生物工程下游技術(shù)第五章細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離

1、第二篇第二篇 目標(biāo)產(chǎn)品的分離與純化目標(biāo)產(chǎn)品的分離與純化第五章第五章 細(xì)胞破碎、蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離細(xì)胞破碎、蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎固液分離固液分離初級(jí)分離初級(jí)分離( (粗粗) )純化精制純化精制 下游技術(shù)基本過程下游技術(shù)基本過程下游加工技術(shù)的重要性下游加工技術(shù)的重要性 1.1.產(chǎn)品分離純化是最終獲得商業(yè)產(chǎn)品分離純化是最終獲得商業(yè)產(chǎn)品的環(huán)節(jié)。產(chǎn)品的環(huán)節(jié)。 2.2.投資費(fèi)用高（抗生素、乙醇、投資費(fèi)用高（抗生素、乙醇、檸檬酸占檸檬酸占60%60%）。）。 3.3.分離純化技術(shù)落后會(huì)阻礙發(fā)酵分離純化技術(shù)落后會(huì)阻礙發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展。工程技術(shù)的發(fā)展。 幾種產(chǎn)品在發(fā)酵液中的濃度幾種產(chǎn)品在發(fā)酵

2、液中的濃度 產(chǎn)品產(chǎn)品 典型濃度（典型濃度（g/Lg/L） 抗生素抗生素 2525 氨基酸氨基酸 100100 酒精酒精 100100 有機(jī)酸有機(jī)酸 100100 酶酶 2020 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 1010下游加工技術(shù)的特點(diǎn)下游加工技術(shù)的特點(diǎn) 1. 1. 發(fā)酵液的復(fù)雜性造成分離上的困難性。發(fā)酵液的復(fù)雜性造成分離上的困難性。 2. 2. 欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定。欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定。 3. 3. 多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定彈性。要求下游加工有一定彈性。 產(chǎn)物提純過程的不同決定于：產(chǎn)物提純過程的不同決定于： 對(duì)象材料、目標(biāo)

3、產(chǎn)物特性及對(duì)對(duì)象材料、目標(biāo)產(chǎn)物特性及對(duì)其純度的要求其純度的要求第一節(jié)第一節(jié) 概述概述基因工程生物制品分離純化基因工程生物制品分離純化: :工程菌經(jīng)過大規(guī)模培養(yǎng)后，工程菌經(jīng)過大規(guī)模培養(yǎng)后，產(chǎn)生的有效成分含量很低，產(chǎn)生的有效成分含量很低，雜質(zhì)含量卻很高雜質(zhì)含量卻很高分離純化分離純化極其重要極其重要基因工程藥物從轉(zhuǎn)化細(xì)基因工程藥物從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、生產(chǎn)，對(duì)產(chǎn)品的純胞、生產(chǎn)，對(duì)產(chǎn)品的純度要求高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。度要求高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。發(fā)酵液發(fā)酵液細(xì)胞分離細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎固液分離固液分離包涵體包涵體細(xì)胞碎片分離細(xì)胞碎片分離變性變性復(fù)性復(fù)性濃縮濃縮 初步分離初步分離 高度純化高度純

4、化 制劑制劑 產(chǎn)品產(chǎn)品 基因工程制品分離純化的一般流程基因工程制品分離純化的一般流程初級(jí)分離初級(jí)分離：分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體（包涵體），復(fù)胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體（包涵體），復(fù)原蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)等原蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)等過程。過程。主要決定產(chǎn)物的得率主要決定產(chǎn)物的得率。純化精制純化精制：初級(jí)分離基礎(chǔ)上，用各種高初級(jí)分離基礎(chǔ)上，用各種高選擇性手段，主要是各種層析技術(shù)，將目選擇性手段，主要是各種層析技術(shù)，將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能分開，使產(chǎn)物的標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到有關(guān)要求。純度達(dá)到有關(guān)要求。主要決定產(chǎn)

5、物的純度主要決定產(chǎn)物的純度。產(chǎn)物提純過程包括兩個(gè)基本階段：產(chǎn)物提純過程包括兩個(gè)基本階段：第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 目的：目的：釋放細(xì)胞內(nèi)含物釋放細(xì)胞內(nèi)含物。 分類：分類：按照是否存在外加作用力分按照是否存在外加作用力分為機(jī)械法和非機(jī)械法。為機(jī)械法和非機(jī)械法。 問題：問題： 破碎率是否越高越好？破碎率是否越高越好？以大腸桿菌為以大腸桿菌為宿主藥物多為宿主藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物破碎方式破碎方式機(jī)械法機(jī)械法固體剪切作用固體剪切作用珠磨法珠磨法壓榨壓榨液體剪切作用液體剪切作用高壓勻漿高壓勻漿超聲破碎超聲破碎非機(jī)械法非機(jī)械法干燥處理干燥處理溶胞作用溶胞作用酶溶法酶溶法化學(xué)法化學(xué)法物理法物理法細(xì)胞

6、破碎方法分類圖細(xì)胞破碎方法分類圖1 1、高壓勻漿法、高壓勻漿法 組成組成：高壓泵和勻漿閥高壓泵和勻漿閥 作用機(jī)理作用機(jī)理：高壓泵將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變高壓泵將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變成勻漿閥柱桿的直線運(yùn)動(dòng)，從高壓室（幾成勻漿閥柱桿的直線運(yùn)動(dòng)，從高壓室（幾十兆帕）壓出細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的十兆帕）壓出細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使撞擊后改變方向從出口管噴出，使細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞經(jīng)歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的形，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。高壓勻漿閥結(jié)構(gòu)示意圖高壓勻漿閥結(jié)構(gòu)示意圖進(jìn)液口進(jìn)液口出液口出液口閥座閥座碰撞環(huán)碰撞環(huán)

