第三章 細(xì)胞破碎

1、第三章第三章細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎與分離與分離3.13.1 概述概述3.2 3.2 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成及組成3.3 3.3 細(xì)胞壁的破碎細(xì)胞壁的破碎3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性3.1 3.1 概述概述v胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物 霉菌產(chǎn)生糖化酶等霉菌產(chǎn)生糖化酶等v胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物 基因重組產(chǎn)品等基因重組產(chǎn)品等 分離純化方法：分離純化方法： 使用分泌性宿主，使胞內(nèi)產(chǎn)物分泌到胞外使用分泌性宿主，使胞內(nèi)產(chǎn)物分泌到胞外 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 物理法，化學(xué)法，機(jī)械法，酶法物理法，化學(xué)法，機(jī)械法，酶法3.2 3.2 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成細(xì)胞壁的化學(xué)組成：細(xì)胞

2、壁的化學(xué)組成： 微生物的類型微生物的類型 年齡年齡 生長(zhǎng)生理學(xué)生長(zhǎng)生理學(xué)3.2 3.2 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成圖圖3.13.1 細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu) 3.2 3.2 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成微生物微生物革蘭式陽(yáng)性菌革蘭式陽(yáng)性菌革蘭式陰性菌革蘭式陰性菌酵母酵母壁厚（壁厚（nm）20801025100300層層單層單層多層多層多層多層主要組成主要組成肽聚糖肽聚糖(4090%)肽聚糖肽聚糖(510%)葡聚糖葡聚糖(3040%)多糖多糖脂蛋白脂蛋白甘露聚糖甘露聚糖（30）胞壁酸胞壁酸脂多糖脂多糖蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂類脂類破碎難易程度破

3、碎難易程度難難相對(duì)易相對(duì)易最難最難表表3.1 各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成3.3 3.3 細(xì)胞壁的破碎細(xì)胞壁的破碎破碎方法的選擇：破碎方法的選擇： 破碎目的破碎目的 待破碎生物體的類型待破碎生物體的類型v破碎目的：獲取產(chǎn)品，考慮破碎收率和能耗；破碎目的：獲取產(chǎn)品，考慮破碎收率和能耗； 研究胞內(nèi)產(chǎn)物在體內(nèi)的功能，宜研究胞內(nèi)產(chǎn)物在體內(nèi)的功能，宜 采用軟處理。采用軟處理。v待破碎生物體的類型：不同生物體對(duì)破碎有不待破碎生物體的類型：不同生物體對(duì)破碎有不 同的敏感度（同的敏感度（見表見表3.23.2）3.3 3.3 細(xì)胞壁的破碎細(xì)胞壁的破碎表表3.2 細(xì)胞對(duì)破碎的敏感度細(xì)胞

4、對(duì)破碎的敏感度細(xì)胞細(xì)胞聲波聲波攪拌攪拌減壓減壓冷凍壓力冷凍壓力動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞7777革蘭式陰性芽孢桿菌和球菌革蘭式陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭式陽(yáng)性芽孢桿菌革蘭式陽(yáng)性芽孢桿菌5（4）54酵母酵母3.5342.5革蘭式陽(yáng)性球菌革蘭式陽(yáng)性球菌3.5（2）325孢子孢子2（1）21菌絲菌絲16（1）5注：上述數(shù)字表示相對(duì)敏感度，括號(hào)內(nèi)數(shù)字不確切注：上述數(shù)字表示相對(duì)敏感度，括號(hào)內(nèi)數(shù)字不確切生物體的大小，形態(tài)，齡期，品系，生長(zhǎng)條件，細(xì)胞壁生物體的大小，形態(tài)，齡期，品系，生長(zhǎng)條件，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)，pH，溫度以及細(xì)胞的變化也影響對(duì)破碎的敏感度，溫度以及細(xì)胞的變化也影響對(duì)破碎的敏感度3.3.1 3.3.

5、1 破碎率的評(píng)價(jià)破碎率的評(píng)價(jià)破碎率的定義：破碎率的定義： N N0 0：原始細(xì)胞數(shù)：原始細(xì)胞數(shù) N N：經(jīng)：經(jīng)t t時(shí)間操作后，保存下來(lái)的細(xì)胞數(shù)時(shí)間操作后，保存下來(lái)的細(xì)胞數(shù)N N0 0 和和N N的獲?。旱墨@?。?直接計(jì)數(shù)法（平板計(jì)數(shù)，顯微鏡計(jì)數(shù)）直接計(jì)數(shù)法（平板計(jì)數(shù)，顯微鏡計(jì)數(shù)） 間接計(jì)數(shù)法（測(cè)破碎細(xì)胞釋放出活性物質(zhì)量）間接計(jì)數(shù)法（測(cè)破碎細(xì)胞釋放出活性物質(zhì)量） 電導(dǎo)率測(cè)定法電導(dǎo)率測(cè)定法%100(%)00NNNx3.1xR/RmR:破碎后釋放的化合物的量破碎后釋放的化合物的量Rm:理論最大釋放量理論最大釋放量電導(dǎo)率測(cè)定法：電導(dǎo)率測(cè)定法：細(xì)胞破碎后，大量帶電細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的物質(zhì)被釋放到水

