骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)PPT課件

1、2021/6/71全骨髓貼壁接觸培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目22021/6/7主要內(nèi)容主要內(nèi)容32021/6/7前言前言v 近來研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)不但具有來源廣泛、易于獲取、增殖迅速、可自體移植、體外基因轉(zhuǎn)染率高等特點(diǎn)，而且在不同誘導(dǎo)劑培養(yǎng)下可分別誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞及肝細(xì)胞等已成為適合組織和細(xì)胞移植的種子細(xì)胞，以及基因治療的理想靶細(xì)胞。但在骨髓中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含量極低，僅占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%-0.1%，如何為組織和細(xì)胞移植

2、及基因治療提供數(shù)量充足、活性良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。v 依據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)塑料培養(yǎng)瓶具有黏附貼壁特性，實(shí)驗(yàn)采用貼壁法，建立一套簡(jiǎn)單、快速、有效的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、增殖和純化方法，觀察其生長(zhǎng)形態(tài)和生物學(xué)特性，驗(yàn)證其向成骨、成軟骨、成脂分化能力，為進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植、基因治療及組織工程奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。42021/6/7實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法v1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離及傳代及傳代培養(yǎng)培養(yǎng)v2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察v3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制v4

3、、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定v5、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化52021/6/7骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離及傳代及傳代培養(yǎng)培養(yǎng)v 10%水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死，大鼠全身浸水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)頸椎脫臼處死，大鼠全身浸泡于體積分?jǐn)?shù)為泡于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒乙醇消毒30 min，于超凈臺(tái)無菌，于超凈臺(tái)無菌操作下取其雙側(cè)股骨與脛骨，操作下取其雙側(cè)股骨與脛骨，PBS沖洗，剪去骨兩端干沖洗，剪去骨兩端干骺端，用骺端，用10 mL注射器吸取注射器吸取LG-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集

4、經(jīng)細(xì)胞篩過濾后的細(xì)胞懸液，以骨髓腔，收集經(jīng)細(xì)胞篩過濾后的細(xì)胞懸液，以1 000 r/min離心離心5 min。棄上清，以。棄上清，以 1109 L-1的細(xì)胞濃的細(xì)胞濃度接種于度接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，置于塑料培養(yǎng)瓶，置于37、體積分?jǐn)?shù)為、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后全量換液，后全量換液，2，5 d分別半量換液，分別半量換液，7 d全量換液全量換液。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞分裂增殖分裂增殖80%-90%匯合單層時(shí)用匯合單層時(shí)用1.5 mL Trypsin-EDTA解離細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞充分離散時(shí)，加入解離細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞充分離散時(shí)，加入5 mL

5、的含血的含血清培養(yǎng)基終止消化，離心細(xì)胞懸液，清培養(yǎng)基終止消化，離心細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心離心5 min。棄上清，加入含體積分?jǐn)?shù)為。棄上清，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基，將重懸的細(xì)胞懸液以培養(yǎng)基，將重懸的細(xì)胞懸液以1 2比例進(jìn)行比例進(jìn)行傳代。傳代。62021/6/7骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察v 取原代和第取原代和第8代細(xì)胞，每日用倒置相差顯微鏡代細(xì)胞，每日用倒置相差顯微鏡觀察其生長(zhǎng)形態(tài)及特征并照相記錄。取生長(zhǎng)良好觀察其生長(zhǎng)形態(tài)及特征并照相記錄。取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞于含的細(xì)胞于含10%二甲基亞砜的血清中凍存，二甲基亞砜的血清

6、中凍存，2周周后復(fù)蘇，錐蟲藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)死亡及存活細(xì)胞，后復(fù)蘇，錐蟲藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)死亡及存活細(xì)胞，繼續(xù)于繼續(xù)于37 ，體積分?jǐn)?shù)為，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。養(yǎng)。72021/6/7骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制v 取第取第1，3代細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，以代細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，以5104個(gè)個(gè)/孔接種于孔接種于96孔板，每孔加入孔板，每孔加入10 L CCK-8溶液，溶液，37 ，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。然后在檢測(cè)第波長(zhǎng)下

7、檢測(cè)吸光度值。然后在檢測(cè)第1，2，3，4，5，6，7天同一時(shí)間作相同檢測(cè)。天同一時(shí)間作相同檢測(cè)。根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線。根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線。82021/6/7骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定v取融合至取融合至90%左右生長(zhǎng)狀態(tài)良好第左右生長(zhǎng)狀態(tài)良好第3代骨髓代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，胰蛋白酶消化、室溫離心、細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞，胰蛋白酶消化、室溫離心、細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整待測(cè)樣本細(xì)胞數(shù)為計(jì)數(shù)，調(diào)整待測(cè)樣本細(xì)胞數(shù)為1109 L-1，分，分裝至各裝至各PE管中，依次加入單克隆抗體管中，依次加入單克隆抗體CD44、CD29、CD90、CD45、CD34、CD11b，每，每

