生物化學(xué)ppt第三章第二節(jié)

1、l蛋白質(zhì)是最重要的一類(lèi)生蛋白質(zhì)是最重要的一類(lèi)生物大分子，它存在于所有物大分子，它存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。功能物質(zhì)。l蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程。如生物的生命活動(dòng)過(guò)程。如生物體內(nèi)發(fā)生的體內(nèi)發(fā)生的催化作用、代催化作用、代謝過(guò)程、免疫作用、物質(zhì)謝過(guò)程、免疫作用、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞、運(yùn)動(dòng)和生物調(diào)控等。生物調(diào)控等。蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（protein，pro) : 是由是由2020種種L- L- 氨基酸按一定的序列通過(guò)酰胺鍵氨基酸

2、按一定的序列通過(guò)酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定構(gòu)象，并具有一定生（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定構(gòu)象，并具有一定生物功能的生物大分子。物功能的生物大分子。 蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是將相對(duì)分蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是將相對(duì)分子質(zhì)量在子質(zhì)量在60006000以上的多肽成為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)相對(duì)分子以上的多肽成為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量變換范圍很大，從大約質(zhì)量變換范圍很大，從大約60006000到到1 000 0001 000 000，甚至更，甚至更大。大。（1 1）按照蛋白質(zhì)的組成，可以分為）按照蛋白質(zhì)的組成，可以分為l簡(jiǎn)單蛋白簡(jiǎn)單蛋白(simple protein) (sim

3、ple protein) l結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(conjugated protein) (conjugated protein) 。l又稱為單純蛋白質(zhì)；又稱為單純蛋白質(zhì)；這類(lèi)蛋白質(zhì)只含由這類(lèi)蛋白質(zhì)只含由 - -氨基酸組成的肽氨基酸組成的肽鏈鏈，不含其它成分。，不含其它成分。l1.1.清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白（albumin and globulin） ：廣泛存在：廣泛存在于動(dòng)物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于動(dòng)物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。于稀酸中。l2.2.谷蛋白谷蛋白( (glutelin) )和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白( (prolamin) )：

4、植物蛋白，：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于70708080乙乙醇中。醇中。l3.3.精蛋白和組蛋白精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞核中。：堿性蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞核中。l4.4.硬蛋白硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。l由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成，由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成，l色蛋白色蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如：由簡(jiǎn)單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素

5、等。血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素等。l糖蛋白糖蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與糖類(lèi)物質(zhì)組成。如細(xì)胞：由簡(jiǎn)單蛋白與糖類(lèi)物質(zhì)組成。如細(xì)胞膜中的糖蛋白等。膜中的糖蛋白等。l脂蛋白脂蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與脂類(lèi)結(jié)合而成。：由簡(jiǎn)單蛋白與脂類(lèi)結(jié)合而成。 如血如血清清 - -， - -脂蛋白等。脂蛋白等。l核蛋白核蛋白：由簡(jiǎn)單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細(xì)胞：由簡(jiǎn)單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。核中的核糖核蛋白等。l(2) (2) 依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類(lèi)依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類(lèi)l按照蛋白質(zhì)的外形可分為按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。l球狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)(globular prot

6、ein) (globular protein) ：外形接近外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類(lèi)。多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類(lèi)。l纖維狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)（fibrous proteinfibrous protein） ：分子類(lèi)：分子類(lèi)似纖維或細(xì)棒。它又可分為似纖維或細(xì)棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白可溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。l蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)( (Isoelectric point pIIsoele

7、ctric point pI) )，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。l在不同的在不同的pHpH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子同。在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在等電帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白蛋白質(zhì)電泳質(zhì)電泳( (ElectrophoresisElectrophoresis) )。l蛋白質(zhì)在等蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)電點(diǎn)pHpH條

8、件條件下，不發(fā)生下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離質(zhì)進(jìn)行分離純化。純化。l由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。運(yùn)動(dòng)等。l由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。分子雜質(zhì)除去。l蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量

9、大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。l改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)性質(zhì)l在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來(lái)。沉淀出來(lái)。+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化層水化層+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用 蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)的聚沉蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)膠膠體體溶溶液液沉沉淀淀作作用用示示意意圖圖l

10、在溫和條件下，通過(guò)改變?nèi)芤旱脑跍睾蜅l件下，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒HpH或電或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。離。l在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。沉淀。l可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。劑沉淀法等。l在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠

11、體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水?？赡茉僦匦氯芙庥谒由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。l如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。l抗體和抗原蛋白質(zhì)通過(guò)相互識(shí)別和結(jié)合抗體和抗原蛋白質(zhì)通過(guò)相互識(shí)別和結(jié)合而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。l這種特殊的沉淀作用是生物體免疫功能這種特殊的沉淀作

12、用是生物體免疫功能的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。l蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性( (denaturation)。l大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酪氨酸和色氨酸。l大多數(shù)蛋白質(zhì)在大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 280nm 附近顯示強(qiáng)的吸收。附近顯示強(qiáng)的吸收。l利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定

