生物化學檢驗常用技術(shù)

1、第三章第三章 生物化學檢驗常用技術(shù)生物化學檢驗常用技術(shù)光譜分析技光譜分析技電化學分析技術(shù)電化學分析技術(shù)干化學分析技術(shù)干化學分析技術(shù)電泳分析技術(shù)電泳分析技術(shù)基因擴增技術(shù)基因擴增技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)發(fā)射光譜分析技術(shù)發(fā)射光譜分析技術(shù)散射光譜分析技術(shù)散射光譜分析技術(shù)一、吸收光譜分析法一、吸收光譜分析法40.575光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測器檢測器顯示器顯示器鎢燈、鹵鎢燈 3501000氫燈、氘燈 180360濾光片棱鏡光柵玻璃比色皿石英比色皿5( (一一) )、分光光度技術(shù)的基本原理分光光度技術(shù)的基本原理1 1、吸光度、吸光度與透光度與透

2、光度 A A = -lgT = -lgI/I = -lgT = -lgI/I0 0 = lgI= lgI0 0/I/I 當光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，當光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一一部分光部分光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強度為被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強度為I I0 0，透射光強度為透射光強度為I I，I I和和I I0 0之比稱為透光度之比稱為透光度，即：即：T = I/IT = I/I0 0 T T100%100%為為T%T%稱為百分透光度。透光度的負對數(shù)稱為稱為百分透光度。透光度的負對數(shù)稱為吸光度吸光度

3、即：即：入射光入射光 I I0 0透射光透射光 I I62 2、Lambert-BeerLambert-Beer定律定律Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)分光分析的理論基礎(chǔ)。 A = KLCA A 為為吸光度吸光度；K K 為為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L L 為溶液層為溶液層厚度，稱為光徑厚度，稱為光徑；C C 為為溶液濃度溶液濃度 Lambert-BeerLambert-Beer定律適用于定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體液體當一束平行單色光

4、通過均勻的非散射樣品時，吸光度與溶液層當一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比。厚度和溶液濃度成正比。L LLambert-Beer定律定律適用于適用于: :可見光可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射、紫外光、紅外光和均勻非散射的的液體以及分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品液體以及分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品. .單色光單色光 均勻介質(zhì)均勻介質(zhì)吸收物質(zhì)無相吸收物質(zhì)無相互作用互作用3 3、Lambert-BeerLambert-Beer定律的應(yīng)用條件定律的應(yīng)用條件4 4、Lambert-BeerLambert-Beer定律的偏離現(xiàn)象定律的偏離現(xiàn)象溶液：稀溶液、化學變化溶液：稀溶

5、液、化學變化光學光學; ; 非單色光、散射和折射非單色光、散射和折射儀器儀器; ; 光源、實驗條件光源、實驗條件 在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存有色物質(zhì)產(chǎn)生的干擾、抵消比色皿和試劑對入射光的影響而用來調(diào)節(jié)儀器百分透光率為100%的溶液。5 5、空白溶液的選擇、空白溶液的選擇 蒸餾水 試劑樣品不含待測元素 不顯色1、溶劑空白溶劑空白：不加樣品和任何試劑，用純?nèi)軇ㄈ缯麴s水或其他有機溶劑）作參比溶液。 選擇原則：當顯色劑及其它試劑均無色，被測試樣中又無其他有色離子時，選用溶劑參比。2、試劑空白試劑空白：用不加樣品，而顯色劑和其他試劑都相同的溶液作參比溶液。 選擇原則：當顯色劑本身有顏

6、色或其它試劑有顏色，被測試樣中又無其他有色離子時，選用試劑參比。3、樣品空白樣品空白：用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液。 選擇原則：當試樣溶液有顏色，而試劑、顯色劑均無顏色時，選用樣品空白。4、平行操作空白：按樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測元素的樣品進行平行操作， 以消除操作過程中引入干擾雜質(zhì)所帶來的誤差。 選擇原則：當操作過程中由于試劑、器皿、水和氣等因素引入了一定量的被測試樣組分的干擾離子5、不顯色空白：可將一份試樣加入適當?shù)难诒蝿瑢⒈粶y組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑 和其它試劑均按照操作手續(xù)加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。 選擇原則

