生化檢測(cè)原理

1、第二部分：Spectrophotometry Principle 分光光度法檢測(cè)原理 所以：待測(cè)物濃度可以由檢測(cè)其顏色深淺得到。不同濃度，顏色深淺不一。沒(méi)有顏色？間接：通過(guò)生化反應(yīng)生成有色物質(zhì)，間接計(jì)算得到濃度。雙縮脲反應(yīng)分光光度法的原理基礎(chǔ)：Lambert-Beer Law ，I 入射光及通過(guò)樣品后的透射光強(qiáng)度；A吸光度(absorbance) ；C樣品濃度；d光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；k光被吸收的比例系數(shù)；T透射比，即透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度之比。簡(jiǎn)而言之，光被一定濃度介質(zhì)吸收的比例與入射光的強(qiáng)度無(wú)關(guān)；在光程上每等厚層介質(zhì)吸收相同比例值的光。 Lambert-Beer Law的適用范

2、圍：(1) 入射光為平行單色光且垂直照射.(2) 吸光物質(zhì)為均勻非散射體系.(3) 吸光質(zhì)點(diǎn)之間無(wú)相互作用.(4) 輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收,無(wú)熒光和光化學(xué)現(xiàn)象發(fā)生.(5) 待測(cè)物在一定溶度范圍之內(nèi).為什么需要平行單色光？ 在非單色光的條件下，由于待測(cè)物質(zhì)在各個(gè)波段下吸光系數(shù) K 的不同，造成相關(guān)曲線也出現(xiàn)不同程度的偏離。 實(shí)際上，理論上的單色光是不存在的，我們所做的只能是讓入射光的光譜帶寬盡可能的小，要盡可能的靠近單色光。為什么僅適用一定范圍內(nèi)？ Lambert-Beer Law在有解離、締合、生成絡(luò)合物或溶劑化等會(huì)對(duì)比爾定律產(chǎn)生偏離。 解離是偏離朗伯-比爾定律的主要化學(xué)因素，當(dāng)溶液

3、濃度（大于0.01mmol/L）改變，解離程度也會(huì)發(fā)生變化，吸光度與濃度的比例關(guān)系便發(fā)生變化，導(dǎo)致偏離朗伯-比爾定律。前分光模式1、光源燈發(fā)出全波段光線2、單色器將全波段光線分為某一波長(zhǎng)的單色平行光3、單色平行光經(jīng)過(guò)反應(yīng)杯溶液4、光電信號(hào)接收器檢測(cè)光線強(qiáng)度后分光模式5、光電信號(hào)檢測(cè)各種光線強(qiáng)度4、衍射光柵將出射光線分為不同波長(zhǎng)的單色光3、平行光經(jīng)過(guò)反應(yīng)杯溶液1、光源燈發(fā)出全波段光線2、光線經(jīng)凸透鏡整理成為不同波段平行光雙波長(zhǎng)模式在雙波長(zhǎng)模式下A=A（主波長(zhǎng)）-A（副波長(zhǎng)）較單波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)：1、電壓不穩(wěn)定等環(huán)境影響下，由于主副波長(zhǎng)都產(chǎn)生了相同程度的影響而被消除2、一些常見(jiàn)的干擾因素如輕度溶血，將可

4、以由于在主波長(zhǎng)和副波長(zhǎng)具有相同的吸光度而被間接消除3、雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響在羅氏儀器上，待測(cè)物的12個(gè)波長(zhǎng)的吸光度都被檢測(cè)，選擇設(shè)定中的2個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算。分光光度法的分析類型一，終點(diǎn)法1-Point End Assay2-Point End Assay二，速率法2-Point Rate AssayRate Assay1Point End：僅檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度2-point end assay :檢測(cè)2個(gè)點(diǎn)的吸光度，一點(diǎn)反應(yīng)啟動(dòng)前樣品空白的吸光度，另一點(diǎn)為反應(yīng)啟動(dòng)后的吸光度。2-Point End Assay反應(yīng)圖