13、性鑒利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。定。3.4.2 蛋白質(zhì)分離和純化蛋白質(zhì)分離和純化1.蛋白質(zhì)分離純化的一般原則蛋白質(zhì)分離純化的一般原則純化的實(shí)質(zhì)：純化的實(shí)質(zhì)： 增加制品(preparation)的純度或比活性一般程序：一般程序： 前處理、粗分離、細(xì)分離、濃縮與保存 電泳電泳 前前處處理理粗粗分分離離細(xì)細(xì)分分離離生物組織生物組織 無(wú)細(xì)胞提取液無(wú)細(xì)胞提取液破碎、溶解、差速離心破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法選擇性沉淀法親和親和層析層析離子交離子交換層析換層析精制后的蛋白質(zhì)精制后的蛋白質(zhì)凝膠凝膠過(guò)濾過(guò)濾疏水疏水層析層析吸附吸附層析層析1、前處理：、前處理：將組織和細(xì)胞破碎將組織和細(xì)胞破碎動(dòng)

14、物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)（動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)（waring blender) 勻漿器（勻漿器（homogenizer) 超聲波處理（超聲波處理（ultrasonication)植物組織和細(xì)胞：石英砂植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨提取液，研磨 纖維素酶處理纖維素酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）（分解肽聚糖）差速離心法收集細(xì)胞的某一組分差速離心法收集細(xì)胞的某一組分（differential centrifugation)在不同離心力下使沉降系數(shù)不同的細(xì)胞組分分離在不同離心力下使沉降系數(shù)不同的細(xì)胞組分分

15、離如果提取膜蛋白：如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。2、粗分離、粗分離（rough fractionation)一般用選擇性沉淀法。一般用選擇性沉淀法。（NH4）2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析）分級(jí)沉淀法（鹽析）等電點(diǎn)選擇性沉淀法等電點(diǎn)選擇性沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法熱處理選擇性沉淀法熱處理選擇性沉淀法生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3、細(xì)分離（fine fractionation)透析除鹽透析除鹽sephdex G-25凝膠過(guò)濾除鹽凝膠過(guò)濾除鹽層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層

16、析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤(pán)狀電泳、等電聚焦、雙向電泳盤(pán)狀電泳、等電聚焦、雙向電泳密度梯度離心密度梯度離心4、濃縮與保存、濃縮與保存濃縮方法：濃縮方法：保存方法：保存方法：晶體保存：晶體保存： 結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶僅結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶僅是純度是純度 的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。的一個(gè)指標(biāo)，

17、也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。、接入晶種。凍干粉保存：凍干粉保存：溶液保存：溶液保存： 加入抗凍劑（加入抗凍劑（50%甘油）后甘油）后-20-70保存。保存。2. 蛋白質(zhì)分離純化的主要方法蛋白質(zhì)分離純化的主要方法根據(jù)分子大小分離根據(jù)分子大小分離根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度不同分離根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度不同分離根據(jù)電性質(zhì)不同分離根據(jù)電性質(zhì)不同分離選擇性吸附分離（物理吸附）選擇性吸附分離（物理吸附）根據(jù)

18、配體特性異性分離（親和層析）根據(jù)配體特性異性分離（親和層析）根據(jù)疏水性的差異根據(jù)疏水性的差異 3. 蛋白質(zhì)分離純化的基本方法蛋白質(zhì)分離純化的基本方法（1）根據(jù)分子大小和形狀的差異根據(jù)分子大小和形狀的差異透析和超濾法：除去小分子物質(zhì)透析和超濾法：除去小分子物質(zhì) 圖圖3-108透析、透析、3-109超濾超濾密度梯度離心法密度梯度離心法 圖圖3-110 蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法圖圖3-111凝膠過(guò)濾層析的原理凝膠過(guò)濾層析的原理透析法：透析法： 半透膜阻留半透膜阻留prpr分子，而分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過(guò)，讓小的溶質(zhì)分子和水通過(guò)，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中以達(dá)到除去蛋白質(zhì)

19、溶液中小分子（無(wú)機(jī)鹽、單糖、小分子（無(wú)機(jī)鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽及表雙糖、氨基酸、小肽及表面活性劑等低分子量化合面活性劑等低分子量化合物）的目的。物）的目的。常用的半透膜：玻璃紙或常用的半透膜：玻璃紙或高分子合成材料；高分子合成材料；透析液：蒸餾水或緩沖液。透析液：蒸餾水或緩沖液。超濾法：超濾法： 施以一定的壓力使小施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過(guò)一半透膜，分子溶質(zhì)通過(guò)一半透膜，而按半透膜的篩孔大小而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子密度梯度離心法：密度梯度離心法：沉降的速度與顆粒的重量、密沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關(guān)。離心后按其沉度和形狀有關(guān)。離心后按其沉