6、相，使電導(dǎo)率上升荷的物質(zhì)被釋放到水相，使電導(dǎo)率上升，電導(dǎo)率隨破碎率的增加呈線性增加。，電導(dǎo)率隨破碎率的增加呈線性增加。 由于電導(dǎo)率與微生物的種類，處理由于電導(dǎo)率與微生物的種類，處理?xiàng)l件，細(xì)胞濃度，溫度，懸浮液中電解條件，細(xì)胞濃度，溫度，懸浮液中電解質(zhì)含量有關(guān)，因此，正式測(cè)定應(yīng)采用其質(zhì)含量有關(guān)，因此，正式測(cè)定應(yīng)采用其它方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。它方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法破碎方式破碎方式機(jī)械法機(jī)械法非機(jī)械法非機(jī)械法液體剪液體剪切作用切作用固體剪固體剪切作用切作用干燥干燥處理處理溶胞溶胞作用作用珠磨法珠磨法壓榨壓榨高壓高壓勻漿勻漿超聲超聲破碎破碎酶溶酶溶法法化學(xué)法化學(xué)法 物

7、理法物理法圖圖3.2 細(xì)胞破碎方法分類細(xì)胞破碎方法分類3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法圖圖3.3 細(xì)胞破碎機(jī)理細(xì)胞破碎機(jī)理3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法圖圖3.4 3.4 珠磨機(jī)簡(jiǎn)圖珠磨機(jī)簡(jiǎn)圖 珠磨法珠磨法生產(chǎn)廠商生產(chǎn)廠商: 瑞士瑞士WAB公司公司 德國(guó)西門子德國(guó)西門子機(jī)械公司機(jī)械公司形式：形式：立式立式臥式臥式（效率高）（效率高）3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法原理：原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球和微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨和微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊

8、而破碎，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。產(chǎn)熱由夾套帶走。產(chǎn)熱由夾套帶走。 珠磨法珠磨法珠磨機(jī)主體：珠磨機(jī)主體：立式和臥式圓筒型腔體立式和臥式圓筒型腔體一般，臥式比立式珠磨破碎效率高：一般，臥式比立式珠磨破碎效率高：因?yàn)橐驗(yàn)榱⑹綑C(jī)中向上流動(dòng)的液體在某種程度上會(huì)立式機(jī)中向上流動(dòng)的液體在某種程度上會(huì)使研磨珠流態(tài)化，從而降低其研磨效率。使研磨珠流態(tài)化，從而降低其研磨效率。研磨珠：研磨珠：玻璃玻璃( (密度為密度為2.5g2.5gcmcm3 3) )或氧化或氧化鋯鋯( (密度為密度為6.0 g6.0 gcmcm3 3) )微球微球( (粒徑約粒徑約0.10.110mm)10mm)，填充率為，填

9、充率為80808585。3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法動(dòng)力學(xué)方程：遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程動(dòng)力學(xué)方程：遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程 珠磨法珠磨法1 . 3.)(RRkdtdRmR：t時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g） Rm：能釋放的蛋白質(zhì)最大數(shù)量，即能釋放的蛋白質(zhì)最大數(shù)量，即100破碎破碎 k：破碎的比速率：破碎的比速率2 . 3.1100ktxLnkdtRRdRtRm其中：其中：XR/Rm，破碎率，破碎率3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影響破碎效率的因素：影響破碎效率的因素：v轉(zhuǎn)盤外緣速度轉(zhuǎn)盤外緣速度v細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度v珠粒大小及裝載量珠粒大小及裝載量v溫度溫度v流

10、速流速 珠磨法珠磨法影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素轉(zhuǎn)盤外緣速度：轉(zhuǎn)盤外緣速度： 在一定范圍內(nèi)，破碎的比速率與外在一定范圍內(nèi)，破碎的比速率與外緣速度成正比緣速度成正比 珠磨法珠磨法3 . 3.uk該式有一定的適用范圍，轉(zhuǎn)盤外緣速度增該式有一定的適用范圍，轉(zhuǎn)盤外緣速度增加到一限定值后，蛋白質(zhì)釋放就不再增加加到一限定值后，蛋白質(zhì)釋放就不再增加圖圖3.5 攪拌速率與蛋白質(zhì)釋放的關(guān)系攪拌速率與蛋白質(zhì)釋放的關(guān)系 70%珠體積；珠體積； 80%珠體積；珠體積； 85%珠體積珠體積影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素轉(zhuǎn)盤外緣速度增加雖然使細(xì)胞破碎增加，轉(zhuǎn)盤外緣速度增加雖然使細(xì)胞破碎增加，但產(chǎn)生的熱量和消

11、耗的功率也增加。破碎但產(chǎn)生的熱量和消耗的功率也增加。破碎效率效率E E被定義為：被定義為： 珠磨法珠磨法4 . 3.pRcqER：每：每Kg成品酵母釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量成品酵母釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量 q：物料通過量：物料通過量 c：酵母的濃度：酵母的濃度 P：5L珠磨機(jī)中，用于破碎所消耗的功率珠磨機(jī)中，用于破碎所消耗的功率圖圖3.6 某一珠磨機(jī)下在不同流量和攪拌速率的效率某一珠磨機(jī)下在不同流量和攪拌速率的效率1 1、8m/s8m/s2 2、10m/s10m/s3 3、15m/s15m/s4 4、20m/s20m/s10010010106 6m m3 3/s/s505010106 6m m3 3/s/s2