5、：2-Point Rate Assay：檢測(cè)兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)之間的吸光度之差，除以時(shí)間差得到的變化率1個(gè)或多個(gè)反應(yīng)試劑檢測(cè)2個(gè)點(diǎn)吸光度用于計(jì)算通過(guò) Abs/min來(lái)計(jì)算檢測(cè)項(xiàng)目的量2-point Rate assay反應(yīng)圖1個(gè)或多個(gè)反應(yīng)試劑通過(guò)最小二乘法計(jì)算反應(yīng)曲線，得到待測(cè)物的量或活性Rate A：一定時(shí)間連續(xù)多次測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物量隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)，間接計(jì)算檢測(cè)項(xiàng)目的量的方法。Rate A反應(yīng)圖：檢測(cè)方法檢測(cè)方法檢測(cè)物質(zhì)檢測(cè)物質(zhì)Examples Examples 校準(zhǔn)方法校準(zhǔn)方法1點(diǎn)終點(diǎn)法底物類TG, CHOL2點(diǎn)線性校準(zhǔn)2點(diǎn)終點(diǎn)法底物類TP,ALB, Glu ，TB, DB,

6、 Ca ,Pho , UA,HDL ,LDL 2點(diǎn)線性校準(zhǔn)特定蛋白類HSCRP, HbA1c多點(diǎn)非線性校準(zhǔn)速率A法酶類AST, ALT, GGT, LDH, CK2點(diǎn)線性校準(zhǔn)底物CREA Jaffe, UREA, Ammonia , TDM2點(diǎn)線性校準(zhǔn)2點(diǎn)速率法底物UREA, ACP，Urinary/CSF protin2點(diǎn)線性校準(zhǔn)光度分析校準(zhǔn)及報(bào)警Calibration quality criteriaCalibration quality criteria校準(zhǔn)限制界校準(zhǔn)限制界面面Utility Application screenUtility Application screenSD L

7、imit(SD Limit(標(biāo)準(zhǔn)差限制標(biāo)準(zhǔn)差限制) :) :實(shí)測(cè)吸光度和理論計(jì)算吸光度的差異實(shí)測(cè)吸光度和理論計(jì)算吸光度的差異Duplicate limit (Duplicate limit (重復(fù)性限制重復(fù)性限制):):重復(fù)性限制重復(fù)性限制, ,相對(duì)范圍相對(duì)范圍% %和絕對(duì)范圍和絕對(duì)范圍Sensitivity limitSensitivity limit( (靈敏度限制靈敏度限制) ) : :空白濃度和空白濃度和 c.f.a.sc.f.a.s之間的單位濃度吸光度變化之間的單位濃度吸光度變化差異的最大值和最小值差異的最大值和最小值 S1 Absorbance Limit(S1 Absorbanc

8、e Limit(空白限制空白限制) :) :試劑空白就是待測(cè)物濃度為試劑空白就是待測(cè)物濃度為0 0時(shí)的吸光度時(shí)的吸光度. .校準(zhǔn)報(bào)告校準(zhǔn)報(bào)告CHOCHOStd1,2Std1,2雙波長(zhǎng)雙波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度差檢測(cè)吸光度差Std1,2Std1,2主波長(zhǎng)主波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度檢測(cè)吸光度校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)結(jié)果校準(zhǔn)結(jié)果K= (CFAS -0)/ (5848-1973) x 10000=1120K= (CFAS -0)/ (5848-1973) x 10000=1120K = (CN Cb) K = (CN Cb) (AN Ab) (AN Ab)SD Limit(SD Limit(標(biāo)準(zhǔn)差限制標(biāo)準(zhǔn)差限制):):常見(jiàn)校

9、準(zhǔn)校準(zhǔn)失敗常見(jiàn)校準(zhǔn)校準(zhǔn)失敗的原因的原因1.1. 校準(zhǔn)的放置順序可能有誤（多個(gè)校準(zhǔn)的放置順序可能有誤（多個(gè)校準(zhǔn)品）校準(zhǔn)品）2.2. 單個(gè)校準(zhǔn)品自動(dòng)稀釋后校準(zhǔn)單個(gè)校準(zhǔn)品自動(dòng)稀釋后校準(zhǔn) 加樣精度問(wèn)題加樣精度問(wèn)題3.3. 比色杯或光源燈老化比色杯或光源燈老化4.4. 污染的或蒸發(fā)濃縮的校準(zhǔn)品污染的或蒸發(fā)濃縮的校準(zhǔn)品5.5. 混勻機(jī)構(gòu)問(wèn)題混勻機(jī)構(gòu)問(wèn)題Duplicate limit :重復(fù)性限制 檢查同一個(gè)校準(zhǔn)品的兩次吸光度差異Abs1 - Ab2 校準(zhǔn)的時(shí)候,每個(gè)校準(zhǔn)品會(huì)重復(fù)做兩次進(jìn)行計(jì)算原因：如果是新試劑，檢查試劑復(fù)溶及混勻情況檢查樣品針和試劑針.樣品或試劑上有氣泡光源燈或比色杯老化混勻不佳Sensi