20、降的速度不同，彼此分開(kāi)形成降的速度不同，彼此分開(kāi)形成區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)定位，針刺區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)定位，針刺或冰凍切片采樣分析或冰凍切片采樣分析蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度凝膠色譜法：凝膠色譜法：交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Gel P ）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠(Sepharose, Bio-Gel A)超離心法超離心法 將蛋白質(zhì)放入離心機(jī)的離心管中進(jìn)行離心，將蛋白質(zhì)放入離心機(jī)的離心管中進(jìn)行離心，蛋白質(zhì)顆粒在強(qiáng)離心力作用下，蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)顆粒在強(qiáng)離心力作用下，蛋白質(zhì)分子就會(huì)發(fā)生沉降，與溶液分離；就會(huì)發(fā)生沉降，與溶液分離；l在

21、在60 00060 00080 000r/min 80 000r/min 的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng)。會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng)。l超離心法最為準(zhǔn)確，但需昂貴的超速離心機(jī)。超離心法最為準(zhǔn)確，但需昂貴的超速離心機(jī)。l用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度。用光學(xué)方法測(cè)定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度。l蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)，因?yàn)槌两迪禂?shù)蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān)，因?yàn)槌两迪禂?shù)S S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子

22、量，但對(duì)分子形狀高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)質(zhì)分子量，但對(duì)分子形狀高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。不適用。轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品沉降樣品驅(qū)動(dòng)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)馬達(dá)真空真空冷凍冷凍（2）根據(jù)溶解度差異的分離：選擇性沉淀法）根據(jù)溶解度差異的分離：選擇性沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法鹽析法鹽析法PEG沉淀法沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法重金屬鹽選擇性沉淀法（重金屬鹽選擇性沉淀法（pHpI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷），蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷）生物堿和酸選擇性沉淀法（生物堿和酸選擇性沉淀法（pHpI，蛋白質(zhì)帶正電荷），蛋白質(zhì)帶正電荷）熱處理沉淀法（銅鋅熱處理沉淀法（銅鋅SOD，65、15分鐘、穩(wěn)定）分鐘、穩(wěn)定）

23、等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀在等電點(diǎn)條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解在等電點(diǎn)條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度最小，粘度最大。度最小，粘度最大。在在pI時(shí)，分子電荷為零，蛋白質(zhì)分子間的靜電排時(shí)，分子電荷為零，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥消失，從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀。而那些等斥消失，從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀。而那些等電點(diǎn)高于或低于該電點(diǎn)高于或低于該pH的蛋白質(zhì)能留在溶液中的蛋白質(zhì)能留在溶液中。 蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析 鹽溶：低鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度鹽溶：低鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度，稱鹽溶。，稱鹽溶。鹽析：高鹽濃度時(shí)，由于水化層被破壞和表面電荷被鹽析：高鹽濃度時(shí)，由于水化層被破壞和表面電荷被 中和，使中和，使

24、pr溶解度溶解度沉淀析出，稱鹽析。沉淀析出，稱鹽析。 鹽析多用溶解度大的中性鹽，如鹽析多用溶解度大的中性鹽，如(NH4)2SO4、NaCl MgCl2、NH4Cl、KCl等的飽和溶液；等的飽和溶液； 不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時(shí)所需的鹽的濃度也不同，而將不同的蛋白質(zhì)加析時(shí)所需的鹽的濃度也不同，而將不同的蛋白質(zhì)加以分離。以分離。 l在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶的有在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶的有機(jī)溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強(qiáng)，能破機(jī)溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強(qiáng)，能破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而壞蛋

25、白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。沉淀。l常用的有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙酮；常用的有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙酮；l為防止蛋白質(zhì)在分離過(guò)程中發(fā)生變化，有機(jī)溶為防止蛋白質(zhì)在分離過(guò)程中發(fā)生變化，有機(jī)溶劑濃度不能太高，且須在低溫下進(jìn)行。劑濃度不能太高，且須在低溫下進(jìn)行。離子交換色譜法離子交換色譜法 1）是利用離子交換樹(shù)脂為主色譜支持體，根據(jù)蛋白質(zhì)帶電荷情況進(jìn)行分離； 2）不同載體： 離子交換纖維素 離子交換交聯(lián)葡聚糖：兼有分子篩效應(yīng) 離子交換交聯(lián)瓊脂糖 電泳法電泳法 電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。分子大小不同分子大小不同的蛋的蛋白質(zhì)所帶白質(zhì)所帶凈電荷密度不同

26、凈電荷密度不同，遷移率不同，在電泳時(shí)可以分開(kāi)，遷移率不同，在電泳時(shí)可以分開(kāi)。v = Eq/f (v-移動(dòng)速率，移動(dòng)速率，E-電場(chǎng)強(qiáng)度，電場(chǎng)強(qiáng)度，q-所帶凈電荷，所帶凈電荷，f-介介質(zhì)的摩擦系數(shù)質(zhì)的摩擦系數(shù)) a. 自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。 b. 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn) 行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。 1）紙電泳：用濾紙作支持物。）紙電泳：用濾紙作支持物。 2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊

27、脂糖、聚丙烯酰胺）作 支持物。支持物。 目前應(yīng)用最多的是目前應(yīng)用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳(SDS-PAGE),用于分離、純化、制用于分離、純化、制備蛋白質(zhì)。備蛋白質(zhì)。 （SDS的引入，使蛋白質(zhì)表面帶上大量負(fù)電荷，使的引入，使蛋白質(zhì)表面帶上大量負(fù)電荷，使Eq接近一個(gè)常數(shù)，則接近一個(gè)常數(shù)，則v只與只與f即分子大小有關(guān)）即分子大小有關(guān)）PAGE垂直平板電泳示意圖垂直平板電泳示意圖低低濃度濃度濃縮濃縮膠膠高高濃度濃度分離分離膠膠等電聚焦電泳等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。+5.06.07

28、.0穩(wěn)定穩(wěn)定pH梯度梯度5.06.07.0穩(wěn)定穩(wěn)定pH梯度梯度通電通電+（4）根據(jù)選擇性吸附的差異：）根據(jù)選擇性吸附的差異： 吸附色譜法：吸附色譜法：某些物質(zhì)對(duì)不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)具有某些物質(zhì)對(duì)不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)具有不同程度的吸附能力，據(jù)此可將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。不同程度的吸附能力，據(jù)此可將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 極性：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離子吸引和氫鍵）極性：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離子吸引和氫鍵） 非極性：活性炭（范德華力、疏水作用）非極性：活性炭（范德華力、疏水作用） 最廣泛最有效：羥基磷灰石（最廣泛最有效：羥基磷灰石（hydroxyapatite)，即結(jié)，即結(jié)晶磷酸鈣晶磷酸鈣Ca10(PO4)6(OH

29、)2，可分離蛋白質(zhì)、核酸，可分離蛋白質(zhì)、核酸 洗脫液：不同濃度和不同洗脫液：不同濃度和不同pH的磷酸緩沖溶液。的磷酸緩沖溶液。配體親和力的差異配體親和力的差異 ：親和層析：親和層析 原理：原理：不同蛋白質(zhì)分子對(duì)于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)不同蛋白質(zhì)分子對(duì)于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合能力，選擇與待純化的蛋白質(zhì)具有特殊的識(shí)別和結(jié)合作用的配基與載體相合能力，選擇與待純化的蛋白質(zhì)具有特殊的識(shí)別和結(jié)合作用的配基與載體相連接，將這種連接有配基的載體裝入色譜柱中，當(dāng)含有純化的蛋白質(zhì)溶液通連接，將這種連接有配基的載體裝入色譜柱中，當(dāng)含有純化的蛋白質(zhì)溶液通過(guò)色譜柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即

30、與配基發(fā)生特異結(jié)合而被吸附在色譜柱上，而其它過(guò)色譜柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異結(jié)合而被吸附在色譜柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外，被特異性結(jié)合在色譜柱上的蛋白質(zhì)，可以用使蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)則流出柱外，被特異性結(jié)合在色譜柱上的蛋白質(zhì)，可以用使蛋白質(zhì)的配體洗脫液洗脫。配體洗脫液洗脫。配基：配基：抗體、抗原、激素或受體蛋白?？贵w、抗原、激素或受體蛋白。l蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽( (polypeptide) )鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。l蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在將分子量在60006000

31、道爾頓以上的多肽稱為道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。l蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, , 從大約從大約60006000到到10000001000000道爾頓甚至更大。道爾頓甚至更大。l1.1.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primary (Primary structure)structure)及其生物學(xué)意義：及其生物學(xué)意義：l蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：包括蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目、多肽鏈的氨基酸順序，以及多肽鏈內(nèi)或鏈間目、多肽鏈的氨基酸順序，以及多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的其中最重要的

32、是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。l蛋白質(zhì)氨基酸順序的改變，不僅影響蛋白質(zhì)的高蛋白質(zhì)氨基酸順序的改變，不僅影響蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而且將直接影響其生物功能。若某種蛋級(jí)結(jié)構(gòu)，而且將直接影響其生物功能。若某種蛋白質(zhì)正常的氨基酸順序發(fā)生改變，則可能產(chǎn)生異白質(zhì)正常的氨基酸順序發(fā)生改變，則可能產(chǎn)生異常功能或病變。如貧血癥就是血紅蛋白發(fā)生了變常功能或病變。如貧血癥就是血紅蛋白發(fā)生了變異，即肽鏈上第異，即肽鏈上第6 6位的位的GluGlu被被ValVal替代，引起變異替代，引起變異蛋白質(zhì)在空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，水溶性明顯蛋白質(zhì)在空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，水溶

33、性明顯降低，血液粘性增加，導(dǎo)致貧血癥。降低，血液粘性增加，導(dǎo)致貧血癥。l蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從自從19531953年年F.SangerF.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。胰現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)如下：島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)如下： l測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。l通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的量與蛋白質(zhì)通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的量與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的分子量之間的關(guān)系，即可