7、閥桿閥桿高壓勻漿器高壓勻漿器19.6-25.4MPa 適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎高壓勻漿法動(dòng)力學(xué)方程高壓勻漿法動(dòng)力學(xué)方程 破碎效率與勻破碎效率與勻漿閥結(jié)構(gòu)、操作壓力和破碎次數(shù)漿閥結(jié)構(gòu)、操作壓力和破碎次數(shù)有關(guān)：有關(guān)：LnLn( (R Rm m/(/(R Rm m-R)=-R)=KNPKNPa aR R：單位生物量釋放出的產(chǎn)物量（：單位生物量釋放出的產(chǎn)物量（mg/G)mg/G)R Rm m：R R的最大值；的最大值；K K：破碎速率常數(shù)；：破碎速率常數(shù)；N N：破碎次數(shù)；：破碎次數(shù)；P P：操作壓力；：操作壓力；a:a:與微生物性質(zhì)有關(guān)的指數(shù)系數(shù)。與微生物性質(zhì)

8、有關(guān)的指數(shù)系數(shù)。 破碎率破碎率-操作壓力操作壓力-溫度控制溫度控制-能耗能耗溫度對(duì)活性物質(zhì)的失活作用溫度對(duì)活性物質(zhì)的失活作用提高壓力需增加能耗：提高壓力需增加能耗：3.5KW/100MPa3.5KW/100MPa移走熱量需付出代價(jià)：移走熱量需付出代價(jià)：23.8/100MPa23.8/100MPa高壓勻漿一般需多級(jí)操作，每次循環(huán)前往往進(jìn)行級(jí)間冷卻高壓勻漿一般需多級(jí)操作，每次循環(huán)前往往進(jìn)行級(jí)間冷卻勻漿過程中產(chǎn)生的熱勻漿過程中產(chǎn)生的熱蛋白質(zhì)和酶的失活蛋白質(zhì)和酶的失活溫控和能耗溫控和能耗 堵塞（不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌），質(zhì)地堵塞（不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌），質(zhì)地堅(jiān)硬者如包含體易損傷勻漿閥，也不適用堅(jiān)硬者

9、如包含體易損傷勻漿閥，也不適用 溫度高易失活，能耗大。溫度高易失活，能耗大。存在的問題存在的問題2 2、高速珠磨法、高速珠磨法 原理原理：細(xì)胞和極細(xì)的研磨劑在攪拌槳細(xì)胞和極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與作用下充分混合，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間互相細(xì)胞之間互相剪切、碰撞剪切、碰撞，促使細(xì)胞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放內(nèi)含物。壁破裂，釋放內(nèi)含物。幾種常見珠磨器幾種常見珠磨器動(dòng)力學(xué)方程動(dòng)力學(xué)方程 間歇操作間歇操作: :Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=Ln(D)=Kt-R)=Ln(D)=Kt 其中，其中，D=(1+KD=(1+K1 1 /j)/j)j j 連續(xù)操作：連續(xù)操

10、作：Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=KV/f=K-R)=KV/f=K上式中，上式中，t t是破碎時(shí)間；是破碎時(shí)間；K K、K K1 1、KK是破碎速是破碎速度常數(shù)；度常數(shù)；V V是破碎室內(nèi)懸浮液的體積；是破碎室內(nèi)懸浮液的體積；f f是是進(jìn)料速度；進(jìn)料速度； 是平均停留時(shí)間；是平均停留時(shí)間；j j是破碎時(shí)是破碎時(shí)全混釜的數(shù)目，反映破碎室內(nèi)懸浮液的流全混釜的數(shù)目，反映破碎室內(nèi)懸浮液的流動(dòng)狀況。動(dòng)狀況。 采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控, ,效果較好效果較好; ; 能耗與細(xì)胞破碎率成正比能耗與細(xì)胞破碎率成正比; ; 問題：問題： 高壓勻漿比珠磨法破碎細(xì)胞的效果好？

11、高壓勻漿比珠磨法破碎細(xì)胞的效果好？溫控和能耗溫控和能耗高壓勻漿法與高速珠磨法的比較高壓勻漿法與高速珠磨法的比較項(xiàng)目項(xiàng)目高壓勻漿法高壓勻漿法高速珠磨法高速珠磨法操作參數(shù)操作參數(shù)少少多，液體損耗大多，液體損耗大連續(xù)操作時(shí)連續(xù)操作時(shí)配備熱換器進(jìn)行級(jí)配備熱換器進(jìn)行級(jí)間冷卻間冷卻兼具破碎和冷卻，兼具破碎和冷卻，減少產(chǎn)物失活減少產(chǎn)物失活達(dá)到較高破碎率達(dá)到較高破碎率需循環(huán)需循環(huán)2-42-4次次一次操作一次操作適用范圍適用范圍團(tuán)狀、絲狀真菌、團(tuán)狀、絲狀真菌、較小革蘭陽性菌不較小革蘭陽性菌不宜，包含體不宜宜，包含體不宜幾乎所有的微生物幾乎所有的微生物細(xì)胞，包括含有包細(xì)胞，包括含有包含體的基因工程菌含體的基因工程

