細(xì)胞染色體顯示和分帶技術(shù)ppt課件

1、第10章 細(xì)胞染色體顯示和分帶技術(shù)及其運用體外培育的細(xì)胞是研討細(xì)胞遺傳最便利、最有體外培育的細(xì)胞是研討細(xì)胞遺傳最便利、最有效的方法和對象，也是提示培育細(xì)胞性狀的效的方法和對象，也是提示培育細(xì)胞性狀的重要方面。重要方面。第一節(jié) 性染色質(zhì)檢測 在間期細(xì)胞核中，女性X染色質(zhì)和男性Y染色質(zhì)均可用特殊染色法顯示出來,性染色質(zhì)檢查方法如下:一、X染色質(zhì)顯示法 女性：X染色質(zhì) ：Barr氏體位于間期細(xì)胞核內(nèi)面，呈三角形或半月形小體，易被碳酸復(fù)紅或硫堇等染料著色 結(jié)果：細(xì)胞質(zhì)不著色，細(xì)胞核染成紫紅色，核內(nèi)Barr 小體呈三角形/半月形。二、Y染色質(zhì)顯示法 男性：Y染色質(zhì) ：鹽酸阿的平染色法 結(jié)果：Y染色質(zhì)呈特

2、別亮堂的黃綠色熒光園點，可位于核內(nèi)任何位置，但多見于中央部位，第二節(jié) 培育細(xì)胞染色體顯示法 一、原理一、原理 顯示染色體要選擇分裂中期細(xì)胞，顯示染色體要選擇分裂中期細(xì)胞，因細(xì)胞分裂處于中期時，染色體的因細(xì)胞分裂處于中期時，染色體的長短和大小恰到益處，是研討染色長短和大小恰到益處，是研討染色體的最好階段。體的最好階段。 獲得多量的中期分裂相及染色體分獲得多量的中期分裂相及染色體分散均勻的理想分裂相可采取的措施散均勻的理想分裂相可采取的措施如下如下:1提高細(xì)胞分裂相數(shù)提高細(xì)胞分裂相數(shù) 1細(xì)胞的選擇和處置 大多數(shù)傳代細(xì)胞應(yīng)選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞。初代淋巴細(xì)胞常用有絲分裂源PHA、ConA等刺激細(xì)胞。

3、2阻抑中期分裂 用秋水仙素(Colchicine)，現(xiàn)常用它的衍生物秋水仙胺(Colcemid)來破壞細(xì)胞有絲分裂中的紡錘絲，以發(fā)揚阻抑分裂中期的作用。由于DNA合成并無干擾，因此隨時間延伸可截獲很多中期分裂相，普通的用量：秋水仙素0.040.8mg/L培育液，秋水仙胺0.0040.08mg/L培育液。作用時間為26小時。2促染色體分散措施促染色體分散措施 1低滲處置 普通用0.075mol/L，在37水浴中將上述細(xì)胞處置2040分鐘，可使細(xì)胞體積脹大，染色體松散。 2固定 常用醋酸甲醇(1:3)混合液，用時現(xiàn)用現(xiàn)配。 顯示染色體方法很多，以下幾種方法較為常用。二、傳代細(xì)胞染色體檢查二、傳代細(xì)

4、胞染色體檢查 一、原理：秋水仙堿可使細(xì)胞停頓在分裂中期，染色體長短恰倒益處。 二、方法： 細(xì)胞類型：傳代細(xì)胞系，外周血LC，羊水，絨毛細(xì)胞等 方法：秋水仙素 低滲固定染色鏡檢末梢血培育法，Giemsa染色法顯示人染色體第三節(jié)第三節(jié) 染色體構(gòu)造顯示和檢染色體構(gòu)造顯示和檢測測 一、染色體顯帶原理和種類一、染色體顯帶原理和種類 二、染色體顯帶方法要點二、染色體顯帶方法要點 三、原理三、原理 四、常用染色體顯帶法四、常用染色體顯帶法 五、姐妹染色單體分化染色五、姐妹染色單體分化染色一、染色體顯帶原理和種類 一原理 染色體顯帶是沿著整個染色體的長軸，能顯現(xiàn)出著色深淺不同。 橫行走向的帶(Band)經(jīng)特殊

5、染色后，易著色的陽性帶(Positive Band)為含有A-T多的染色體節(jié)段，相反，G-C多的那么不易著色，為陰性帶(Negative Band)。有報道，已被定位的正?；蚝彤惓；蚪^大部分都在陰性帶區(qū)。人們推測，看家基因在陰性區(qū)帶，人染色體能顯示出近2000個G帶。二種類 染色體顯帶是指沿著整個染色體軸能出現(xiàn)著色深淺不同的橫紋。根據(jù)顯帶方法不同可分為：用奎吖因(QM)、阿的平(QD)熒光染色的帶，稱“Q帶；用Giemsa染色顯帶稱“G帶；用Giemsa染色顯示異染色質(zhì)部分稱“C帶；用特殊方法處置后，顯現(xiàn)出與Q帶和G帶相反的帶型稱“K帶等。目前，Q、G和C三種帶型較為常用，其中G帶更為多用

