目的基因宿主細(xì)胞重組體已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞陽性克隆株繁殖表達(dá)重組載體的構(gòu)建二、主要儀器設(shè)備及器材 設(shè)備：低溫離心機(jī)、恒溫水浴器、臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、陶瓷研缽、吸頭、紫外分光光度計(jì)、PCR儀、電泳儀、水平式電泳槽、微量離心管、紫外線透射儀。 試劑：TRIzol TM試劑、高保真DNA 聚合酶混合物、Reverse Transcription System、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、

2、溴化乙錠、Tris、EDTA、SDS、pUCm-T載體、大腸桿菌、瓊脂糖、T4 DNA連接酶。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與基本要求 1、用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA：方法同前。 2、目的基因DNA分子的PCR擴(kuò)增：方法同前。 3、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與回收：方法同前。 4、質(zhì)粒DNA與目的基因DNA分子的連接：利用pUCm-T載體構(gòu)建T-A重組克隆。將上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA，利用T4 DNA連接酶體系14連接過夜，獲得連接產(chǎn)物。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與基本要求 5、在感受態(tài)細(xì)胞中加入連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，獲得轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞：取感受態(tài)細(xì)胞懸液100L轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,每管加連接產(chǎn)物10L，輕輕混勻，在

3、冰上放置30min。42的循環(huán)水浴中2min?？焖賹⒎磻?yīng)管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)菌冷卻2min。每管加500L 無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液。37，200 rpm，培養(yǎng)1h。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與基本要求 6、已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂板培養(yǎng)，觀察并鑒定：將400L 菌涂在氨芐青霉素平板上。平板在37正向放置1h，以吸收過多液體，然后倒置平皿，于37培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37培養(yǎng)過夜，小規(guī)模擴(kuò)增后，用堿變性法制備質(zhì)粒并鑒定。 7、陽性克隆目的基因DNA分子的鑒定：挑取陽性菌落至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37培養(yǎng)過夜，小規(guī)模擴(kuò)增后，用堿變性法制備質(zhì)粒并鑒定。取陽性克隆菌液，采用PCR方

4、法和鑒定陽性克隆。超凈工作臺(tái)高速冷凍離心機(jī)和超速離心機(jī)等漩渦混勻器垂直電泳裝置凝膠成像系統(tǒng)四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 1、轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算 ： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積） 轉(zhuǎn)化效率（每微克質(zhì)粒每微克質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù)的轉(zhuǎn)化子數(shù)） 轉(zhuǎn)化子總數(shù)（個(gè)轉(zhuǎn)化子）/加入質(zhì)粒DNA的量（g） 2、質(zhì)粒提取與酶切鑒定結(jié)果，貼上打印實(shí)驗(yàn)照片并標(biāo)明照片上各DNA條帶的含義。五、思考題1 1、何謂感受態(tài)細(xì)胞？制備感受態(tài)細(xì)胞的理論依據(jù)是什么？2 2、 CaClCaCl2 2制備細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞及其轉(zhuǎn)化的基本原理。3 3、陽性克隆鑒定的方法有哪些？簡(jiǎn)述三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與基本要求 1、用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA

5、：方法同前。 2、目的基因DNA分子的PCR擴(kuò)增：方法同前。 3、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與回收：方法同前。 4、質(zhì)粒DNA與目的基因DNA分子的連接：利用pUCm-T載體構(gòu)建T-A重組克隆。將上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA，利用T4 DNA連接酶體系14連接過夜，獲得連接產(chǎn)物。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與基本要求 5、在感受態(tài)細(xì)胞中加入連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，獲得轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞：取感受態(tài)細(xì)胞懸液100L轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,每管加連接產(chǎn)物10L，輕輕混勻，在冰上放置30min。42的循環(huán)水浴中2min。快速將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)菌冷卻2min。每管加500L 無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液。37，200 rpm，培養(yǎng)1h。四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 1、轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算 ： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積） 轉(zhuǎn)化效率（每微克質(zhì)粒每