12、菌的破壁的破壁X-PressX-Press擠壓機(jī)，把濃縮的細(xì)胞懸液冷卻擠壓機(jī)，把濃縮的細(xì)胞懸液冷卻至至-25-25-30-30，形成冰晶，用，形成冰晶，用500MPa500MPa以上以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥孔中擠的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥孔中擠出，冰晶體磨損和包埋在冰中的細(xì)胞變形出，冰晶體磨損和包埋在冰中的細(xì)胞變形引起細(xì)胞破碎。其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞碎片粉碎程引起細(xì)胞破碎。其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞碎片粉碎程度低，生物活性保持較好。度低，生物活性保持較好。3 3、超聲破碎、超聲破碎 機(jī)理：機(jī)理：聲頻高于聲頻高于151520kHz20kHz的超聲波在高強(qiáng)的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎機(jī)理

13、度聲能輸入時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎機(jī)理尚未清楚，可能與尚未清楚，可能與引起的沖擊波和引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。剪切力有關(guān)。 破碎效率破碎效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。度及菌種類型等因素有關(guān)。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，液量損失少操作簡便，液量損失少 存在問題存在問題：使敏感物質(zhì)變性失活，噪聲大，使敏感物質(zhì)變性失活，噪聲大，大容量時(shí)效率低，應(yīng)用潛力有限。大容量時(shí)效率低，應(yīng)用潛力有限。 空化現(xiàn)象空化現(xiàn)象：在強(qiáng)聲波作用下，引在強(qiáng)聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。錫箔紙測試空化強(qiáng)度與空化密度錫箔紙測試空化強(qiáng)度與

14、空化密度看得到的空化現(xiàn)象看得到的空化現(xiàn)象超聲波破碎儀超聲波破碎儀大功率大功率超聲波破碎儀超聲波破碎儀4 4、化學(xué)滲透法、化學(xué)滲透法 作用機(jī)理作用機(jī)理：某些某些有機(jī)溶劑，抗生素，表有機(jī)溶劑，抗生素，表面活性劑，金屬螯合劑，變性劑面活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學(xué)等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)容物有選擇地滲透出來，這種處理而使內(nèi)容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫方法叫滲透法滲透法。 問題問題：EDTAEDTA、甲苯、甲苯、Triton X-100Triton X-100、鹽、鹽酸胍和脲的作用機(jī)理？酸胍和脲的作用機(jī)理？P70P70EDTAEDT

15、A：破壞細(xì)胞的外層膜：破壞細(xì)胞的外層膜甲苯甲苯：溶解細(xì)胞膜的磷脂層：溶解細(xì)胞膜的磷脂層Triton X-100Triton X-100：溶解內(nèi)膜的雙磷脂層：溶解內(nèi)膜的雙磷脂層鹽酸胍和脲鹽酸胍和脲：削弱溶質(zhì)分子間的疏水：削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液作用，使疏水性化合物溶于水溶液優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)機(jī)械破碎）優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)機(jī)械破碎）： 對(duì)產(chǎn)物釋出有一定的選擇性；對(duì)產(chǎn)物釋出有一定的選擇性； 細(xì)胞保持完整，碎片少，利于進(jìn)一步提?。患?xì)胞保持完整，碎片少，利于進(jìn)一步提取； 核酸釋放量少，黏度低，便于進(jìn)一步分離。核酸釋放量少，黏度低，便于進(jìn)一步分離。缺陷缺陷： 時(shí)間長，效率低；時(shí)間長，效率低； 化學(xué)

16、試劑有毒；化學(xué)試劑有毒； 通用性差通用性差5 5、酶溶法、酶溶法 機(jī)理機(jī)理：利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解。利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解。 常用的溶酶常用的溶酶：溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme)、-1,3-1,3-葡聚葡聚糖酶糖酶(glucanase)(glucanase)、-1-1，6-6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶（protease)protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、肽鏈內(nèi)切、肽鏈內(nèi)切酶（酶（endopeptidase)endopeptidase)、殼多糖酶、殼多糖酶(chitinase)(chitina

17、se)、細(xì)、細(xì)胞壁溶解酶（幾種酶的復(fù)合物）等。胞壁溶解酶（幾種酶的復(fù)合物）等。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 一定的選擇性；一定的選擇性； 細(xì)胞外形完整，核酸釋放少，有利于進(jìn)一細(xì)胞外形完整，核酸釋放少，有利于進(jìn)一步分離過程步分離過程 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：（只能用于實(shí)驗(yàn)室（只能用于實(shí)驗(yàn)室） 產(chǎn)物抑制造成效率低下；產(chǎn)物抑制造成效率低下； 溶酶價(jià)格高；溶酶價(jià)格高； 通用性差，通用性差， 不易確定最佳條件；不易確定最佳條件；6 6、微波加熱法、微波加熱法 機(jī)理機(jī)理：微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，使胞內(nèi)溫度能，產(chǎn)生大量熱量，使胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)

18、水汽化產(chǎn)生的壓迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖裂，形成力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖裂，形成微小孔洞，進(jìn)一步加熱可導(dǎo)致細(xì)微小孔洞，進(jìn)一步加熱可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。收縮，表面出現(xiàn)裂紋。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 微波穿透性強(qiáng)，選擇性高、加熱效率高。微波穿透性強(qiáng)，選擇性高、加熱效率高。 缺陷：缺陷： 一般只適合對(duì)熱穩(wěn)定物質(zhì)的分離；一般只適合對(duì)熱穩(wěn)定物質(zhì)的分離； 被處理的物料要具有良好的吸水性；被處理的物料要具有良好的吸水性； 不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物機(jī)械破碎法與非機(jī)械破碎法的比較機(jī)械破碎法與非機(jī)械破碎法的