7、：當顯色劑和被測試樣均有顏色時，可選用此法。( (二二) )、分光光度法在生化檢驗中的應(yīng)用、分光光度法在生化檢驗中的應(yīng)用靈敏度高、操作簡便、應(yīng)用廣泛1、對未知化合物進行定性分析、對未知化合物進行定性分析2、對待測物質(zhì)進行定量測定、對待測物質(zhì)進行定量測定定性依據(jù)：最大吸收波長最大吸收波長maxmax和摩爾吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù) 標準曲線法和比較法11(1).(1).標準曲線法標準曲線法 根據(jù)根據(jù)Lambert-BeerLambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標準品溶液與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標準品溶液（濃度應(yīng)

8、包含高、中、低濃度范圍），按標本處理方法（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標準液濃度以標準液濃度為橫座標，以吸光度為縱座標為橫座標，以吸光度為縱座標，將，將對應(yīng)各點連成一條通對應(yīng)各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為過原點的直線，這條直線稱為標準曲線標準曲線。待測溶液測定。待測溶液測定吸光度后，從標準曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。吸光度后，從標準曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。u方法：5.5.標準溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。標準溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。132 2比較法比較法 C CR R=(A=(AR R C Cs

9、 s)/A)/As s 己己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白，同時，同時測測定標準管和標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及定標準管和標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標準品標準品濃度，可直接濃度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為：計算出標本的濃度，計算公式為：二、發(fā)射光譜分析法二、發(fā)射光譜分析法 處于激發(fā)態(tài)的待測元素，原子回到基態(tài)時以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜稱為發(fā)射光譜，對元素進行定性與定量分析的方法。發(fā)射光譜是指樣品本身產(chǎn)生的光譜被檢測器接收；吸收光譜是光源發(fā)射的光譜被樣品吸收了一部分，剩下的那部分光譜被檢測器接收?；鹧婀?/p>

10、度法熒光光度法火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測系統(tǒng)測量被測火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測系統(tǒng)測量被測元素所發(fā)射的輻射強度來進行定量分析的方法。元素所發(fā)射的輻射強度來進行定量分析的方法。它是一種簡化的發(fā)射光譜分析法它是一種簡化的發(fā)射光譜分析法（一）、火焰光度法（一）、火焰光度法FP640火焰光度計火焰光度法分析示意圖火焰火焰光度法的特點光度法的特點應(yīng)用范圍窄靈敏快速準確設(shè)備簡單試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測定火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為25，可用于微量分析和常量分析分析堿金屬與堿土金屬，絕對靈敏度可達0110106 g被測試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線較簡單，且均在可見光區(qū)，故使

11、譜線分離和測量的設(shè)備簡單主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測定1、激發(fā)條件影響火焰光度分析的因素影響火焰光度分析的因素2、試樣的種類和組成3、試液中共存離子對測定有影響4、儀器的質(zhì)量火焰溫度要適當，溫度過低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴重，影響測量的線性關(guān)系。（二）、熒光分光光度法（二）、熒光分光光度法化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。利用物質(zhì)吸收較短波長的光能后發(fā)射較長波長特征光譜的性質(zhì)，對物質(zhì)定性或定量分析的方法。熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的光。

12、熒光產(chǎn)生的原理：熒光分光光度法分析測定蛋白質(zhì)、核酸、維生素等;對某些激素及其代謝產(chǎn)物的測定;當化合物含量太少,一般分析方法靈敏度不夠時,使用熒光分析技術(shù)就能解決測定問題。三、散射光譜分析法三、散射光譜分析法透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方法，其反應(yīng)的原理一樣，只是檢測的光信號與儀器的檢測器有區(qū)別。1、透射比濁操作簡便，適用于普通的自動生化分析儀和普通的分光光度計，幾乎所有的實驗室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測的周期較長。2、散射比濁的優(yōu)點是靈敏度、精密度均較高，檢測快速。其缺點是需特定的分析儀器，試劑價格高。光的散射用單色光照射透明溶液時，大部分按

13、原來方向透射，而一小部分則按不同的角度散射開來。散射光譜分析法利用懸浮顆?；鞚嵋旱纳⑸涔鈴姸然?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進行定量分析的方法。第二節(jié)第二節(jié) 電化學分析技術(shù)電化學分析技術(shù)一、電位分析法一、電位分析法 ISE利用電極電位與濃度的關(guān)系測定物質(zhì)含量的電化學分析方法。利用電極電位與濃度的關(guān)系測定物質(zhì)含量的電化學分析方法。電位分析法電位分析法一類用特殊敏感膜制成，對溶液中某種特定離子有選擇性響應(yīng)的電化學傳感器離子選擇電極離子選擇電極 ISE電解質(zhì)溶液中參與電化學反應(yīng)的離子的有效濃度 離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基本結(jié)構(gòu)都包括：對特定離子有選擇性響應(yīng)的薄膜(敏感膜或傳感膜)、內(nèi)參