34、確定多肽鏈的數(shù)目。數(shù)目。l多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分。l由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。l多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分l幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如血紅蛋白為四聚體；稱為寡聚蛋白質(zhì)，如血紅蛋白為四聚體；l可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍處理，鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈即可分開(kāi)多肽鏈( (亞基亞基).).ll幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诼?lián)在一起?？稍?mol/L8mol/L尿尿素或素或6mol/L6mol/L鹽酸胍存在下，鹽酸胍存在下，用過(guò)量的用過(guò)量的 - -

35、巰基乙醇巰基乙醇處理，處理，使二硫鍵還原為巰基，然使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被的巰基，以防止它重新被氧化。也可用氧化。也可用過(guò)甲酸氧化過(guò)甲酸氧化法法打開(kāi)二硫鍵，生成磺酸打開(kāi)二硫鍵，生成磺酸基基l一般采用胃蛋白酶水解多肽，用雙向電一般采用胃蛋白酶水解多肽，用雙向電泳技術(shù)分離出含有二硫鍵的肽段，接著泳技術(shù)分離出含有二硫鍵的肽段，接著進(jìn)行二硫鍵的拆分進(jìn)行二硫鍵的拆分l將肽段分別進(jìn)行順序分析將肽段分別進(jìn)行順序分析l然后同整個(gè)多肽鏈進(jìn)行比較，確定二硫然后同整個(gè)多肽鏈進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。鍵的位置。l測(cè)定每測(cè)定每條多肽鏈條多肽鏈的氨基酸的氨

36、基酸組成，并組成，并計(jì)算出氨計(jì)算出氨基酸成分基酸成分的分子比；的分子比；l分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端。末端。l多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段，可采用兩種多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開(kāi)來(lái)。離開(kāi)來(lái)。l測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順

37、序。的氨基酸順序。l原理：一般的多肽鏈太長(zhǎng)，含有幾百甚至幾千原理：一般的多肽鏈太長(zhǎng)，含有幾百甚至幾千個(gè)氨基酸殘基。故先將它切割成若干個(gè)小肽段，個(gè)氨基酸殘基。故先將它切割成若干個(gè)小肽段，然后再分別測(cè)定小肽段的氨基酸順序。然后再分別測(cè)定小肽段的氨基酸順序。l多肽鏈的降解必須滿足兩個(gè)條件：選擇性強(qiáng)，多肽鏈的降解必須滿足兩個(gè)條件：選擇性強(qiáng)，反應(yīng)產(chǎn)率高；反應(yīng)產(chǎn)率高；l主要方法：酶解法和化學(xué)法；主要方法：酶解法和化學(xué)法；l 酶解法酶解法: :某些蛋白質(zhì)水解酶能夠選擇性地水某些蛋白質(zhì)水解酶能夠選擇性地水解多肽鏈中某一肽鍵，因而能預(yù)測(cè)出可能得到解多肽鏈中某一肽鍵，因而能預(yù)測(cè)出可能得到的小肽段數(shù)目，以及端基氨基

38、酸的類(lèi)型。的小肽段數(shù)目，以及端基氨基酸的類(lèi)型。l常用的酶：常用的酶：胰蛋白酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶3. 3. 多肽鏈氨基酸順序分析多肽鏈氨基酸順序分析 化學(xué)法：溴化氰水解法化學(xué)法：溴化氰水解法(Cyanogen bromide) ：它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。特點(diǎn)：專一性強(qiáng)，產(chǎn)率高。特點(diǎn)：專一性強(qiáng)，產(chǎn)率高。CH3S：CH2CH2CHNHC NH CH COOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHC NH CH COORC NCH3SC

39、NCH2CHNHC NH CH COORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CH COR高絲氨酸內(nèi)酯l多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi)：多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi)：N-N-端氨基端氨基酸酸(amino-terminal)(amino-terminal)和和C-C-端氨基酸端氨基酸。l在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。lSangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-N-端的端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DN

40、PDNP）。）。l在酸性條件下水解，得到黃色在酸性條件下水解，得到黃色DNP-DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的抽提分離。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸l在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-N-端氨端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺?；岬挠坞x氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。l此法的優(yōu)點(diǎn)

41、是丹磺酰此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰- -氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到可以達(dá)到1 1 1010-9-9molmol。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸l此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnC

42、CHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸l氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-N-端逐個(gè)的向里水解。端逐個(gè)的向里水解。l根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-N-末端殘基順序。末端殘基順序。l最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為氨酸殘基為N-N-末端的肽鏈速度最快。末端

43、的肽鏈速度最快。l羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-C-端逐個(gè)的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出端逐個(gè)的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，從而酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的知道蛋白質(zhì)的C-C-末端殘基順序。末端殘基順序。l目前常用的羧肽酶有四種：目前常用的羧肽酶有四種：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B來(lái)自胰臟；來(lái)自胰臟；C C來(lái)自柑桔葉；來(lái)自柑桔葉；Y Y來(lái)自面包酵母。來(lái)自面包酵母。l羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-