8、管設(shè)立同型陰性對(duì)照組管設(shè)立同型陰性對(duì)照組(對(duì)照組中不加任何抗體對(duì)照組中不加任何抗體)。常溫避光孵育常溫避光孵育40 min，PBS沖洗細(xì)胞，細(xì)胞重沖洗細(xì)胞，細(xì)胞重懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。懸，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。92021/6/7骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化v 取生長(zhǎng)良好的第取生長(zhǎng)良好的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5107 L-1接種于接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至合至70%-80%時(shí)，向各誘導(dǎo)孔中分別加入成時(shí)，向各誘導(dǎo)孔中分別加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑(含地塞米松、含地塞米松、-甘油磷酸鈉、維甘油磷酸鈉、維生素

9、生素C-2磷酸鈉磷酸鈉)，成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑，成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑(含地塞米含地塞米松、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子松、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、維生素、維生素C)，成脂細(xì)胞誘導(dǎo)，成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑劑(含地塞米松、胰島素、吲哚美辛含地塞米松、胰島素、吲哚美辛)。各誘導(dǎo)孔。各誘導(dǎo)孔定期換液，以未經(jīng)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)定期換液，以未經(jīng)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)孔作為對(duì)照?？鬃鳛閷?duì)照。102021/6/7結(jié)果結(jié)果 剛接種于培養(yǎng)瓶的骨髓細(xì)胞大多數(shù)懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞呈圓形，大小不一。接種24 h后開始貼壁，通過更換培養(yǎng)液，去除懸浮未貼壁細(xì)胞，48 h后貼壁細(xì)胞逐漸伸展為梭形、多角形、不規(guī)則圓形，排列不規(guī)則(圖1A)。7 d后，貼壁細(xì)

10、胞顯著增多，以小圓形和梭形細(xì)胞為多，部分細(xì)胞排列趨于平行，部分成旋渦狀生長(zhǎng)(圖1B)。第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)較原代細(xì)胞快，以梭形細(xì)胞為主(圖1C)。細(xì)胞傳代至第8代，細(xì)胞增殖活力未見明顯變化，主要以大而鋪展的多形細(xì)胞為主(圖1D)。112021/6/7v流式細(xì)胞儀檢測(cè)第流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表dm 標(biāo)記物的表達(dá)，結(jié)果顯示：細(xì)胞均一標(biāo)記物的表達(dá)，結(jié)果顯示：細(xì)胞均一表達(dá)表達(dá)CD44、CD29、CD90，陽性率分別為，陽性率分別為99.69%、83.99%、95.05%，而，而CD45、CD34、CD11b/c則呈陰性表達(dá)，分別為則呈陰性表達(dá)，分別為0.28%，

11、0.62%，4.25%(圖圖2)。122021/6/7v 經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)11 d后，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，后，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)(圖圖3B)；經(jīng)堿性磷酸酶染色可見細(xì)胞外基；經(jīng)堿性磷酸酶染色可見細(xì)胞外基質(zhì)有大量紫褐色沉淀，呈強(qiáng)陽性表達(dá)質(zhì)有大量紫褐色沉淀，呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖圖3C)；經(jīng)；經(jīng)vonkossa礦化染色可見礦化染色可見細(xì)胞聚集處有黑色固塊，島狀分布，呈

12、強(qiáng)陽性表達(dá)細(xì)胞聚集處有黑色固塊，島狀分布，呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖圖3D)。骨髓間充質(zhì)干。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑培養(yǎng)21 d后，誘導(dǎo)而成的軟骨細(xì)胞變大、變圓，表后，誘導(dǎo)而成的軟骨細(xì)胞變大、變圓，表面變的光滑，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，可見胞質(zhì)呈藍(lán)色面變的光滑，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，可見胞質(zhì)呈藍(lán)色(圖圖3E)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)19 d后，誘導(dǎo)而成的脂肪細(xì)胞脂質(zhì)累積，脂滴數(shù)量增加并后，誘導(dǎo)而成的脂肪細(xì)胞脂質(zhì)累積，脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形、多邊形，經(jīng)油紅相互融合，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形、多邊形，經(jīng)油紅O染色顯示許多細(xì)胞的染色顯示許多細(xì)胞的胞漿內(nèi)有大量脂質(zhì)沉淀胞漿內(nèi)有大量脂質(zhì)沉淀(圖圖3F)。132021/6/7結(jié)論結(jié)論v 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，體外分離培養(yǎng)的上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，體外分離培養(yǎng)的SD大鼠大鼠骨髓細(xì)胞為純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞而非其骨髓細(xì)胞為純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞而非其他造血譜系干細(xì)胞，并建立了一套簡(jiǎn)單、有效、他造血譜系干細(xì)胞，并建立了一套簡(jiǎn)單、有效、獲得純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、增獲得純度較高的骨髓間充