10、tivity limit(Sensitivity limit(靈敏度靈敏度限制限制) ) 該數(shù)值標(biāo)識(shí)出空白和該數(shù)值標(biāo)識(shí)出空白和 c.f.a.sc.f.a.s之間的單位濃度吸光度變之間的單位濃度吸光度變化差異的最大值和最小值化差異的最大值和最小值 . . 在終點(diǎn)法的生化項(xiàng)目校準(zhǔn)中，最小吸光度變化是必須檢測(cè)在終點(diǎn)法的生化項(xiàng)目校準(zhǔn)中，最小吸光度變化是必須檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn) Sen:Sen:Sensitivity limit(Sensitivity limit(靈敏度限制靈敏度限制):):常見(jiàn)校準(zhǔn)校常見(jiàn)校準(zhǔn)校準(zhǔn)失敗的原因準(zhǔn)失敗的原因1.1. 錯(cuò)誤的校準(zhǔn)品錯(cuò)誤的校準(zhǔn)品 蒸發(fā)濃縮或配制錯(cuò)誤蒸發(fā)濃縮或配制錯(cuò)誤

11、2.2. 舊的或污染的試劑舊的或污染的試劑3.3. 污染的空白校準(zhǔn)品污染的空白校準(zhǔn)品空白和CFAS校準(zhǔn)品的測(cè)得的吸光度值過(guò)于接近校準(zhǔn)失敗校準(zhǔn)失敗校準(zhǔn)液校準(zhǔn)液（1 1）吸光度）吸光度Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance S1 Abs S1 Abs 用于檢查用于檢查線性或非線性線性或非線性校準(zhǔn)。校準(zhǔn)。報(bào)警用于指示第一點(diǎn)校準(zhǔn)品吸光度是否超出范圍。報(bào)警用于指示第一點(diǎn)校準(zhǔn)品吸光度是否超出范圍。S1 AbsS1 Abs定義校準(zhǔn)品定義校準(zhǔn)品1 1水平的上限和下限。水平的上限和下限。用于檢測(cè)試劑空白用于檢測(cè)試劑空白。校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)報(bào)警DUPSENS1 Abs L

12、imitCalib. Limit常見(jiàn)報(bào)警類型常見(jiàn)報(bào)警類型潛在原因潛在原因Duplicate LimitDuplicate Limit加樣不準(zhǔn)加樣不準(zhǔn) ( (樣本、試劑樣本、試劑) )，攪拌，攪拌 (P)(P)，反應(yīng)杯，反應(yīng)杯光源老舊，環(huán)境，光源老舊，環(huán)境， 電壓電壓Sensitivity LimitSensitivity Limit校準(zhǔn)品、水點(diǎn)污染，試劑，校準(zhǔn)品單位更改校準(zhǔn)品、水點(diǎn)污染，試劑，校準(zhǔn)品單位更改未更改數(shù)值未更改數(shù)值Calibration LimitCalibration Limitcfascfas和水空白，加樣不準(zhǔn)，系統(tǒng)水，光源燈和水空白，加樣不準(zhǔn)，系統(tǒng)水，光源燈Standard

13、Deviation Standard Deviation LimitLimit不正確的加樣順序，光路，針不正確的加樣順序，光路，針( (加樣不精確加樣不精確) )Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance 水質(zhì)，試劑，光源水質(zhì)，試劑，光源Standard ErrorStandard Error儀器，反應(yīng)過(guò)程，其它校準(zhǔn)報(bào)警儀器，反應(yīng)過(guò)程，其它校準(zhǔn)報(bào)警造成生化校準(zhǔn)報(bào)警的潛在可能原因造成生化校準(zhǔn)報(bào)警的潛在可能原因校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)報(bào)警校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)曲線Duplicate LimitDuplicate Limit重復(fù)性限制重復(fù)性限制不