14、比溶液與內(nèi)參比電極。 敏感膜將內(nèi)側(cè)參比溶液與外側(cè)的待測離子溶液分開，是電極的關(guān)鍵部位。 ISE基本基本結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)內(nèi)參比電極內(nèi)參比電極電極殼體電極殼體內(nèi)參比溶液內(nèi)參比溶液敏感膜敏感膜離子選擇性電極離子選擇性電極結(jié)構(gòu)示意圖結(jié)構(gòu)示意圖電極電位電極電位電極電位測量電極電位測量在電位分析中，構(gòu)成電池的在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個電極，其中一個，其電兩個電極，其中一個，其電位值隨待測離子濃位值隨待測離子濃( (活活) )度的度的變化而變化，能指示待測離變化而變化，能指示待測離子的濃子的濃( (活活) )度，稱為度，稱為指示電指示電極極，或，或離子選擇性電極離子選擇性電極。指示電極指示電極而另一個電極，其電而

15、另一個電極，其電位不受試液組成變化的位不受試液組成變化的影響，具有較恒定的數(shù)影響，具有較恒定的數(shù)值，只是作為測量電位值，只是作為測量電位的標準，稱為參比電極的標準，稱為參比電極( (參考電極參考電極) )。 參比電極參比電極離子選擇性電極：電位法測定溶液中某種定離子活度的指示電極；離子選擇性電極：電位法測定溶液中某種定離子活度的指示電極；能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應(yīng)該特定離子，指示出能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應(yīng)該特定離子，指示出這種離子活度變化情況，測定離子的活度或濃度。這種離子活度變化情況，測定離子的活度或濃度。 選擇性好選擇性好 在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對組

16、成復雜的試樣往往在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對組成復雜的試樣往往不需要分離處理就可直接測定。不需要分離處理就可直接測定。 靈敏度高靈敏度高 電位法的檢出限為電位法的檢出限為1010-5-51010-8 -8 mol/Lmol/L，適于微量組分的測，適于微量組分的測定，電位滴定法適于常量分析。定，電位滴定法適于常量分析。 快速快速 儀器設(shè)備簡單、操作方便、分析快速、測定范圍寬、不破壞試液，儀器設(shè)備簡單、操作方便、分析快速、測定范圍寬、不破壞試液，易于實現(xiàn)分析自動化。易于實現(xiàn)分析自動化。 缺點缺點 需要有專用的離子選擇性電極。需要有專用的離子選擇性電極。電位電位分析法的特點：分析法的特點： 根

17、據(jù)國際純粹及應(yīng)用化學聯(lián)合會根據(jù)國際純粹及應(yīng)用化學聯(lián)合會( (IUPAC) )的建議，離子選的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：擇性電極一般采用如下分類： 常用的離子選擇電極常用的離子選擇電極玻璃膜電極玻璃膜電極氣敏電極氣敏電極如如，二氧化碳氣敏電極：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣，二氧化碳氣敏電極：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由醋酸纖維、聚四由醋酸纖維、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。測定時，。測定時，CO2氣體通過微孔滲透膜與中氣體通過微孔滲透膜與中介溶液接觸介溶液接觸(中介液是中介液是0.001mol/L的的NaHCO3)；由于由于CO2與與H2O結(jié)合生成碳

18、酸，結(jié)合生成碳酸，從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。氣敏電極氣敏電極通過界面發(fā)生化學反通過界面發(fā)生化學反應(yīng)進行工作的，離子電極用來應(yīng)進行工作的，離子電極用來指示中介液中某一離子活度的指示中介液中某一離子活度的變化。溶解在水溶液中的氣體，變化。溶解在水溶液中的氣體，只要能生成可用離子選擇性電只要能生成可用離子選擇性電極檢出的離子，均可用氣敏電極檢出的離子，均可用氣敏電極測定。極測定。用用pH玻璃電極間接測定玻璃電極間接測定CO2的的含量含量 氣敏電極是一種氣體傳感器，測定溶液中的氣體含量。氣敏電極是一種氣體傳感器，測定溶液中的氣體含量。原理：利用待測氣體對某一化學平衡的