44、末端氨基酸殘基；末端氨基酸殘基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys為為C-C-末末端殘基的肽鍵。端殘基的肽鍵。lEdmanEdman法（苯異硫氰酸酯法）實(shí)際上也是一種法（苯異硫氰酸酯法）實(shí)際上也是一種N-N-端分析法。端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-N-端氨基酸殘端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1PTCPTC-多肽多肽PTH-氨基酸氨基酸PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲：苯

45、乙內(nèi)酰硫脲+多肽氨基酸順序自動(dòng)分析儀工作原理多肽氨基酸順序自動(dòng)分析儀工作原理l蛋白質(zhì)分子的多肽鏈并非呈線形伸展，而是折疊和盤(pán)蛋白質(zhì)分子的多肽鏈并非呈線形伸展，而是折疊和盤(pán)曲構(gòu)成特有的比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。曲構(gòu)成特有的比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。l蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)主要決定于空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)主要決定于空間結(jié)構(gòu)的完整，因此僅僅測(cè)定蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成和它的完整，因此僅僅測(cè)定蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成和它們的排列順序并不能完全了解蛋白質(zhì)分子的生物學(xué)活們的排列順序并不能完全了解蛋白質(zhì)分子的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)。性和理化性質(zhì)。l例如球狀蛋白質(zhì)例如球狀蛋白質(zhì)(多見(jiàn)于血漿中的白蛋白、球蛋白

46、、血多見(jiàn)于血漿中的白蛋白、球蛋白、血紅蛋白和酶等紅蛋白和酶等)和纖維狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)(角蛋白、膠原蛋白、肌角蛋白、膠原蛋白、肌凝蛋白、纖維蛋白等凝蛋白、纖維蛋白等)，前者溶于水，后者不溶于水，前者溶于水，后者不溶于水，顯而易見(jiàn)，此種性質(zhì)不能僅用蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨顯而易見(jiàn)，此種性質(zhì)不能僅用蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序來(lái)解釋?；崤帕许樞騺?lái)解釋。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)就是指蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。如下圖：l蛋白質(zhì)的二級(jí)蛋白質(zhì)的二級(jí)(Secondary)(Secondary)結(jié)構(gòu)是結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈原子在空間的排列指肽鏈的主鏈原子在空間的排列, ,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊?；蛞?guī)則的幾

47、何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。l涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。間形成的氫鍵。l不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象lPauling等人對(duì)一些簡(jiǎn)單的肽及氨基酸的酰胺等進(jìn)行了等人對(duì)一些簡(jiǎn)單的肽及氨基酸的酰胺等進(jìn)行了X線衍射分析，得出下圖所示結(jié)構(gòu)：線衍射分析，得出下圖所示結(jié)構(gòu)： (1)肽鍵中的肽鍵中的C-N鍵長(zhǎng)鍵長(zhǎng)0.132nm，比相鄰的，比相鄰的N-C單鍵單鍵(0.146nm)短，而較一般短，而較一般C=N雙鍵雙鍵(0.128nm)長(zhǎng)，長(zhǎng)，可見(jiàn)，肽鍵中可見(jiàn)，肽鍵中-C-N-鍵的性質(zhì)介于單、雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)，因而不能旋轉(zhuǎn)。鍵的性質(zhì)介于單、雙鍵之間，具有部

48、分雙鍵的性質(zhì)，因而不能旋轉(zhuǎn)。(2)肽鍵的肽鍵的C及及N周?chē)齻€(gè)鍵角之和均為周?chē)齻€(gè)鍵角之和均為360，說(shuō)明都處于一個(gè)平面上，也就是說(shuō)六個(gè)原子（，說(shuō)明都處于一個(gè)平面上，也就是說(shuō)六個(gè)原子（-CCONHC-）基本上同處于一個(gè)平面，這就是肽鍵平面。肽鏈中能夠旋轉(zhuǎn)的只有）基本上同處于一個(gè)平面，這就是肽鍵平面。肽鏈中能夠旋轉(zhuǎn)的只有碳碳原子所形成的單鍵，此單鍵的旋轉(zhuǎn)決定兩個(gè)肽鍵平面的位置關(guān)系，于是肽鍵平面成為肽鏈盤(pán)曲原子所形成的單鍵，此單鍵的旋轉(zhuǎn)決定兩個(gè)肽鍵平面的位置關(guān)系，于是肽鍵平面成為肽鏈盤(pán)曲折疊的基本單位。折疊的基本單位。(3)肽鍵中的肽鍵中的C-N既具有雙鍵性質(zhì)，就會(huì)有順?lè)床煌牧Ⅲw異構(gòu)，已證實(shí)既具