19、比較比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目機(jī)械法機(jī)械法非機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理破碎機(jī)理切碎細(xì)胞切碎細(xì)胞溶解局部壁膜溶解局部壁膜碎片大小碎片大小碎片細(xì)小碎片細(xì)小細(xì)胞碎片較大細(xì)胞碎片較大內(nèi)含物釋放內(nèi)含物釋放全部全部部分部分黏度黏度高（核酸多）高（核酸多）低（核酸少）低（核酸少）時(shí)間，效率時(shí)間，效率時(shí)間短，效率高時(shí)間短，效率高時(shí)間長，效率低時(shí)間長，效率低設(shè)備設(shè)備需專用設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備不需專用設(shè)備通用性通用性強(qiáng)強(qiáng)差差經(jīng)濟(jì)經(jīng)濟(jì)成本低成本低成本高成本高應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室范圍實(shí)驗(yàn)室范圍克隆表達(dá)的產(chǎn)物克隆表達(dá)的產(chǎn)物基因工程細(xì)胞基因工程細(xì)胞蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)沒有活性，一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，立體構(gòu)型沒有

20、活性，一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，立體構(gòu)型錯(cuò)誤，無生物學(xué)活性！錯(cuò)誤，無生物學(xué)活性！包涵體包涵體第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。病毒在增殖的過程病毒在增殖的過程中，常使寄主細(xì)胞中，常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)包涵體包涵體SEM of E. coli containing inclusion bodiesSEM of isolated washed inclusion bodies 包含體形成原因包含體形成原因：（比較復(fù)雜，目前尚不完全清楚。）比較復(fù)雜，目前尚不完全清楚。） 缺少某些協(xié)助因子

21、缺少某些協(xié)助因子（分子伴侶？）（分子伴侶？）或或者由于周圍物理環(huán)境（溫度等）不適，者由于周圍物理環(huán)境（溫度等）不適，使其難以連續(xù)進(jìn)行次級(jí)鍵的形成，中間使其難以連續(xù)進(jìn)行次級(jí)鍵的形成，中間產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。 應(yīng)該考慮的事應(yīng)該考慮的事：設(shè)法減少包含體的形成！設(shè)法減少包含體的形成！ 減少包涵體形成的策略減少包涵體形成的策略1、 降低重組菌的生長溫度降低重組菌的生長溫度 降低培養(yǎng)溫降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可

22、減少包涵體的形成。和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。培養(yǎng)培養(yǎng)E.coliE.coli時(shí)添加時(shí)添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖謝糖可以阻止分泌的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在最適濃度可以阻止分泌的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會(huì)影響細(xì)胞的生長、蛋白范圍內(nèi)添加這些添加劑不會(huì)影響細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸，其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的質(zhì)的合成或運(yùn)輸，其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑還有生長添加劑還有乙醇乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的低分子量的巰基或二硫化合物巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，

23、從而影響二硫鍵的形成）和原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaClNaCl。3 3、供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件如供氧、如供氧、pHpH等。等。2 2、添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑 蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)包含體蛋白質(zhì)溶解溶解于于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一部分蛋被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)

24、折疊成具有活性的正確白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一構(gòu)型，這一折疊過程折疊過程稱為稱為蛋白質(zhì)復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)性。如何使包涵體的構(gòu)型復(fù)原成正確狀態(tài)？如何使包涵體的構(gòu)型復(fù)原成正確狀態(tài)？包含體的分離及溶解包含體的分離及溶解 分離包含體：分離包含體：對(duì)培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎破碎 ( (高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理) )，然后，然后離心離心( (500020000g/r)500020000g/r)，可使大部分包涵體沉淀，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。與可溶性蛋白分離。 洗滌：洗滌：除去除去包涵體沉淀的包涵體沉淀的脂類和膜蛋白，脂類和膜蛋白，一一般加般加

25、去污劑去污劑（Triton X-100Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑低濃度變性劑（2mol/L2mol/L尿素或鹽酸胍等）。尿素或鹽酸胍等）。以以避免避免包涵體溶解和復(fù)性的過程中包涵體溶解和復(fù)性的過程中重組蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)的降解。降解。溶解：溶解：a. a. 包涵體的溶解必須用包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的很強(qiáng)的變性劑變性劑，通過離，通過離子間的相互作用子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的破壞包涵體蛋白間的氫鍵氫鍵而而增溶蛋白。以增溶蛋白。以異氰鹽酸胍異氰鹽酸胍的增溶效果最強(qiáng)，的增溶效果最強(qiáng)，尿素稍差；尿素稍差；b.b. 去污劑去污劑（如（如SDSSDS）可以破壞

26、蛋白內(nèi)的）可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中去除而不允許用在制藥行業(yè)中；c.c. 酸酸（如（如70%70%甲酸）可以破壞蛋白的甲酸）可以破壞蛋白的次級(jí)鍵次級(jí)鍵從從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。d.d. 對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時(shí)應(yīng)對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時(shí)應(yīng)加入加入還原劑還原劑（如（如DTTDTT、GSHGSH、-ME-ME）打開蛋）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對(duì)于沒有二硫鍵的目白質(zhì)中所有二硫鍵，對(duì)于沒有二硫鍵的目標(biāo)蛋白有時(shí)也應(yīng)使用還原劑，因?yàn)?/p>

27、含二硫標(biāo)蛋白有時(shí)也應(yīng)使用還原劑，因?yàn)楹蜴I的雜蛋白會(huì)影響包涵體的溶解。鍵的雜蛋白會(huì)影響包涵體的溶解。e. e. 同時(shí)還應(yīng)加入同時(shí)還應(yīng)加入金屬螯合劑金屬螯合劑，如，如EDTAEDTA或或EGTAEGTA，用來螯合，用來螯合CuCu2+2+、FeFe3+3+等金屬離子以等金屬離子以防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)。防止其與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)。蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理 目前有多種不同的假設(shè)，但很多學(xué)目前有多種不同的假設(shè)，但很多學(xué)者認(rèn)為有一個(gè)者認(rèn)為有一個(gè)“熔球態(tài)熔球態(tài)”的的中間狀中間狀態(tài)態(tài)，在，在“熔球態(tài)熔球態(tài)”中，蛋白質(zhì)的二中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本形成，其空間結(jié)構(gòu)級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基