19、影響，使平衡中某特定原理：利用待測氣體對某一化學平衡的影響，使平衡中某特定離子的活度發(fā)生變化，來測定試液中被測氣體的分壓離子的活度發(fā)生變化，來測定試液中被測氣體的分壓(含量含量)。 在氣敏電極的中介溶液中放入玻在氣敏電極的中介溶液中放入玻璃電極。測量時，控制試液的酸璃電極。測量時，控制試液的酸堿度，使堿度，使CO2通過氣透膜擴散加通過氣透膜擴散加入氣敏電極；引起中介溶液入氣敏電極；引起中介溶液pH的的改變。測定中介溶液的改變。測定中介溶液的pH值，即值，即可計算出試液中可計算出試液中CO2的濃度。的濃度。 CO2 + H2O = HCO3- + H+ NH3 + H2O = NH4+ + OH

20、- SO2 + H2O = HSO3- + H+ 2NO2 + H2O = NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O = HS- + H3O+ HCN + H2O = H3O+ + CN- HF + H2O = H3O+ + F- 凡是凡是溶于水釋放溶于水釋放H+的反應(yīng)，都可以用的反應(yīng)，都可以用pH玻璃電極檢出；玻璃電極檢出；而后三種分別可以用而后三種分別可以用S2-、CN-、F-等離子選擇性電極來檢測。等離子選擇性電極來檢測?？捎秒姌O測定的氣體可用電極測定的氣體 酶的催化反應(yīng)酶的催化反應(yīng)專一強專一強；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感器，酶電極特別適用于；酶電極有極高的選擇性

21、。作為一種生物傳感器，酶電極特別適用于生物醫(yī)學、生物化學等領(lǐng)域。生物醫(yī)學、生物化學等領(lǐng)域。酶電極酶電極 選擇適合的選擇適合的指示電極指示電極 制成具有催化活性的水不溶性制成具有催化活性的水不溶性酶膜酶膜 把酶膜固定在電極的表面把酶膜固定在電極的表面(酶的固定化酶的固定化) 酶電極的制作酶電極的制作過程過程將生物酶涂布在離子選擇性電極或其它傳感器的敏感膜上，通過酶催化作將生物酶涂布在離子選擇性電極或其它傳感器的敏感膜上，通過酶催化作用，使待測物質(zhì)產(chǎn)生能在該電極上響應(yīng)的離子或化合物，間接測定該物質(zhì)。用，使待測物質(zhì)產(chǎn)生能在該電極上響應(yīng)的離子或化合物，間接測定該物質(zhì)。脲酶催化分解尿素產(chǎn)生脲酶催化分解尿

22、素產(chǎn)生NH3、CO2，溶于水可得到不同產(chǎn)物溶于水可得到不同產(chǎn)物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相應(yīng)的離子選等，可用相應(yīng)的離子選擇性電極來檢測它們，間接得到尿擇性電極來檢測它們，間接得到尿素的含量。素的含量。常用的固定化技術(shù)有：吸附、試劑交聯(lián)、共價鍵合、 包埋法(酶與載體聚丙酰胺混合后直接包在電極敏感部分形成酶凝膠層)。幾種酶電極的品種與性能幾種酶電極的品種與性能測定物質(zhì)酶檢測物測定范圍(mol/L)葡萄糖葡萄糖氧化酶O210-42*10-2尿素(脲)脲酶NH310-510-2膽固醇膽固醇氧化酶H2O210-510-2L谷氨酸谷氨酸脫氫酶NH4+10-410-1L賴氨酸賴氨酸脫羧酶C

23、O210-410-1 標準曲線法標準曲線法 標準比較法標準比較法 標準加入法標準加入法 離子選擇性離子選擇性電極的電極的分析方法分析方法1 1、直接法：、直接法：2 2、間接法：、間接法：樣品不經(jīng)稀釋，直接由電極測量離子活度。樣品經(jīng)緩沖溶液稀釋后由電極測量離子活度。用測定離子的純物質(zhì)配制一系列已知活度或濃度的標準溶液，用離子計測定，用測定離子的純物質(zhì)配制一系列已知活度或濃度的標準溶液，用離子計測定，繪制電極電位與活度對數(shù)的關(guān)系曲線；然后在相同條件下測定樣品，由標準繪制電極電位與活度對數(shù)的關(guān)系曲線；然后在相同條件下測定樣品，由標準曲線查得濃度。曲線查得濃度。將已知的小體積標準溶液，加入已知較大體

24、積的待測液中，根據(jù)加入前后電將已知的小體積標準溶液，加入已知較大體積的待測液中，根據(jù)加入前后電位值變化，求得待測液中被測離子得濃度。位值變化，求得待測液中被測離子得濃度。二、電導分析法二、電導分析法電導分析法電導分析法在外電場作用下，以電解質(zhì)溶液中正負離子遷移為基礎(chǔ)的電化學分析法。什麼是電導？衡量電解液導電能力的量度值這里所說的電導是指電解質(zhì)溶液中正、負離子在外電場作用下的遷移而產(chǎn)生的電流傳導導電能力與溶液中正負離子的數(shù)目、離子所帶的電荷量、離子在溶液中遷移的速率等因素有關(guān)利用電解質(zhì)溶液的電導值來確定物質(zhì)含量的分析方法利用溶液的電導與溶液中離子數(shù)目的相關(guān)性建立分析方法第三節(jié)第三節(jié) 干化學分析技