14、更新不更新Sensitivity LimitSensitivity Limit靈敏度限制靈敏度限制不更新不更新Calibration LimitCalibration Limit校準(zhǔn)限制校準(zhǔn)限制更新更新Standard Deviation Standard Deviation LimitLimit標(biāo)準(zhǔn)差限制標(biāo)準(zhǔn)差限制可能更新可能更新Standard 1 Absorbance Standard 1 Absorbance Std1Std1吸光度吸光度不更新不更新Standard ErrorStandard Error標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤伴隨標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤伴隨不更新不更新如果校準(zhǔn)失敗，系統(tǒng)將自動(dòng)使用之前有效的校準(zhǔn)曲線

15、計(jì)算標(biāo)本濃度。如果校準(zhǔn)失敗，系統(tǒng)將自動(dòng)使用之前有效的校準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本濃度。生化項(xiàng)目檢測(cè)常用顯色指示系統(tǒng)1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系統(tǒng)2，p-NP（磷酸對(duì)硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系統(tǒng) 3，H2O2偶聯(lián)的指示系統(tǒng) 4，抗原抗體反應(yīng)指示系統(tǒng)，免疫比濁法 5，其它顯色反應(yīng) 1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系統(tǒng)：反應(yīng)原理 ： NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征性吸收峰，而 NAD+和 NADP+在 340nm無(wú)特征性吸收峰，利用其偶聯(lián)的脫氫酶(工具酶)反應(yīng)，根據(jù) 340nm 吸光度的變化，可以測(cè)定物質(zhì)的濃度或 活性。 臨床項(xiàng)目：ALT、A

16、ST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH 、 Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+ 、CO2 等 1.5.2.2. 舉例說(shuō)明ALT的測(cè)定原理（IFCC） 試劑成分和反應(yīng)公式： R1： NADH 、乳酸脫氫酶（LDH）； R2： L-丙氨酸 、-酮戊二酸 。 原理：NADH 的減少，引起 340nm 吸光度的下降，下降速率與 ALT 活性成正比(酶動(dòng)力學(xué)法)。2，p-NP（磷酸對(duì)硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系統(tǒng) 反應(yīng)原理： p-NP 和 p-NA 在 405nm 有特征性吸收峰，根據(jù) 405nm 吸光度的變化，可以測(cè)定物質(zhì)的濃 度或活。臨床項(xiàng)目： ALP、ACP、r-GT、AMY

17、 等。 舉例說(shuō)明 ：ALP的測(cè)定原理（IFCC） 試劑成分和反應(yīng)公式。R1：AMP 緩沖液，鎂離子，鋅離子，PH10.44； R2：對(duì)硝基苯磷酸，防腐劑，PH8.5 原理：在鎂離子和鋅離子的存在下，堿性磷酸酶解離對(duì)硝基苯磷酸形成磷酸鹽和對(duì)硝基苯酚， 引起 405nm 吸光度的上升，上升速率與 ALP 活性成正比（動(dòng)力學(xué)法）。 3，H2O2偶聯(lián)的指示系統(tǒng) 反應(yīng)原理： H2O2在過(guò)氧化物酶的作用下，可使單一個(gè)或成對(duì)的無(wú)色的色素原氧化成有色的色素，導(dǎo)致某 一波長(zhǎng)吸光度的增加，因此可用來(lái)測(cè)定物質(zhì)的濃度或活性。 臨床項(xiàng)目：過(guò)氧化物酶法CHOL，GLU舉例說(shuō)明: GLU 過(guò)氧化物酶法的測(cè)定原理R1：4-氨

18、基安替吡啉 、抗壞血酸氧化酶 R2：葡萄糖氧化酶（GOD）、過(guò)氧化物酶（PO D）、酚 。 測(cè)定原理：醌亞胺的生成，導(dǎo)致 500nm 吸光度的增加，增加的程度與 Glu 的含量成正比。4，抗原抗體反應(yīng)指示系統(tǒng)，免疫比濁法 反應(yīng)原理：特異性抗體與抗原(待測(cè)物質(zhì))在相應(yīng)的緩沖環(huán)境下反應(yīng)生成抗原抗體復(fù)合物，形成一定的濁 度，導(dǎo)致特定波長(zhǎng)透光率的改變。在抗體過(guò)剩的前提下，改變程度與抗原濃度成正比。 臨床項(xiàng)目： apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、 C4、CRP 等。 5，其它顯色反應(yīng)TP 的反應(yīng)原理 ：蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，導(dǎo)致 540n