12、02010106 6m m3 3/s/s影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素細(xì)胞濃度：細(xì)胞濃度：影響懸浮液的流變特性，從而影響影響懸浮液的流變特性，從而影響蛋白質(zhì)的釋放，一般由實(shí)驗(yàn)確定蛋白質(zhì)的釋放，一般由實(shí)驗(yàn)確定一般控制在一般控制在4040左右，細(xì)胞濕重左右，細(xì)胞濕重/ /體積體積 珠磨法珠磨法影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素珠粒大小及裝載量：珠粒大小及裝載量：過少不，不易破碎過少不，不易破碎過多，能耗大，熱擴(kuò)散性能降低，引起溫度升高過多，能耗大，熱擴(kuò)散性能降低，引起溫度升高，不利攪拌，一般控制，不利攪拌，一般控制808090%.90%. 珠磨法珠磨法圖圖3.7 微珠直徑對(duì)破碎率的影響微珠

13、直徑對(duì)破碎率的影響對(duì)對(duì)細(xì)菌細(xì)菌，磨珠越，磨珠越小，破碎率越高小，破碎率越高；對(duì)；對(duì)酵母和藻類酵母和藻類，存在最佳范圍，存在最佳范圍實(shí)驗(yàn)室：實(shí)驗(yàn)室：0.2mm工業(yè)：不小于工業(yè)：不小于0.4mm影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素溫度：溫度：熱穩(wěn)定性，目的產(chǎn)物不受破壞熱穩(wěn)定性，目的產(chǎn)物不受破壞夾套冷卻夾套冷卻 珠磨法珠磨法影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素流量：流量： 珠磨法珠磨法圖圖3.8 流量對(duì)破碎速率常數(shù)的影響流量對(duì)破碎速率常數(shù)的影響處理能力但釋放量破碎量QQVtQkQ影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素微生物類型：微生物類型： 酵母較細(xì)菌在珠磨機(jī)中更易破碎酵母較細(xì)菌在珠磨機(jī)中更易破碎，因

14、為細(xì)菌細(xì)胞的大小僅為酵母細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞的大小僅為酵母細(xì)胞的十分之一，在高速珠磨機(jī)中不易破的十分之一，在高速珠磨機(jī)中不易破碎。碎。 珠磨法珠磨法影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素 珠磨法珠磨法影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素 延長(zhǎng)研磨時(shí)間，增加珠體裝量，提高基延長(zhǎng)研磨時(shí)間，增加珠體裝量，提高基本速度等均可提高細(xì)胞破碎率，但高破碎率本速度等均可提高細(xì)胞破碎率，但高破碎率，使，使能耗能耗加大。同時(shí)加大。同時(shí): :1 1、產(chǎn)生較多熱能，增加冷卻控溫的難度；、產(chǎn)生較多熱能，增加冷卻控溫的難度；2 2、大分子目的產(chǎn)物失活增加、大分子目的產(chǎn)物失活增加3 3、細(xì)胞碎片較小，碎片不易分離，給后續(xù)、細(xì)胞

15、碎片較小，碎片不易分離，給后續(xù)操作帶來(lái)困難。操作帶來(lái)困難。因此因此, ,破碎率控制在破碎率控制在8080以下。以下。 珠磨法珠磨法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法圖圖3.3 HC23-3.3 HC23-高壓細(xì)胞高壓細(xì)胞破碎機(jī)破碎機(jī)高壓勻漿法高壓勻漿法圖圖3.4 3.4 DY89-1 型電動(dòng)型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)玻璃勻漿機(jī)作用機(jī)理：作用機(jī)理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速之間的環(huán)隙高速( (可達(dá)到可達(dá)到450m450ms)s)噴出后撞擊噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而

16、在撞擊力和剪切力等劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為為505070MPa70MPa。 高壓勻漿法高壓勻漿法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法動(dòng)力學(xué)方程：高壓勻漿法中影響細(xì)胞破碎的因素動(dòng)力學(xué)方程：高壓勻漿法中影響細(xì)胞破碎的因素主要有壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。細(xì)胞破碎率主要有壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。細(xì)胞破碎率X X與操作壓力與操作壓力P P和循環(huán)操作次數(shù)和循環(huán)操作次數(shù)N N之間的關(guān)系可表之間的關(guān)系可表達(dá)為：（服從一級(jí)反應(yīng)規(guī)律達(dá)為：（服從一級(jí)反應(yīng)規(guī)律) )高壓勻漿法高壓勻漿法Nkpx11lnK:K:與溫度

17、，粘度等有關(guān)的速率常數(shù)與溫度，粘度等有關(guān)的速率常數(shù) ：2.92.9（釀酒酵母）；（釀酒酵母）；2.21(2.21(大腸桿菌大腸桿菌) )3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影響細(xì)胞破碎的因素：影響細(xì)胞破碎的因素：溫度溫度壓力壓力循環(huán)操作次數(shù)循環(huán)操作次數(shù)細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度閥座形式閥座形式高壓勻漿法高壓勻漿法影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素溫度：溫度：破碎率隨溫度的增加而增加破碎率隨溫度的增加而增加例如：操作溫度由例如：操作溫度由55增加到增加到3030，破碎率約提高，破碎率約提高1.51.5倍。倍。高溫對(duì)破碎有利，但應(yīng)考慮熱變性高溫對(duì)破碎有利，但應(yīng)考慮熱變性壓力每增加壓力每增加10MPa1

