薄層色譜法分離鑒定葉綠素

1、1/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素實驗實驗122 122 薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素122.1 122.1 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?(1) (1) 掌握有機溶劑提取天然產(chǎn)物的原理和操作方法。掌握有機溶劑提取天然產(chǎn)物的原理和操作方法。 (2) (2) 掌握薄層色譜法分離原理和實驗技術(shù)。掌握薄層色譜法分離原理和實驗技術(shù)。2/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素122.2 122.2 實驗原理實驗

2、原理 植物葉片中的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，植物葉片中的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素主要包括葉綠素a a、葉綠素、葉綠素b b、-胡蘿卜素及葉黃素等四胡蘿卜素及葉黃素等四種。種。 葉綠體色素是脂溶性色素，植物葉綠體色素通常可用葉綠體色素是脂溶性色素，植物葉綠體色素通常可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。乙醇、丙酮等有機溶劑提取。在波長在波長662 nm662 nm、644 nm644 nm測定測定吸光值，可根據(jù)公式計算葉綠素吸光值，可根據(jù)公式計算葉綠素a a和葉綠素和葉綠素b b的含量。的含量。通過通過薄層色譜薄層色譜(TLC)(TLC)對葉綠體色素提取液進一步分離，

3、可分離對葉綠體色素提取液進一步分離，可分離葉綠素葉綠素a a、葉綠素、葉綠素b b、-胡蘿卜素及去鎂葉綠素，經(jīng)多次胡蘿卜素及去鎂葉綠素，經(jīng)多次制備可得少量葉綠素純品，并進行光譜表征。制備可得少量葉綠素純品，并進行光譜表征。3/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素122.3 122.3 實驗步驟實驗步驟1. 1. 大葉黃楊葉片預(yù)處理：大葉黃楊葉片預(yù)處理：2. 2. 葉綠體色素的提取：葉綠體色素的提?。?稱取稱取1 1 g g預(yù)處理過的大預(yù)處理過的大葉黃楊葉片葉黃楊葉片 邊加入提取劑邊加入提取劑 邊快速邊快

4、速研磨葉片研磨葉片 量取量取30 mL30 mL提取劑提取劑( (95%95%乙醇乙醇) )研磨約研磨約10 min 10 min 通風(fēng)櫥中通風(fēng)櫥中 用不銹鋼網(wǎng)用不銹鋼網(wǎng)濾去殘渣濾去殘渣 得到提取液得到提取液 剪細碎剪細碎 置于研缽置于研缽 采集新鮮成熟大葉采集新鮮成熟大葉黃楊葉若干黃楊葉若干 投入沸水中投入沸水中 不斷攪拌不斷攪拌30 s 30 s 涼水中冷卻涼水中冷卻 迅速撈起迅速撈起分批分批用濾紙吸干葉片表面水分用濾紙吸干葉片表面水分 清水洗凈清水洗凈4/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素(1)

5、(1)提取液的粗提純：提取液的粗提純：(2)(2)提取液的進一步提純：提取液的進一步提純：粗提純的粗提純的提取液提取液 離心管離心管 用保鮮膜用保鮮膜蓋住管口蓋住管口 1000 rad/min1000 rad/min轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速離心離心10 min 10 min 取其上層清取其上層清液避光保存液避光保存較純的色素較純的色素提取液提取液轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入25 25 mLmL容量瓶中容量瓶中用石油醚用石油醚定容定容測量其在測量其在662 nm662 nm、644 nm644 nm的吸光值的吸光值 0.5 cm 0.5 cm 比色皿比色皿 分液漏斗分液漏斗15 mL15 mL石油醚石油醚上步的提取液上步的提取液

6、靜置靜置30s 30s 5 mL5 mL飽和食鹽水飽和食鹽水15 mL15 mL蒸餾水蒸餾水 分層分層 分去分去 下部水層下部水層5 mL5 mL飽和食鹽水飽和食鹽水分去分去 下部水層下部水層轉(zhuǎn)入棕色瓶轉(zhuǎn)入棕色瓶中保存中保存 提取液提取液 得到得到15 mL15 mL蒸餾水蒸餾水5/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素 硅膠硅膠G G薄層薄層板活化板活化 硅膠硅膠G G薄薄層板層板100100120 120 烘箱烘箱 烘烘303060 min 60 min 干燥箱中干燥箱中保存保存 (2) (2) 點樣

7、點樣 取硅膠取硅膠G G薄層板薄層板 板一側(cè)距底邊板一側(cè)距底邊1.5 cm1.5 cm處畫處畫一條橫線作為起點線一條橫線作為起點線 起點線以上起點線以上12 cm12 cm處畫一處畫一條橫線作為終點線條橫線作為終點線 用干燥干凈的用干燥干凈的玻璃毛細管在玻璃毛細管在起點線處點樣起點線處點樣 晾干晾干 溶劑揮發(fā)后輕觸溶劑揮發(fā)后輕觸6 67 7次次 斑點直徑盡量小斑點直徑盡量小 3. 3. 葉綠體色素的分離葉綠體色素的分離: : (1) (1) 硅膠硅膠G G薄層板活化及層析液的制備：薄層板活化及層析液的制備：層析液的層析液的制備制備 層析缸層析缸 10 mL10 mL丙酮丙酮石油醚石油醚輕輕輕輕