6、。二、染色體顯帶方法要點二、染色體顯帶方法要點 “老化處置：將染色體制片后存放310分鐘或86枯燥2030分鐘 顯Q帶法：用奎吖因(QM) 或阿的平(QM)染色顯帶 Giemsa顯G帶：胰酶消化 Giemsa染色顯帶 顯C帶法 ：在預(yù)熱至65的5%Ba(OH)2液中15分鐘 Giemsa染色15分鐘顯帶 留意：1、標(biāo)本片老化處置很重要；2、胰酶濃度和消化時間要事先熟知，消化要充分但不能過度；3、中期分裂相要多而均勻，稍長一些為佳1中期染色體 為了獲得稱心的顯帶效果，需制備質(zhì)量好的中期染色體標(biāo)本，即須到達(dá)以下要求：長度適宜，普通稍長一些，能顯出更多的條帶，這與參與秋水仙素的濃度和作用時間有關(guān)，要

7、控制好。染色體分散均勻無重疊，這與低滲有關(guān)，低滲缺乏染色體易發(fā)生重疊，過度易流失。無嚴(yán)重單體分叉。2特殊處置 中期染色體標(biāo)本顯帶效果的提高要經(jīng)三個步驟： 1標(biāo)本片應(yīng)先放置一段時間，稱“老化處置，以310天為宜。 2顯帶染色前要將標(biāo)本加溫預(yù)處置利于顯帶，預(yù)處置后的標(biāo)本不用再老化。常用80枯燥2030分鐘。 3胰蛋白酶消化較好(比用NaOH、尿素等好)。三、常用染色體顯帶法 1顯Q帶法 1將標(biāo)本片于pH6.0緩沖液中浸510分鐘后，再轉(zhuǎn)浸入用Soresen氏緩沖液(pH6.0)配制的0.2%的QD或QM染液中染色510分鐘(見表12-3-1)。 2用pH6.0的磷酸緩沖液漂洗2次，每次5分鐘，于玻

8、片上滴加12滴新穎緩沖液，加蓋片。 3在熒光顯微鏡下察看。表表12-3-1 Soresen(100ml)緩沖液緩沖液PHPHNaNa2 2HPOHPO4 4(1/15mol(1/15mol/L)/L)kHkH2 2POPO4 4(1/15m0l/(1/15m0l/L)L)pHpHNaNa2 2HPOHPO4 4(1/15mol(1/15mol/L)/L)kHkH2 2HPOHPO4 4(1/15m(1/15mol/L) ol/L) 5.295.292.52.597.597.56.816.81505050505.595.595 595956.986.98606040405.915.9110109

9、0907.177246.24202080807.387.38808020206.476.47363674747.737.73909010106.646.64404060608.048.0495955 52胰酶一Giemsa顯G帶法(1)將中期染色體標(biāo)本于6080烘箱中烘24小時或過夜，然后再浸入0.025m磷酸緩沖液中(pH6.8)，56溫浴10分鐘后，用現(xiàn)配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色1030分鐘，染色后用自來水沖洗，再用蒸餾水漂洗數(shù)次，涼干，二甲苯透明23分鐘，封入中性樹脂中。(2)將標(biāo)本放于4080烤箱中數(shù)小時或更長，用0.25%胰蛋白酶熱消化715分鐘

10、，并不斷悄然擺動玻片，水洗后再用Giemsa染液染510分鐘，用自來水沖洗，蒸餾水漂洗，涼干，二甲苯透明23分鐘，封入中性樹脂中。3顯C帶法 將中期染色體玻片先投入預(yù)熱至65的5%Ba(OH)2液中15分鐘，取出玻片用自來水沖洗后，再將玻片投入預(yù)熱至65的2SCC液中1小時10分鐘，待自來水沖洗后再過pH7.4磷酸沖液，用Giemsa染色15分鐘后鏡檢。 附：2SCC液配方：稱NacL17.5g和枸椽酸鈉8.82g液于1000mL蒸餾水中。 5%Ba(OH)2：稱Ba(OH)22.5g溶于50mL生理鹽水中。 必需留意：胰蛋白酶消化顯帶過程中，消化缺乏，帶不出現(xiàn)。消化過度，染色體變得膨脹和不著色。要留意胰蛋白酶濃度和消化時間。預(yù)處置或老化是顯帶的重要環(huán)節(jié)，干熱處置簡單易行，效果好。見書后照片6末梢血培育法，Giemsa染色分帶法顯示人染色體人染色體G帶慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓細(xì)胞PH染色體核型四、姐妹染色單體分化染色 (一)原理 細(xì)胞被培育在含有5-溴脫氧尿苷(5-Bromode Oxyurdine;BUdR)的培育基中，當(dāng)細(xì)胞DNA合成時，BUdR取代胸腺嘧啶核苷(Thymidine.TdR)進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，第一周期每條染色單體DNA雙鏈都被BUdR摻入(TB、TB)，第二周期只需一條單體保管了無BUdR舊鏈，另一條單體雙鏈都有BUd