18、0MPa，溫度，溫度22。高壓勻漿法高壓勻漿法影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素濃度：濃度：一般認(rèn)為，酵母破碎率與細(xì)胞濃度無(wú)關(guān)一般認(rèn)為，酵母破碎率與細(xì)胞濃度無(wú)關(guān) DoulachDoulach等人通過理論分析，認(rèn)為破碎等人通過理論分析，認(rèn)為破碎率與細(xì)胞濃度存在下列關(guān)系：率與細(xì)胞濃度存在下列關(guān)系：高壓勻漿法高壓勻漿法ZppR0exp1Z:Z:常數(shù)；常數(shù)；P P：破碎壓力；：破碎壓力；p p0 0：臨界壓力；：臨界壓力； ：取決于細(xì)胞濃度的參數(shù)；：取決于細(xì)胞濃度的參數(shù)；R:R:蛋白質(zhì)的釋放量蛋白質(zhì)的釋放量影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素壓力：壓力：高壓勻漿法高壓勻漿法），能耗（每能耗磨損KW5

19、 . 3MPa100TRP不能單純追求高破碎率，隨意增加操作不能單純追求高破碎率，隨意增加操作壓力。壓力。影響破碎效率的因素影響破碎效率的因素閥座形式：閥座形式：在相同的操作壓力下，刃緣閥座比平在相同的操作壓力下，刃緣閥座比平邊閥座破碎率高，但更易磨損。邊閥座破碎率高，但更易磨損。高壓勻漿法高壓勻漿法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法高壓勻漿法高壓勻漿法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法圖圖3.5 JY92-3.5 JY92-型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 超聲波法超聲波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法作用機(jī)理：作用機(jī)理： 在超聲波作用下，液體發(fā)生空化作用在超聲波作

20、用下，液體發(fā)生空化作用(cavitaton)(cavitaton)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。聲波的聲頻、聲能有關(guān)。 超聲波法超聲波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法動(dòng)力學(xué)方程：一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：一級(jí) 超聲波法超聲波法)exp(1ktxx x：蛋白質(zhì)釋放分率：蛋白質(zhì)釋放分率t t：超聲波發(fā)射時(shí)間（：超聲波發(fā)射時(shí)間（minmin）k k：蛋白質(zhì)釋放常數(shù)：蛋白質(zhì)釋放常數(shù)(min(min-1-1),

21、),取決于輸取決于輸 入聲能入聲能3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法超聲波的負(fù)面影響：超聲波的負(fù)面影響：1 1、溫度上升：懸浮液預(yù)冷，夾套冷卻、溫度上升：懸浮液預(yù)冷，夾套冷卻 短期冷卻與短期破碎交替短期冷卻與短期破碎交替負(fù)載因素：聲波破碎負(fù)載因素：聲波破碎/ /冷卻的時(shí)間比率。冷卻的時(shí)間比率。2 2、超聲處理會(huì)引起諸如游離基這樣的化學(xué)、超聲處理會(huì)引起諸如游離基這樣的化學(xué)效應(yīng)，破壞目的產(chǎn)物，可加入游離基清除效應(yīng)，破壞目的產(chǎn)物，可加入游離基清除劑（組氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。劑（組氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。 超聲波法超聲波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影響破碎細(xì)胞的因素：影響

22、破碎細(xì)胞的因素：振幅：直接與聲能有關(guān)，影響比速率振幅：直接與聲能有關(guān)，影響比速率k k粘度：影響能耗，并抑制空穴現(xiàn)象粘度：影響能耗，并抑制空穴現(xiàn)象表面張力：表面活性劑顯著影響聲波破碎效表面張力：表面活性劑顯著影響聲波破碎效率，因起泡使蛋白質(zhì)變性，空穴清除率，因起泡使蛋白質(zhì)變性，空穴清除懸浮液體體積：大體積需要高的聲能懸浮液體體積：大體積需要高的聲能 超聲波法超聲波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法影響破碎細(xì)胞的因素：影響破碎細(xì)胞的因素： 加入珠粒體積與直徑加入珠粒體積與直徑: :加入細(xì)小珠粒，利于空加入細(xì)小珠粒，利于空穴形成，并有輔助穴形成，并有輔助“研磨效應(yīng)研磨效應(yīng)”，提高破碎率。，

23、提高破碎率。在相同珠粒填充密度下，隨珠粒直徑變化，在相同珠粒填充密度下，隨珠粒直徑變化，k k存存在最大值。在最大值。 探頭的材料和形狀：選擇具有良好聲學(xué)和機(jī)探頭的材料和形狀：選擇具有良好聲學(xué)和機(jī)械性能并對(duì)生物物質(zhì)無(wú)毒的金屬材料，如：鈦，械性能并對(duì)生物物質(zhì)無(wú)毒的金屬材料，如：鈦，不銹鋼等；探頭的振幅與其面積呈反比，小直徑不銹鋼等；探頭的振幅與其面積呈反比，小直徑探頭，聲能限制在較小范圍內(nèi)，并且效率低。探頭，聲能限制在較小范圍內(nèi)，并且效率低。 細(xì)胞懸浮液的流速：流速增加，破碎率低，處理細(xì)胞懸浮液的流速：流速增加，破碎率低，處理量大量大 工業(yè)未使用，向大量懸浮液通入足夠能量，工業(yè)未使用，向大量懸浮