19、m 吸光度的增 加，增加的程度與蛋白質(zhì)的含量成正比。 ALB 的反應(yīng)原理： 在 pH4.2 環(huán)境中，溴甲酚綠在有非離子去垢劑聚氧乙烯月桂存在時(shí)，可與白蛋白形成藍(lán)綠色復(fù)合物，導(dǎo)致 630nm 吸光度的增加，增加的程度與白蛋白的含量成正比。 其它的顯色反應(yīng)還有 Ca 和 Mg 等物質(zhì)的測(cè)量方法， c 701c 702c 502/501應(yīng)用數(shù) 光度200200200 計(jì)算檢測(cè)888 血清指數(shù)333分析通量（最大）2000 個(gè)測(cè)試/小時(shí)2000 個(gè)測(cè)試/小時(shí)600 個(gè)測(cè)試/小時(shí)反應(yīng)體積100-250 L100-250 L100-250 L反應(yīng)溫度（孵育池）37 0.1C37 0.1C37 0.1C反應(yīng)

20、杯406 池（14 區(qū)域）406 池（14 區(qū)域）160 池（8 區(qū)域）反應(yīng)時(shí)間1-分鐘步驟中 3-10 分鐘 1-分鐘步驟中 3-10 分鐘1-分鐘步驟中 3-10 分鐘移液循環(huán)1.8 s1.8 s6 s復(fù)合方法非接觸超聲混合非接觸超聲混合非接觸超聲混合表 9-3 反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng) c 701c 702c 502/501試劑盒類型 cobas c 大容量試劑盒 cobas c pack MULTI 大容量試劑盒 cobas c 大容量試劑盒 cobas c pack MULTI 大容量試劑盒 cobas c 中等容量試劑盒 cobas c pack MULTI 中等容量試劑盒試劑加載/卸載手

21、動(dòng)自動(dòng)（試劑管理站進(jìn)行） 自動(dòng)試劑識(shí)別自動(dòng)（RFID）試劑管理站中自動(dòng)（RFID）自動(dòng)（條碼） 最大量試劑盒7070 （試劑管理站中附加 10 個(gè)） 60 試劑冷卻（試劑盤(pán)中）5-155-155-12試劑緩沖轉(zhuǎn)子容量-10 個(gè)試劑盒-試劑卸載托盤(pán)容量-12 個(gè)試劑盒10 個(gè)試劑盒試劑移液時(shí)間安排（最多使用 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)）R1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.6 sR2：113.4 sR3：307.8 sR1：3.2 sR2：90.2 sR3：300.2 s試劑移液量5-180 L、增加幅度為 1 L（5-19 L：+ 20 L 水）質(zhì)控品剩余試劑體積移液 LLD 與

22、自動(dòng)檢測(cè)讀數(shù)移液 LLD 與自動(dòng)檢測(cè)讀數(shù)表 9-4 試劑系統(tǒng)試劑系統(tǒng) c 701c 702c 502/501樣品類型 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 其他 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 其他 血清血漿 尿 腦脊液 上清液 全血 其他樣品移液量1.5-35L，每次增加0.1L樣品堵塞探測(cè)壓力靈敏式凝塊探測(cè)系統(tǒng)液面?zhèn)鞲衅麟娙輦鞲屑夹g(shù)表 9-5 取樣系統(tǒng)取樣系統(tǒng) c 701c 702c 502光源鹵素?zé)簦?2 V / 50W光度計(jì)多波長(zhǎng)分光光度計(jì)波長(zhǎng)12種波長(zhǎng)可供選擇：340，376，415，450，480，505，546，570，600，660，700，800 nm光路長(zhǎng)度5.6 mm光程吸光度0.0000-3.3000線性吸光度不高于2.5光模式單色光和雙色光光度測(cè)定系統(tǒng)光度測(cè)定分析的流程1清洗反應(yīng)杯啟動(dòng)后，機(jī)械部件將重設(shè)并回位。儀器開(kāi)始進(jìn)行反應(yīng)池沖洗。反應(yīng)盤(pán)持續(xù)旋轉(zhuǎn)。沖洗噴嘴 A 從反應(yīng)池吸取反應(yīng)混合物。數(shù)個(gè)循環(huán)后，通過(guò)沖洗噴嘴 B/C，使用去離子水對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行清洗。下一步，使用 CellCln 1，于沖洗臂中，通過(guò)噴嘴 D/E 對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行清洗。使用CellCln 2，于沖洗臂中，通過(guò)噴嘴 F