28、本形成，其空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模，再做一些局部調(diào)整就也初具規(guī)模，再做一些局部調(diào)整就可形成正確的立體結(jié)構(gòu)?？尚纬烧_的立體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述：蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述： 伸展態(tài)伸展態(tài)中間體中間體后期中間體后期中間體天天然態(tài)體然態(tài)體聚集體聚集體核糖核酸酶的變性和復(fù)性示意圖核糖核酸酶的變性和復(fù)性示意圖(A)(A)天然核糖核酸酶天然核糖核酸酶(B)(B)變性失活變性失活(C)“(C)“錯(cuò)亂錯(cuò)亂”核糖核酸酶核糖核酸酶 錯(cuò)誤發(fā)生的機(jī)制錯(cuò)誤發(fā)生的機(jī)制復(fù)性過程中，部分折疊中間體的疏水簇復(fù)性過程中，部分折疊中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會(huì)導(dǎo)致蛋白外露，分子間的疏水相互作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚

29、集。質(zhì)聚集。伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程受伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、到周圍環(huán)境的影響，如溫度、pHpH值、離子值、離子強(qiáng)度、復(fù)性時(shí)間等因素的影響。強(qiáng)度、復(fù)性時(shí)間等因素的影響。 不同條件下具體復(fù)性方式不同條件下具體復(fù)性方式1 1、透析、稀釋和超濾復(fù)性法透析、稀釋和超濾復(fù)性法：最傳統(tǒng)、應(yīng)用：最傳統(tǒng)、應(yīng)用最普遍，原理最普遍，原理-使變性劑濃度降低到蛋白質(zhì)能使變性劑濃度降低到蛋白質(zhì)能恢復(fù)折疊的濃度恢復(fù)折疊的濃度。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：復(fù)性活性回收率低，而且難與雜蛋白分復(fù)性活性回收率低，而且難與雜蛋白分離。離。稀釋法稀釋法大大增加溶液體積，不利于后續(xù)的大大增加溶液體積，不利

30、于后續(xù)的分離純化，且處理量太大，不利于工業(yè)放大分離純化，且處理量太大，不利于工業(yè)放大 ；透析法透析法耗時(shí)長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；耗時(shí)長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染。在膜上聚集變性，易造成膜污染。2 2、高蛋白濃度下的復(fù)性方法：、高蛋白濃度下的復(fù)性方法：（一個(gè)成功的復(fù)性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍一個(gè)成功的復(fù)性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復(fù)性率。能得到較高的復(fù)性率。緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中復(fù)性緩沖液中, ,使得蛋白質(zhì)在加入過程中或使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)

31、行折疊復(fù)性。加入階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊復(fù)性。因?yàn)橥耆郫B的蛋白通常不會(huì)與正在折疊因?yàn)橥耆郫B的蛋白通常不會(huì)與正在折疊的蛋白一起聚集。的蛋白一起聚集。溫度跳躍策略溫度跳躍策略：變性蛋白在變性蛋白在低溫低溫下復(fù)性折疊下復(fù)性折疊以減少聚集，直到易聚集的以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉(zhuǎn)化為中間體大都轉(zhuǎn)化為不易聚集的不易聚集的后期中間體后后期中間體后，溫度快速升高溫度快速升高來促來促進(jìn)后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。進(jìn)后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。復(fù)性在中等的變性劑濃度下進(jìn)行復(fù)性在中等的變性劑濃度下進(jìn)行，變性，變性劑濃度應(yīng)劑濃度應(yīng)高到高到足以有效防止聚集，同時(shí)又必足以有效防止聚集，同

32、時(shí)又必須須低到低到能夠引發(fā)正確復(fù)性。能夠引發(fā)正確復(fù)性。3 3、添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法： 包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用可以分為：進(jìn)作用可以分為：穩(wěn)定正確穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、的天然結(jié)構(gòu)、改變錯(cuò)誤改變錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、定性、增加增加折疊復(fù)性折疊復(fù)性中間體中間體的溶解性、的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。常用促進(jìn)劑常用促進(jìn)劑：a、共溶劑共溶劑：如通過與中間體特異的形成非聚集復(fù)合物，阻止蛋如通過與中間體特異的形成非聚集復(fù)合物，阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞機(jī)會(huì)，減少蛋白質(zhì)的聚集；白質(zhì)分子

33、間的相互碰撞機(jī)會(huì)，減少蛋白質(zhì)的聚集；b、去污劑及表面活性劑去污劑及表面活性劑：如如Trition X-100Trition X-100、CHAPsCHAPs、磷、磷脂、磺基甜菜堿等對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用，但它們能與蛋白質(zhì)脂、磺基甜菜堿等對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用，但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合，很難去除；結(jié)合，很難去除；c、氧化氧化- -還原劑還原劑：對(duì)于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)加對(duì)于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)加入氧化還原體系，通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，入氧化還原體系，通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率；提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率；d、小分子的添加

34、劑小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集。類等，都可阻止蛋白聚集。e、0.40.6M L-Arg：L-ArgL-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率?？纱蠓鹊靥岣甙w蛋白質(zhì)的折疊效率。9 9f、添加分子伴侶和折疊酶添加分子伴侶和折疊酶g、人工伴侶人工伴侶h、單克隆抗體單克隆抗體I、其它其它：多聚離子化合物、甘油等。多聚離子化合物、甘油等。此外，有：此外，有