24、液通入足夠能量，很困難，產(chǎn)熱問題。很困難，產(chǎn)熱問題。 超聲波法超聲波法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法機(jī)械法破碎細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)：機(jī)械法破碎細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v內(nèi)含物全部釋放內(nèi)含物全部釋放v時(shí)間短，效率高，成本低時(shí)間短，效率高，成本低v通用性強(qiáng)，適于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)通用性強(qiáng)，適于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v需要高的能量需要高的能量v產(chǎn)生高溫，高剪切力，引起產(chǎn)品變性失活產(chǎn)生高溫，高剪切力，引起產(chǎn)品變性失活v非專一性，碎片分布寬，給分離造成困難非專一性，碎片分布寬，給分離造成困難3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法作用機(jī)理：作用機(jī)理：酶溶法酶溶法(Enzymaticlysis)(

25、Enzymaticlysis)利用溶解細(xì)利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大腦內(nèi)產(chǎn)物的遇透性。增大腦內(nèi)產(chǎn)物的遇透性。 溶菌酶適用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的分解，應(yīng)用溶菌酶適用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTAEDTA使之更有效地作用于使之更有效地作用于細(xì)胞壁。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用細(xì)胞壁。真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。酵母細(xì)胞的酶溶需用不同的酶。酵母細(xì)

26、胞的酶溶需用Zymo1yase(Zymo1yase(幾種細(xì)菌幾種細(xì)菌酶的混合物酶的混合物) )、 -1,6-1,6葡聚糖酶葡聚糖酶( (或甘露糖酶）；破或甘露糖酶）；破壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶壞植物細(xì)胞壁需用纖維素酶 酶法胞溶酶法胞溶3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v產(chǎn)品釋放選擇性高產(chǎn)品釋放選擇性高v抽提速率和收率高抽提速率和收率高v產(chǎn)品破壞少產(chǎn)品破壞少vpHpH、溫度外界條件要求低、溫度外界條件要求低v不殘留細(xì)胞碎片不殘留細(xì)胞碎片 酶法胞溶酶法胞溶缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v費(fèi)用高費(fèi)用高v通用性差通用性差v存在產(chǎn)品抑制存在產(chǎn)品抑制v不適于工業(yè)生產(chǎn)不適于工業(yè)生產(chǎn)3.3.2 3.3.2 破

27、碎方法破碎方法應(yīng)用：應(yīng)用：v原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合v釋放出克隆出的胞內(nèi)蛋白釋放出克隆出的胞內(nèi)蛋白v制取特殊的壁葡萄糖聚合物制取特殊的壁葡萄糖聚合物v與機(jī)械法破碎細(xì)胞協(xié)同使用與機(jī)械法破碎細(xì)胞協(xié)同使用v從細(xì)胞內(nèi)不同的位置選擇性的釋放蛋白從細(xì)胞內(nèi)不同的位置選擇性的釋放蛋白 酶法胞溶酶法胞溶3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法作用機(jī)理：作用機(jī)理：用化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分用化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分處理方法：處理方法：酸堿處理；化學(xué)試劑；表面活性劑；有機(jī)溶劑酸堿處理；化學(xué)試劑；表面活性劑；有機(jī)溶劑EDTAEDTA螯合劑；變性劑螯合劑；變性劑 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法3.3.

28、2 3.3.2 破碎方法破碎方法優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v產(chǎn)物釋放有一定的產(chǎn)物釋放有一定的 選擇性選擇性v不需要特殊設(shè)備不需要特殊設(shè)備v細(xì)胞外形保持完整，細(xì)胞外形保持完整， 細(xì)胞碎片少，漿液粘細(xì)胞碎片少，漿液粘 度低，利于后續(xù)分離度低，利于后續(xù)分離 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v通用性差通用性差v時(shí)間長(zhǎng)，效率低時(shí)間長(zhǎng)，效率低v某些化學(xué)試劑有毒某些化學(xué)試劑有毒3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法應(yīng)用：應(yīng)用：v檢測(cè)胞內(nèi)酶活性檢測(cè)胞內(nèi)酶活性v釋放胞內(nèi)物質(zhì)研究釋放胞內(nèi)物質(zhì)研究 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法滲透壓沖擊法：滲透壓沖擊法： 滲透壓沖擊滲透壓沖擊(Osmotic s

29、hock)(Osmotic shock)是在各種是在各種細(xì)胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易細(xì)胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易于破碎的細(xì)咆，如動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰于破碎的細(xì)咆，如動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。性菌。 物理法物理法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法凍融法：凍融法： 將細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，將細(xì)胞急劇凍結(jié)后在室溫緩慢融化，此凍結(jié)融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受此凍結(jié)融化操作反復(fù)進(jìn)行多次，使細(xì)胞受到破壞。凍結(jié)的作用是破壞細(xì)胞膜的琉水到破壞。凍結(jié)的作用是破壞細(xì)胞膜的琉水鍵結(jié)構(gòu)，增加其親水性和通透性。鍵結(jié)構(gòu)，增加其親水性和通透性。 另一方面，出于胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外另一方面，出于胞內(nèi)