49、有雙鍵性質(zhì)，就會(huì)有順?lè)床煌牧Ⅲw異構(gòu)，已證實(shí)CO和和NH處于反位。處于反位。l(1)(1)多個(gè)肽鍵平面通過(guò)多個(gè)肽鍵平面通過(guò)碳原子旋轉(zhuǎn)，碳原子旋轉(zhuǎn)，相互之間緊密盤(pán)曲成穩(wěn)固的右手螺旋。相互之間緊密盤(pán)曲成穩(wěn)固的右手螺旋。l(2)(2)主鏈呈螺旋上升，每主鏈呈螺旋上升，每3.63.6個(gè)氨基酸殘個(gè)氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm0.54nm。l(3)(3)相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中C CO O和和H-NH-N形成許多鏈內(nèi)氫健，即每一個(gè)氨基形成許多鏈內(nèi)氫健，即每一個(gè)氨基酸殘基中的酸殘基中的NHNH和前面相隔三個(gè)殘基的和前面相隔三個(gè)殘基的C CO O之間形成氫鍵

50、，這是穩(wěn)定之間形成氫鍵，這是穩(wěn)定螺旋螺旋的主要因素。的主要因素。l(4)(4)肽鏈中氨基酸側(cè)鏈肽鏈中氨基酸側(cè)鏈R R，分布在螺旋外，分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響側(cè)，其形狀、大小及電荷影響螺旋螺旋的形成。酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，的形成。酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，由于同電荷相斥，不利于由于同電荷相斥，不利于螺旋形成；螺旋形成；較大的較大的R(R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸酸) )集中的區(qū)域，也妨礙集中的區(qū)域，也妨礙螺旋形成；螺旋形成；脯氨酸因其脯氨酸因其碳原子位于五元環(huán)上，碳原子位于五元環(huán)上，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，

51、不易形成氫鍵，故不易形成上述成氫鍵，故不易形成上述螺旋；甘螺旋；甘氨酸的氨酸的R R基為基為H H，空間占位很小，也會(huì)影，空間占位很小，也會(huì)影響該處螺旋的穩(wěn)定。響該處螺旋的穩(wěn)定。l - -折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。鏈平行排列，通過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象l在在 - -折疊中，折疊中， - -碳原子總是處于折疊的角碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的上，氨基酸的R R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為棱角垂直，兩個(gè)氨基

52、酸之間的軸心距為0.35nm0.35nm； l - -折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。接近垂直。l - -折疊有兩種類(lèi)型折疊有兩種類(lèi)型：一種為：一種為平行式平行式，即所有肽鏈，即所有肽鏈的的N-N-端都在同一邊。另一種為端都在同一邊。另一種為反平行式反平行式，即相鄰，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。兩條肽鏈的方向相反。l在在 - -轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸

53、殘基組成酸殘基組成; ;l彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的的 -C=O -C=O 和第四個(gè)殘基的和第四個(gè)殘基的 N-H N-H 之間形成氫鍵，形成之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。l這類(lèi)結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋這類(lèi)結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。白分子中。l（1 1）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)( (Tertiary Structure) )是指在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈的不同區(qū)段的是指在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈的不同區(qū)段的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用在空間進(jìn)一步盤(pán)繞、折疊側(cè)鏈基團(tuán)相互作用在空間進(jìn)一步盤(pán)繞、折疊形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維形成的包括主鏈和

54、側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。l維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要有氫鍵、疏水鍵、維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋離子鍵和范德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起著重要作用。白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起著重要作用。l蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)(Quaternary Structure)是指是指由多條各自具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈通過(guò)由多條各自具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵連接起來(lái)的結(jié)構(gòu)形式；各個(gè)亞基在這非共價(jià)鍵連接起來(lái)的結(jié)構(gòu)形式；各個(gè)亞基在這些蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互些蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關(guān)系。作用關(guān)系。l這種

55、蛋白質(zhì)分子中，最小的單位通常稱為亞基這種蛋白質(zhì)分子中，最小的單位通常稱為亞基或亞單位或亞單位Subunit，它一般由一條肽鏈構(gòu)成，它一般由一條肽鏈構(gòu)成，無(wú)生理活性；無(wú)生理活性；l維持亞基之間的化學(xué)鍵主要是疏水力。維持亞基之間的化學(xué)鍵主要是疏水力。l由多個(gè)亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋由多個(gè)亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋白；白；l1 1纖維狀蛋白纖維狀蛋白 l 纖維狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)(fibrous protein)(fibrous protein)廣泛地分廣泛地分布于脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，它是動(dòng)物體的基布于脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，它是動(dòng)物體的基本支架和外保護(hù)成分，占脊推動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)本

56、支架和外保護(hù)成分，占脊推動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的一半或一半以上。總量的一半或一半以上。l這類(lèi)蛋白質(zhì)外形呈纖維狀或細(xì)棒狀，分子軸比這類(lèi)蛋白質(zhì)外形呈纖維狀或細(xì)棒狀，分子軸比( (長(zhǎng)軸短軸長(zhǎng)軸短軸) )大于大于10(10(小于小于1010的為球狀蛋白質(zhì)的為球狀蛋白質(zhì)) )。分子是有規(guī)則的線型結(jié)構(gòu)。分子是有規(guī)則的線型結(jié)構(gòu)。l纖維狀蛋白質(zhì)：纖維狀蛋白質(zhì)：不溶性不溶性( (硬蛋白硬蛋白) )和可溶性二和可溶性二類(lèi)，前者有角蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白等；類(lèi)，前者有角蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白等；l后者有肌球蛋白和纖維蛋白原等，但不包括后者有肌球蛋白和纖維蛋白原等，但不包括微管微管(microtubule)(micr