35、：4、液相色譜（液相色譜（LCLC）復(fù)性法：）復(fù)性法： 疏水相互作用色譜（疏水相互作用色譜（HICHIC）、離子交換色譜）、離子交換色譜（IECIEC）、凝膠排阻色譜（）、凝膠排阻色譜（SECSEC）、親和色譜）、親和色譜（AFCAFC）已成功的對(duì)變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。其）已成功的對(duì)變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。其中中HICHIC的分離效果較理想的分離效果較理想；SECSEC最差；最差；鹽酸鹽酸胍會(huì)在胍會(huì)在IECIEC柱上保留，與蛋白一起洗脫下來；柱上保留，與蛋白一起洗脫下來；AFCAFC使用范圍窄、所需時(shí)間長、價(jià)格昂貴，使用范圍窄、所需時(shí)間長、價(jià)格昂貴，。 變性蛋白在變性蛋白在HICHIC上的復(fù)性機(jī)理上

36、的復(fù)性機(jī)理： 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白進(jìn)入當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白進(jìn)入HICHIC系統(tǒng)后，系統(tǒng)后，變性劑在柱上的作用力較弱，變性蛋白質(zhì)的變性劑在柱上的作用力較弱，變性蛋白質(zhì)的作用力較強(qiáng)作用力較強(qiáng)，變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)分，變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)分離，隨流動(dòng)相一起流出色譜柱。隨著流動(dòng)相離，隨流動(dòng)相一起流出色譜柱。隨著流動(dòng)相的不斷變化，變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相表的不斷變化，變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相表面上進(jìn)行面上進(jìn)行吸附吸附- -解吸附解吸附- -再吸附再吸附，并在此過程并在此過程中逐漸被復(fù)性，形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同中逐漸被復(fù)性，形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同的蛋白質(zhì)，并流出色譜柱的蛋白質(zhì)，并流出色

37、譜柱。液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)：液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)：（與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比）與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比） 在進(jìn)樣后在進(jìn)樣后可很快除去變性劑可很快除去變性劑； 色譜固定相對(duì)變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、色譜固定相對(duì)變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率； 在蛋白質(zhì)復(fù)性同時(shí)，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白在蛋白質(zhì)復(fù)性同時(shí)，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達(dá)到純化的目的，分離達(dá)到純化的目的，使復(fù)性和純化同

38、時(shí)進(jìn)行使復(fù)性和純化同時(shí)進(jìn)行； 便于回收變性劑，降低廢水處理成本便于回收變性劑，降低廢水處理成本。5、反膠束復(fù)性法反膠束復(fù)性法：表面活性劑的極表面活性劑的極 性頭朝內(nèi)，疏水性頭朝內(nèi)，疏水 的尾部向外，中的尾部向外，中 間形成極性的間形成極性的“核核”有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑極性極性“頭頭”極性的極性的“核核”非極性非極性“尾尾”蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以保持其構(gòu)象和活性，這樣可使保持其構(gòu)象和活性，這樣可使蛋白質(zhì)相互分離，減少了蛋白蛋白質(zhì)相互分離，減少了蛋白質(zhì)折疊過程中的聚集作用。質(zhì)折疊過程中的聚集作用。第四節(jié)第四節(jié) 固液分離固液分離 分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包含體、沉淀分離細(xì)胞、細(xì)

39、胞碎片、包含體、沉淀物等的手段，物等的手段，不僅應(yīng)用于初級(jí)階段，不僅應(yīng)用于初級(jí)階段，而且也應(yīng)用于精制階段而且也應(yīng)用于精制階段。一、離心沉降一、離心沉降 根據(jù)固體和液體之間的根據(jù)固體和液體之間的密度差密度差, ,利用離心機(jī)利用離心機(jī)提供的離心力實(shí)現(xiàn)固液分離。提供的離心力實(shí)現(xiàn)固液分離。 優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)易掌握；結(jié)果重復(fù)性好優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)易掌握；結(jié)果重復(fù)性好 沉降的難易取決于固體物質(zhì)和液體的密度沉降的難易取決于固體物質(zhì)和液體的密度差差, ,同時(shí)還取決于固體和液體的其他性質(zhì)以同時(shí)還取決于固體和液體的其他性質(zhì)以及離心機(jī)的離心能力及離心機(jī)的離心能力.(.(可以顆?？梢灶w粒沉降速度沉降速度表示表示) ) 斯托克斯公式

40、斯托克斯公式(Stokes):(Stokes): Uc=d Uc=d2 2( (s s- -L L)r)r2 2/18/18UcUc顆粒沉降速度顆粒沉降速度; ;dd顆粒直徑顆粒直徑( (假定為球形假定為球形) )ss固體密度固體密度LL液體密度液體密度rr離心半徑離心半徑; ; 角速度角速度; ; (r(r2 2: :離心力離心力) )液體粘度液體粘度 分離因數(shù)分離因數(shù): : a= (ra= (r2 2: :離心力離心力)/g)/g aa衡量離心力的大小衡量離心力的大小主要指標(biāo)主要指標(biāo), ,應(yīng)應(yīng)該主要是增大角速度而不是直徑。該主要是增大角速度而不是直徑。 提高離心效果可通過提高離心效果可通過