30、水結(jié)晶使胞內(nèi)外產(chǎn)生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細(xì)產(chǎn)生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細(xì)胞膨脹而破裂胞膨脹而破裂 物理法物理法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法干燥法：干燥法： 將細(xì)胞用不同的方法干燥（真空、冷凍將細(xì)胞用不同的方法干燥（真空、冷凍、噴霧和氣流等），細(xì)胞膜結(jié)合水喪失，滲、噴霧和氣流等），細(xì)胞膜結(jié)合水喪失，滲透性發(fā)生變化而破裂透性發(fā)生變化而破裂缺點(diǎn)：條件變化劇烈，易引起生物物質(zhì)變性缺點(diǎn)：條件變化劇烈，易引起生物物質(zhì)變性 物理法物理法3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目 機(jī)械法機(jī)械法 非機(jī)械法非機(jī)械法比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目 機(jī)械法機(jī)械法 非機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理破碎

31、機(jī)理 切碎細(xì)胞切碎細(xì)胞溶解局部溶解局部壁膜壁膜效率效率效率高效率高效率低效率低碎片大小碎片大小 碎片細(xì)小碎片細(xì)小 碎片較大碎片較大設(shè)備設(shè)備需專用需專用設(shè)備設(shè)備不需專不需專用設(shè)備用設(shè)備內(nèi)含物內(nèi)含物釋放釋放全部全部部分部分通用性通用性強(qiáng)強(qiáng)差差粘度粘度高（核酸高（核酸多）多）低（核酸低（核酸少）少）經(jīng)濟(jì)經(jīng)濟(jì)成本低成本低成本高成本高時(shí)間時(shí)間時(shí)間短時(shí)間短時(shí)間長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)范圍工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室范圍范圍表表3.3 機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法的比較機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法的比較3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法破碎技術(shù)的選擇原則：破碎技術(shù)的選擇原則：v目的產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)中，

32、需機(jī)械破碎法目的產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)中，需機(jī)械破碎法v目的產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，可采用非機(jī)械目的產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，可采用非機(jī)械破碎法破碎法v目的產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采目的產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用兩種方法結(jié)合用兩種方法結(jié)合3.3.2 3.3.2 破碎方法破碎方法破碎技術(shù)的研究發(fā)展方向：破碎技術(shù)的研究發(fā)展方向：v多種破碎方法結(jié)合多種破碎方法結(jié)合v與上游過程結(jié)合與上游過程結(jié)合 1 1、培養(yǎng)過程控制、培養(yǎng)過程控制 2 2、寄主細(xì)胞選擇、寄主細(xì)胞選擇 3 3、克隆噬菌體溶解基因、克隆噬菌體溶解基因 4 4、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)v與下游結(jié)合與下游結(jié)合 從后分離過程考察細(xì)胞破碎技術(shù)

33、從后分離過程考察細(xì)胞破碎技術(shù)3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性 外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)常形外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)常形成不可溶、無(wú)生物活性的聚集體成不可溶、無(wú)生物活性的聚集體(aggregation)又稱包涵體又稱包涵體(inclusion body) 以包涵體形式存在的聚集蛋白質(zhì)分子不具以包涵體形式存在的聚集蛋白質(zhì)分子不具有正確的三維結(jié)構(gòu)有正確的三維結(jié)構(gòu)(天然結(jié)構(gòu)天然結(jié)構(gòu)),它們?cè)谒芩鼈冊(cè)谒芤褐型ǔ２蝗芙馇覜]有活性液中通常不溶解且沒有活性,包含體必須經(jīng)包含體必須經(jīng)過變性、復(fù)性才能獲得生物學(xué)功能過變性、復(fù)性才能獲得生物學(xué)功能 什么是包涵體

34、什么是包涵體3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的形成包涵體的形成圖圖3.8 蛋白質(zhì)的合成、折疊與聚集示意圖蛋白質(zhì)的合成、折疊與聚集示意圖v包涵體形成的原因主要是高水平表達(dá)的結(jié)果包涵體形成的原因主要是高水平表達(dá)的結(jié)果?；钚缘鞍椎漠a(chǎn)率取決于蛋白合成的速率、?；钚缘鞍椎漠a(chǎn)率取決于蛋白合成的速率、蛋白折疊的速率、蛋白聚集的速率蛋白折疊的速率、蛋白聚集的速率( (如圖如圖3.83.8所示所示) )。在高水平表達(dá)時(shí)。在高水平表達(dá)時(shí), ,新生肽鏈的聚集速新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成。涵體的形成。

35、v重組蛋白分子內(nèi)及分子間二硫鍵的錯(cuò)配重組蛋白分子內(nèi)及分子間二硫鍵的錯(cuò)配v由于重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)由于重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí),缺乏一缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子,如如折疊酶和分子伴侶等折疊酶和分子伴侶等,是包涵體形成的又一是包涵體形成的又一原因。原因。 包涵體的形成包涵體的形成3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體形成對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)包涵體形成對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì): :v包涵體具有高密度包涵體具有高密度, ,易于分離純化易于分離純化; ;v重組蛋白以包涵體的形式存在有效地重組蛋白以包涵體的形式存在

36、有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對(duì)目的蛋抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解白的降解; ;v對(duì)于生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象時(shí)對(duì)宿主對(duì)于生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白時(shí)細(xì)胞有毒害的蛋白時(shí), ,包涵體形成無(wú)包涵體形成無(wú)疑是最佳選擇疑是最佳選擇包涵體的形成包涵體的形成3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性溶菌酶處理溶菌酶處理高壓勻質(zhì)破碎高壓勻質(zhì)破碎低速離心低速離心包含體沉淀包含體沉淀 需用去污劑需用去污劑(TtitonX 100(TtitonX 100或脫氧膽或脫氧膽酸鈉酸鈉) )和低濃度變性劑和低濃度變性劑( (如如2mol/L2mol/L尿素尿素或鹽酸胍等