8、振蕩振蕩蓋上層蓋上層析缸蓋析缸蓋靜置靜置 101015 min15 min(2(23)3)層析液層析液6/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素(3)(3) 展開：展開：(4)(4) 鑒定：鑒定：液面不能液面不能 超超過點樣線過點樣線 點好樣的點好樣的硅膠玻片硅膠玻片 層析缸層析缸 蓋好蓋子蓋好蓋子 進行上行層析進行上行層析 待展開劑上升到終點線待展開劑上升到終點線附近時附近時( (約約202030 min) 30 min) 取出并在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干取出并在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干 要盡可能多地分要盡可能多地分離葉片各種

9、色素離葉片各種色素觀察各斑點的顏色觀察各斑點的顏色 計算比移值計算比移值R Rf f Rf =樣品中某組分移動離開原點的距離樣品中某組分移動離開原點的距離展開劑前沿距原點中心的距離展開劑前沿距原點中心的距離7/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素4. 4. 葉綠體色素的光譜表征：葉綠體色素的光譜表征：將層析板上分開的將層析板上分開的葉綠素葉綠素a a和葉綠素和葉綠素b b的色帶的色帶 分別用干凈刮刀分別用干凈刮刀 刮入試管刮入試管 5 5 mLmL 80% 80%丙酮溶液丙酮溶液 通過紫外可見光譜法通過

10、紫外可見光譜法 進行定性鑒定進行定性鑒定 提取提取 橙黃色橙黃色-胡蘿卜素胡蘿卜素灰色的去鎂葉綠素灰色的去鎂葉綠素藍綠色的葉綠素藍綠色的葉綠素a a黃綠色的葉綠素黃綠色的葉綠素b b自上而下自上而下8/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素122.4 122.4 注意事項注意事項 (1) (1) 研磨葉片時要將其盡量剪碎，使葉片得到充分研磨葉片時要將其盡量剪碎，使葉片得到充分研磨；研磨至葉片發(fā)白為止。研磨；研磨至葉片發(fā)白為止。 (2) (2) 層析液倒入層析缸后，蓋上蓋子，讓其氣相飽層析液倒入層析缸后，蓋

11、上蓋子，讓其氣相飽和和10 min10 min以上，否則分離效果不佳。以上，否則分離效果不佳。 (3) (3) 薄層色譜點樣時，盡量使斑點小，直徑不超過薄層色譜點樣時，盡量使斑點小，直徑不超過5 5 mmmm，若斑點顏色較淺，可反復(fù)點直至其呈深綠色。，若斑點顏色較淺，可反復(fù)點直至其呈深綠色。 (4) (4) 大葉黃楊葉薄層色譜分離一般可得橙黃色大葉黃楊葉薄層色譜分離一般可得橙黃色-胡胡蘿卜素、灰色的去鎂葉綠素、藍綠色的葉綠素蘿卜素、灰色的去鎂葉綠素、藍綠色的葉綠素a a及黃綠色及黃綠色的葉綠素的葉綠素b b色帶。色帶。9/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗

12、技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素122.5 122.5 問題討論問題討論 (1) (1) 綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？含有哪些化合物？ (2) (2) 薄層色譜分離色素原理是什么？薄層色譜分離色素原理是什么？ (3) (3) 試比較葉綠素試比較葉綠素a a、葉綠素、葉綠素b b和和-胡蘿卜素的極性，胡蘿卜素的極性，為什么為什么-胡蘿卜素在薄層板上移動最快？胡蘿卜素在薄層板上移動最快？10/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分

13、離鑒定葉綠素122.6 122.6 參考答案參考答案 (1) (1) 綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？含有哪些化合物？ 答：色素主要成分有脂溶性和水溶性色素，脂溶性答：色素主要成分有脂溶性和水溶性色素，脂溶性色素主要為葉綠素與類胡蘿卜色素主要為葉綠素與類胡蘿卜素，水溶性色素主要為花素，水溶性色素主要為花色甙類，又稱花青素。提取液可能含脂溶性色素。色甙類，又稱花青素。提取液可能含脂溶性色素。11/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層色譜法分離鑒定葉綠素薄層色譜法分離鑒定葉綠素 (2) (2) 薄層色譜分離色素原理是什么？薄層色譜分離色素原理是什么？ 答：答：薄層色譜分離色素原理是利用不同色素在各種薄層色譜分離色素原理是利用不同色素在各種有機溶劑中的分配系數(shù)或在吸附有機溶劑中的分配系數(shù)或在吸附劑上的吸附能力的不同，劑上的吸附能力的不同，當它們通過薄層板時，這種分配或吸附過程反復(fù)多次當它們通過薄層板時，這種分配或吸附過程反復(fù)多次 地進行，最后將它們一一分離開來。地進行，最后將它們一一分離開來。12/12在線答疑：在線答疑：wy- wy- 大大學(xué)學(xué)通通用用化化學(xué)學(xué)實實驗驗技技術(shù)術(shù)薄層