41、增加轉(zhuǎn)速和延長增加轉(zhuǎn)速和延長時(shí)間時(shí)間來取得。來取得。 (r(r2 2: :離心力離心力):):固液分離最重要的影響因素固液分離最重要的影響因素轉(zhuǎn)筒常規(guī)工業(yè)用離心機(jī)轉(zhuǎn)筒常規(guī)工業(yè)用離心機(jī)（-張家港華大離心機(jī)公司）張家港華大離心機(jī)公司） SSCSSC型離心機(jī)為三足式上型離心機(jī)為三足式上部人工卸料沉降離心機(jī)，部人工卸料沉降離心機(jī)，該系列離心機(jī)裝鼓壁上無該系列離心機(jī)裝鼓壁上無孔，屬沉降型轉(zhuǎn)鼓，操作孔，屬沉降型轉(zhuǎn)鼓，操作維修方便。主要適用于維修方便。主要適用于固固相顆粒細(xì)小，懸浮液粘性相顆粒細(xì)小，懸浮液粘性較大，過濾介質(zhì)再生困難，較大，過濾介質(zhì)再生困難，且含量較少的懸浮液的固且含量較少的懸浮液的固液分離。

42、液分離。 管式工業(yè)用離心機(jī)管式工業(yè)用離心機(jī)（-張家港華大離心機(jī)公司）張家港華大離心機(jī)公司） 懸浮液從進(jìn)料管進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，懸浮液從進(jìn)料管進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，固相顆粒在離心力場作用下固相顆粒在離心力場作用下受到離心力的加速沉降至轉(zhuǎn)受到離心力的加速沉降至轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁，沉降的顆粒在螺旋鼓內(nèi)壁，沉降的顆粒在螺旋輸送器葉片的推動(dòng)下，從輸送器葉片的推動(dòng)下，從（直筒段）沉降區(qū)通過（錐（直筒段）沉降區(qū)通過（錐段）干燥區(qū)至固相出口排出；段）干燥區(qū)至固相出口排出；經(jīng)澄清的液相從溢流孔溢出。經(jīng)澄清的液相從溢流孔溢出。從而實(shí)現(xiàn)固、液相自動(dòng)、連從而實(shí)現(xiàn)固、液相自動(dòng)、連續(xù)的分離。續(xù)的分離。 可應(yīng)用于脫水、濃縮、分級(jí)可應(yīng)用于脫水、濃縮、分級(jí)澄

43、清等不同場合。澄清等不同場合。刮刀卸料工業(yè)用離心機(jī)刮刀卸料工業(yè)用離心機(jī)（-張家港華大離心機(jī)公司）張家港華大離心機(jī)公司）主電機(jī)帶動(dòng)套裝的內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓全主電機(jī)帶動(dòng)套裝的內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓全速旋轉(zhuǎn)，物料由進(jìn)料管引入轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，物料由進(jìn)料管引入轉(zhuǎn)鼓，在離心力作用下，液相物鼓，在離心力作用下，液相物穿過濾布和內(nèi)轉(zhuǎn)鼓壁濾孔排出穿過濾布和內(nèi)轉(zhuǎn)鼓壁濾孔排出內(nèi)轉(zhuǎn)鼓，匯集到內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓間的內(nèi)轉(zhuǎn)鼓，匯集到內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓間的間隙內(nèi)，穿過到虹吸室的通孔間隙內(nèi)，穿過到虹吸室的通孔進(jìn)入虹吸室，再由虹吸裝置抽進(jìn)入虹吸室，再由虹吸裝置抽走排出機(jī)外。固相物截留在內(nèi)走排出機(jī)外。固相物截留在內(nèi)轉(zhuǎn)鼓形成環(huán)形濾餅層。進(jìn)料達(dá)轉(zhuǎn)鼓形成環(huán)形濾餅層。進(jìn)料達(dá)到預(yù)定容積后停

44、止進(jìn)料，進(jìn)一到預(yù)定容積后停止進(jìn)料，進(jìn)一步分離，此時(shí)可進(jìn)行洗滌。洗步分離，此時(shí)可進(jìn)行洗滌。洗滌、分離結(jié)束，刮刀自動(dòng)旋轉(zhuǎn)，滌、分離結(jié)束，刮刀自動(dòng)旋轉(zhuǎn)，將固相物刮下經(jīng)輸料螺旋排出將固相物刮下經(jīng)輸料螺旋排出機(jī)外，然后自動(dòng)洗網(wǎng)，開始下機(jī)外，然后自動(dòng)洗網(wǎng)，開始下一個(gè)循環(huán)。一個(gè)循環(huán)。二、微孔膜過濾二、微孔膜過濾根據(jù)根據(jù)流體各組分尺寸大小的不同流體各組分尺寸大小的不同，利用利用高分子聚合膜，過濾分離高分子聚合膜，過濾分離微米級(jí)的細(xì)胞、微米級(jí)的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和生物大分子的過程。細(xì)胞碎片和生物大分子的過程。何謂微孔何謂微孔膜過濾？膜過濾？切割分子量切割分子量? ?MWCO 微濾（微濾（0.10.1 1010 m)

45、m)：分離固體顆粒分離固體顆粒 超濾超濾（0.0010.001 0.10.1 m)m)：濃縮大分子物質(zhì)濃縮大分子物質(zhì) 反滲透（反滲透（0.0010.001 m)m)：從小分子中脫除水分從小分子中脫除水分微孔膜過濾的微孔膜過濾的3 3種方式：種方式：缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 技術(shù)難以掌握，影響因素多；技術(shù)難以掌握，影響因素多； 穩(wěn)定性和重復(fù)性不好；穩(wěn)定性和重復(fù)性不好； 膜堵塞問題難以解決！膜堵塞問題難以解決！微孔膜過濾特點(diǎn)微孔膜過濾特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染 設(shè)備投資少，操作安全；設(shè)備投資少，操作安全； 加工量可大可小，十分方便；加工量可大可小，十分方