37、或鹽酸胍等) )洗滌以除去脂類和膜蛋洗滌以除去脂類和膜蛋白。通過以上制備可獲得高純度的包白。通過以上制備可獲得高純度的包含體含體( (純度高于純度高于70%)70%)包涵體的制備包涵體的制備3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性復(fù)性又稱再折疊復(fù)性又稱再折疊(refolding),是指變是指變性蛋白質(zhì)在變性劑去除或濃度降低性蛋白質(zhì)在變性劑去除或濃度降低后，就會(huì)自發(fā)地從變性的熱不穩(wěn)定后，就會(huì)自發(fā)地從變性的熱不穩(wěn)定狀態(tài)向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，形成狀態(tài)向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，形成具有生物學(xué)功能的天然結(jié)構(gòu)具有生物學(xué)功能的天然結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性3.4 3.4 包涵體的分

38、離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性復(fù)性步驟復(fù)性步驟:用脲或鹽酸胍等變性劑溶解包涵用脲或鹽酸胍等變性劑溶解包涵體使其變成伸展的肽鏈結(jié)構(gòu)。體使其變成伸展的肽鏈結(jié)構(gòu)。脫除變性劑，使伸展的肽鏈折疊脫除變性劑，使伸展的肽鏈折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)。成正確的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性 溶解：溶解：在復(fù)性之前，包含體必需用強(qiáng)在復(fù)性之前，包含體必需用強(qiáng)變性劑變性劑( (如如8mol/L8mol/L尿素尿素,6mol/L,6mol/L鹽酸胍鹽酸胍) )、去污劑、去污劑( (如如) )或酸或酸(70%(70%甲酸甲酸) )溶溶解，在變

39、性液中需加入還原劑二硫基解，在變性液中需加入還原劑二硫基蘇糖醇（蘇糖醇（DTTDTT）或）或巰基乙醇（巰基乙醇（Z ZMEME）以使重組蛋白質(zhì)中所有的二硫鍵）以使重組蛋白質(zhì)中所有的二硫鍵打開打開, ,同時(shí)還需加入金屬鰲合劑如同時(shí)還需加入金屬鰲合劑如EDTAEDTA或或EGTA,EGTA,以鰲合以鰲合CuCu2 2、FeFe3 3等金屬離子等金屬離子, ,防止已處于還原狀態(tài)的巰基與之發(fā)生防止已處于還原狀態(tài)的巰基與之發(fā)生氧化反應(yīng)。氧化反應(yīng)。蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性3.4 3.4 包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性包涵體的分離與蛋白質(zhì)的復(fù)性提高復(fù)性成功率采取措施：提高復(fù)性成功率采取措施：v在低濃度下進(jìn)行蛋白

40、質(zhì)復(fù)性（稀釋在低濃度下進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性（稀釋 復(fù)性復(fù)性) )v膜分離法脫除變性劑膜分離法脫除變性劑v加入凝集抑制劑加入凝集抑制劑v加入分子伴侶加入分子伴侶v層析復(fù)性（吸附和凝膠過濾色譜）層析復(fù)性（吸附和凝膠過濾色譜）v反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)萃取v雙水相萃取雙水相萃取蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性提高復(fù)性成功率采取措施提高復(fù)性成功率采取措施1 1、稀釋復(fù)性、稀釋復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性 蛋白質(zhì)折疊為分子內(nèi)反應(yīng)蛋白質(zhì)折疊為分子內(nèi)反應(yīng), ,為一級(jí)反應(yīng)過程為一級(jí)反應(yīng)過程, ,而聚集體的生成為二級(jí)以上的反應(yīng)過程。所而聚集體的生成為二級(jí)以上的反應(yīng)過程。所以以, ,低蛋白質(zhì)濃度有利于獲得較高的復(fù)性收率低蛋白質(zhì)濃度有利

41、于獲得較高的復(fù)性收率。因此。因此, ,目前蛋白質(zhì)復(fù)性的濃度均較低。目前蛋白質(zhì)復(fù)性的濃度均較低。提高復(fù)性成功率采取措施提高復(fù)性成功率采取措施1 1、稀釋復(fù)性、稀釋復(fù)性 10105050 g/mlg/ml缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：降低蛋白質(zhì)濃度勢(shì)必增大蛋白質(zhì)溶液降低蛋白質(zhì)濃度勢(shì)必增大蛋白質(zhì)溶液體積體積, ,給后續(xù)的分離純化增加困難，耗費(fèi)大給后續(xù)的分離純化增加困難，耗費(fèi)大 解決辦法：解決辦法：將流加操作引入復(fù)性過程將流加操作引入復(fù)性過程, ,即以即以流加的方式向復(fù)性緩沖液中輸入變性蛋白質(zhì)流加的方式向復(fù)性緩沖液中輸入變性蛋白質(zhì)。由于在流加的同時(shí)復(fù)性液中的蛋白質(zhì)發(fā)生。由于在流加的同時(shí)復(fù)性液中的蛋白質(zhì)發(fā)生折疊復(fù)性折疊復(fù)