57、otubule)、肌動(dòng)蛋白細(xì)絲、肌動(dòng)蛋白細(xì)絲(actin (actin filament)filament)或鞭毛或鞭毛( flagella)( flagella)，它們是球狀，它們是球狀蛋白質(zhì)的長(zhǎng)向聚集體蛋白質(zhì)的長(zhǎng)向聚集體(aggregate)(aggregate)。l角蛋白廣泛存在于動(dòng)物的皮膚及皮膚的衍生物，如毛發(fā)、角蛋白廣泛存在于動(dòng)物的皮膚及皮膚的衍生物，如毛發(fā)、甲、角、鱗和羽等，屬于結(jié)構(gòu)蛋白。角蛋白中主要的是甲、角、鱗和羽等，屬于結(jié)構(gòu)蛋白。角蛋白中主要的是 - -角蛋白。角蛋白。l - -角蛋白主要由角蛋白主要由 - -螺旋構(gòu)象的多肽鏈組成。一般是由三螺旋構(gòu)象的多肽鏈組成。一般是由三條

58、右手條右手 - -螺旋肽鏈形成一個(gè)原纖維，原纖維的肽鏈之間螺旋肽鏈形成一個(gè)原纖維，原纖維的肽鏈之間有二硫鍵交聯(lián)以維持其穩(wěn)定性。有二硫鍵交聯(lián)以維持其穩(wěn)定性。l - -角蛋白的伸縮性能很好，當(dāng)角蛋白的伸縮性能很好，當(dāng) - -角蛋白被過(guò)度拉伸時(shí)，角蛋白被過(guò)度拉伸時(shí)，則氫鍵被破壞而不能復(fù)原。此時(shí)則氫鍵被破壞而不能復(fù)原。此時(shí) - -角蛋白轉(zhuǎn)變成角蛋白轉(zhuǎn)變成 - -折疊折疊結(jié)構(gòu)，稱為結(jié)構(gòu)，稱為 - -角蛋白。角蛋白。l毛的纖維是由多個(gè)原纖維平行排列，并由氫鍵和二硫鍵毛的纖維是由多個(gè)原纖維平行排列，并由氫鍵和二硫鍵作為交聯(lián)鍵將它們聚集成不溶性的蛋白質(zhì)。作為交聯(lián)鍵將它們聚集成不溶性的蛋白質(zhì)。l永久性卷發(fā)永久性

59、卷發(fā)( (燙發(fā)燙發(fā)) )是一項(xiàng)生物化學(xué)工程是一項(xiàng)生物化學(xué)工程(biochemical engineering),(biochemical engineering), 角蛋白在濕角蛋白在濕熱條件下可以伸展轉(zhuǎn)變?yōu)闊釛l件下可以伸展轉(zhuǎn)變?yōu)?構(gòu)象，但在冷卻構(gòu)象，但在冷卻干燥時(shí)又可自發(fā)地恢復(fù)原狀。干燥時(shí)又可自發(fā)地恢復(fù)原狀。l這是因?yàn)檫@是因?yàn)?角蛋白的側(cè)鏈角蛋白的側(cè)鏈R R基一般都比較大，基一般都比較大，不適于處在不適于處在 構(gòu)象狀態(tài)，此外構(gòu)象狀態(tài)，此外 角蛋白中的角蛋白中的螺旋多肽鏈間有著很多的二硫鍵交聯(lián)，這些交螺旋多肽鏈間有著很多的二硫鍵交聯(lián)，這些交聯(lián)鍵也是當(dāng)外力解除后使肽鏈恢復(fù)原狀聯(lián)鍵也是當(dāng)外力解除后

60、使肽鏈恢復(fù)原狀( ( 螺螺旋構(gòu)象旋構(gòu)象) )的重要力量。這就是卷發(fā)行業(yè)的生化的重要力量。這就是卷發(fā)行業(yè)的生化基礎(chǔ)?；A(chǔ)。l絲心蛋白絲心蛋白(fibroin)(fibroin)這是蠶這是蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白質(zhì)。絲和蜘蛛絲的一種蛋白質(zhì)。絲心蛋白具有抗張強(qiáng)度高，絲心蛋白具有抗張強(qiáng)度高，質(zhì)地柔軟的特性，但不能質(zhì)地柔軟的特性，但不能拉伸。拉伸。與與 角蛋白在濕熱角蛋白在濕熱中伸展后形成的中伸展后形成的 角蛋白角蛋白很相似。很相似。l絲心蛋白是典型的反平行絲心蛋白是典型的反平行式折疊片，多肽鏈取鋸齒式折疊片，多肽鏈取鋸齒狀折疊構(gòu)象，酰胺基的取狀折疊構(gòu)象，酰胺基的取向使相鄰的向使相鄰的C C 為側(cè)鏈騰出為