46、便； 有利于分離密度差小而難以離心的固體，有利于分離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程?？芍苯佑糜谙掠蔚膶游鲞^程。微濾技術(shù)要點(diǎn)：微濾技術(shù)要點(diǎn)：1.1. 選擇選擇合適的膜合適的膜：不與蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生吸附；不與蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生吸附；孔徑合適?？讖胶线m。不銹鋼板式過濾器不銹鋼板式過濾器不銹鋼杯式過濾器不銹鋼杯式過濾器正壓過濾器正壓過濾器機(jī)電一體式微機(jī)電一體式微濾過濾系統(tǒng)濾過濾系統(tǒng) 微濾技術(shù)要點(diǎn)：微濾技術(shù)要點(diǎn)：2.2.選擇合適的操作條件：選擇合適的操作條件： 過濾方程（達(dá)西公式）：過濾方程（達(dá)西公式）：V= =P/P/( (Rc+RmRc+Rm)V：過濾速度，：過濾速度，P P：

47、壓力差，：壓力差，：濾液粘度，：濾液粘度，RcRc：濾餅阻力，：濾餅阻力，RmRm：過濾介質(zhì)（膜）的阻力。：過濾介質(zhì)（膜）的阻力。P P恒定，恒定，RcRc增加，增加，V降低降低 保持保持V不變則需阻止濾餅生成或不增厚。若不變則需阻止濾餅生成或不增厚。若RmRm和和不變，不變，則則V恒定，因?yàn)楹愣?，因?yàn)镻 P增加會(huì)加大增加會(huì)加大RcRc。3.3.膜材料的新發(fā)展膜材料的新發(fā)展無機(jī)陶瓷膜無機(jī)陶瓷膜優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（機(jī)械強(qiáng)度大、惰性更大）（機(jī)械強(qiáng)度大、惰性更大） 孔徑均勻，過濾效果好；孔徑均勻，過濾效果好； 耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機(jī)溶劑；耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機(jī)溶劑； 堅(jiān)固耐用，使用壽命長；堅(jiān)固耐用，使用

48、壽命長； 可以加壓反向沖洗可以加壓反向沖洗缺點(diǎn)缺點(diǎn)：造價(jià)高；過濾面積??；表現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)一定的吸附；造價(jià)高；過濾面積?。槐憩F(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)一定的吸附；各種微孔膜柱及設(shè)備各種微孔膜柱及設(shè)備各種微孔膜柱及設(shè)備各種微孔膜柱及設(shè)備操作方式操作方式1.1. 切向流過濾切向流過濾：（懸浮液沿與濾膜水平的方向流動(dòng)，因此過懸浮液沿與濾膜水平的方向流動(dòng)，因此過濾過程中不斷帶走堆積在介質(zhì)表面的固體濾過程中不斷帶走堆積在介質(zhì)表面的固體物質(zhì)，不會(huì)形成濾餅層而使膜堵塞。物質(zhì)，不會(huì)形成濾餅層而使膜堵塞。 ）一種維持恒壓下高過濾速度的技術(shù)。一種維持恒壓下高過濾速度的技術(shù)。原理原理：當(dāng)移走固體與固體沉積速率相：當(dāng)移走固體與固體沉積速率

49、相同時(shí)，過濾速度就保持恒定，控制不同的切同時(shí)，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。向流速度就可以得到不同的過濾速度。Sartocon SliceSartocon Slice整體整體型型切向流過濾切向流過濾系統(tǒng)系統(tǒng)德國德國Sartorius Vivaflow 50 Sartorius Vivaflow 50 回旋流回旋流/ /切向流超濾器切向流超濾器在在膜膜表表面面加加以以攪攪拌拌造造成成流流動(dòng)動(dòng)使膜相對(duì)于懸浮液運(yùn)動(dòng)（將使膜相對(duì)于懸浮液運(yùn)動(dòng)（將膜附于圓筒上高速旋轉(zhuǎn)）膜附于圓筒上高速旋轉(zhuǎn)）切向流過濾的缺點(diǎn)切向流過濾的缺點(diǎn) 產(chǎn)生的剪切力使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活，流速產(chǎn)生的剪切力

50、使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活，流速越快，失活越嚴(yán)重；越快，失活越嚴(yán)重； 懸浮液在流動(dòng)過程中有壓力損失，能耗懸浮液在流動(dòng)過程中有壓力損失，能耗消耗大；消耗大； 不能避免膜的污染和堵塞，當(dāng)膜的阻力不能避免膜的污染和堵塞，當(dāng)膜的阻力增大時(shí)，無法防止過濾速度的下降；增大時(shí)，無法防止過濾速度的下降；、脈沖反洗切向流過濾、脈沖反洗切向流過濾 原理原理：在切向流過濾中在切向流過濾中間歇地在膜的背間歇地在膜的背面加一反壓面加一反壓，迫使部分濾液反透過膜以，迫使部分濾液反透過膜以沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物，沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物，使過濾速度保持在比較高的水平。使過濾速度保持在比較高的水平。、調(diào)整生化懸浮液的性質(zhì)、調(diào)整生化懸浮液的性質(zhì) 調(diào)整調(diào)整pHpH值和離子強(qiáng)度；值和離子強(qiáng)度； 加入絮凝劑；加入絮凝劑； 加入過濾助劑（硅藻土系列）加入過濾助劑（硅藻土系列）三、雙水相萃取三、雙水相萃取 原理原理：利用利用被提取物在二相中的分配不同實(shí)被提取物在二相中的分配不同實(shí)現(xiàn)分離目的?，F(xiàn)分離目的。由于蛋白質(zhì)在有機(jī)相中容易失活，由于蛋白質(zhì)在有機(jī)相中容易失活，因此采用