42、性, ,使變性蛋白質(zhì)濃度始終保持在較使變性蛋白質(zhì)濃度始終保持在較低的水平低的水平, ,可在較高的蛋白質(zhì)終濃度下獲得可在較高的蛋白質(zhì)終濃度下獲得高復(fù)性收率。這種復(fù)性方法在變性溶菌酶復(fù)高復(fù)性收率。這種復(fù)性方法在變性溶菌酶復(fù)性中得到了驗(yàn)證性中得到了驗(yàn)證蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性提高復(fù)性成功率采取措施提高復(fù)性成功率采取措施2 2、膜分離法脫除變性劑、膜分離法脫除變性劑膜分離法中可采用透析、超濾或電滲析等除膜分離法中可采用透析、超濾或電滲析等除去變性劑。此法不會(huì)增加料液體積和降低目去變性劑。此法不會(huì)增加料液體積和降低目標(biāo)蛋白濃度，克服了稀釋法的缺點(diǎn)標(biāo)蛋白濃度，克服了稀釋法的缺點(diǎn) 。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：透析法耗費(fèi)時(shí)

43、間較長(zhǎng)，易形成蛋白質(zhì)沉淀。透析法耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，易形成蛋白質(zhì)沉淀。超濾和電滲析速度較快，由于剪切力，容易超濾和電滲析速度較快，由于剪切力，容易使蛋白失活，且易引起膜污染，操作時(shí)應(yīng)注使蛋白失活，且易引起膜污染，操作時(shí)應(yīng)注意。意。蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性提高復(fù)性成功率采取措施提高復(fù)性成功率采取措施3 3、加入凝集抑制劑、加入凝集抑制劑由于分子間疏水性作用導(dǎo)致的聚集體生成是由于分子間疏水性作用導(dǎo)致的聚集體生成是影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率的主要原因影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率的主要原因, ,加入凝集加入凝集抑制劑抑制聚集體的生成抑制劑抑制聚集體的生成, ,從而開發(fā)了從而開發(fā)了“添添加稀釋加稀釋”復(fù)性技術(shù)。甘油、聚乙二醇、

44、表面復(fù)性技術(shù)。甘油、聚乙二醇、表面活性劑、單克隆抗體和丙酮；另添加肽基活性劑、單克隆抗體和丙酮；另添加肽基 脯氨?；樂串悩?gòu)酶、脯氨?；樂串悩?gòu)酶、 精氨酸和谷胱苷精氨酸和谷胱苷肽等促使蛋白質(zhì)某些結(jié)構(gòu)位點(diǎn)肽等促使蛋白質(zhì)某些結(jié)構(gòu)位點(diǎn)( (如二硫鍵如二硫鍵) )的的形成形成, ,也可促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。也可促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：體系中增加新物質(zhì)，增加后續(xù)純化難度。體系中增加新物質(zhì)，增加后續(xù)純化難度。蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性提高復(fù)性成功率采取措施提高復(fù)性成功率采取措施4 4、加入分子伴侶、加入分子伴侶分子伴侶分子伴侶( (一種蛋白質(zhì)一種蛋白質(zhì), ,如：如：GroEL和和GroES)在體內(nèi)

45、和體在體內(nèi)和體外均可輔助蛋白質(zhì)折疊成正確的天然態(tài)。外均可輔助蛋白質(zhì)折疊成正確的天然態(tài)。 GroEL分子可分子可通過疏水性作用捕獲變性蛋白質(zhì)通過疏水性作用捕獲變性蛋白質(zhì), ,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊。同誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的折疊。同時(shí)時(shí), ,在在GroES和腺苷三磷酸和腺苷三磷酸(ATP)(ATP)的共同作用下的共同作用下, ,部分或完部分或完全折疊的蛋白質(zhì)被釋放到溶液中全折疊的蛋白質(zhì)被釋放到溶液中, ,未完成折疊的蛋白質(zhì)可未完成折疊的蛋白質(zhì)可被被GroEL重新捕獲重新捕獲, ,直至復(fù)性完全為止。直至復(fù)性完全為止。模擬分子伴侶模擬分子伴侶的兩步復(fù)性過程的兩步復(fù)性過程, , 第一步是利用去污劑分第一步是利用去污劑分

46、子子( (模擬模擬GroEL) )捕獲變性蛋白質(zhì)捕獲變性蛋白質(zhì), ,防止蛋白質(zhì)的分子間疏防止蛋白質(zhì)的分子間疏水作用水作用, ,第二步是利用環(huán)糊精第二步是利用環(huán)糊精( (模擬模擬GroES和和ATPATP）對(duì)去）對(duì)去污劑快速剝離污劑快速剝離, ,釋放部分復(fù)性或完全復(fù)性的蛋白質(zhì)。這種釋放部分復(fù)性或完全復(fù)性的蛋白質(zhì)。這種方法操作方便方法操作方便, ,添加劑成本低廉添加劑成本低廉, ,復(fù)性效率較高復(fù)性效率較高, ,有廣泛的有廣泛的應(yīng)用前景。應(yīng)用前景。 提高復(fù)性成功率采取措施提高復(fù)性成功率采取措施5 5、層析復(fù)性、層析復(fù)性（吸附和凝膠過濾色譜）（吸附和凝膠過濾色譜）吸附：金屬螯合、親和色譜、離子交換和疏水等吸附：金屬螯合、親和色譜、離子交換和疏水等優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :在進(jìn)樣后可很快除去變性劑在進(jìn)樣后可很快除去變性劑; ;由于色譜固定相對(duì)變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯地由于色譜固定相對(duì)變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯地減少、甚至完