25、術(shù)干化學分析技術(shù) 將液體檢測樣品直接加到含有試劑的固相載體上發(fā)生反應(yīng)，依照反應(yīng)結(jié)果定量測定樣品中特定成分的濃度或活動的一項技術(shù)。 干化學分析技術(shù)是以酶法為基礎(chǔ)的一類分析方法，又有干試劑化學或固相化學之稱。干化學分析一、干化學分析技術(shù)的基本原理一、干化學分析技術(shù)的基本原理根據(jù)多層膜測定方法不同，可將多層膜分為3種類型：反射光度法差示電位法熒光反射光度法熒光技術(shù)競爭免疫技術(shù)反射光度法反射光度法 漫反射光是指從光源發(fā)出的光漫反射光是指從光源發(fā)出的光進入樣品內(nèi)部，經(jīng)進入樣品內(nèi)部，經(jīng) 過多次反射、過多次反射、折射、散射及吸收后返回樣品表折射、散射及吸收后返回樣品表面的光面的光 朗伯定律描述入射光和吸收光

26、之間的關(guān)系朗伯定律描述入射光和吸收光之間的關(guān)系KubelkaMunk 理論理論描述一束單描述一束單色光入射到一種既能吸收光，又色光入射到一種既能吸收光，又能反射光的物體上的光學關(guān)系。能反射光的物體上的光學關(guān)系。差示電位法差示電位法二、干化學分析技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用二、干化學分析技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用反射光度法系統(tǒng)膠片涂層技術(shù)袋式分析儀儀器檢測: 三、干化學分析技術(shù)的影響因素三、干化學分析技術(shù)的影響因素 反射光度計 標準灰色試劑條 離子選擇電極干式化學分析儀 標準條校準頻度: 質(zhì)控物: 干片試劑的儲存與使用: 溫度和濕度:第三節(jié)第三節(jié) 電泳分析技術(shù)電泳分析技術(shù)正極正極負極負極帶負電粒子帶負電粒

27、子帶正電粒子帶正電粒子帶電荷的溶質(zhì)或粒子帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象 電泳：電泳：電泳技術(shù)電泳技術(shù): :利用電泳現(xiàn)象將利用電泳現(xiàn)象將多組分樣品分離、分析多組分樣品分離、分析的技術(shù)的技術(shù)電泳儀電泳儀: :可以實現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器可以實現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器一、電泳分析技術(shù)的基本原理一、電泳分析技術(shù)的基本原理溶液中粒子的帶電狀態(tài)溶液中粒子的帶電狀態(tài)兩性電離及兩性電解質(zhì)兩性電離及兩性電解質(zhì): :等電點時蛋白質(zhì)分子在電場中不會移動。等電點時蛋白質(zhì)分子在電場中不會移動。 溶液的溶液的pHpH值離等電點越遠，顆粒所帶的電

28、荷越多，電泳速度也越快。值離等電點越遠，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度也越快。等電點等電點pI :pI :某一溶液中粒子所帶的正、負電荷相等，即凈電荷為零時溶液的某一溶液中粒子所帶的正、負電荷相等，即凈電荷為零時溶液的pH值。值。電泳遷移率電泳遷移率影響電泳的因素影響電泳的因素1 1、分子的形狀和性質(zhì)、分子的形狀和性質(zhì)2 2、電場強度、電場強度電場強度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性；電場強度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性；電場強度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊電場強度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊473 3、電泳緩沖溶液、電泳緩沖溶液維持電泳介質(zhì)維持電泳介質(zhì)pHpH恒定恒定, ,并起導電作用并起導電作用 溶液的

29、酸堿度決定被分離物質(zhì)的解離程度和帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。pH與pI差值越大，粒子帶電量越多。緩沖溶液不能過酸過堿，緩沖溶液不能過酸過堿，以免使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，以免使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，pHpH一般一般4.5-9.04.5-9.0為宜。為宜。緩沖溶液的離子強度影響緩沖容量、電泳速度和產(chǎn)熱效應(yīng)兼顧上述效應(yīng)將緩沖溶液離子強度設(shè)置在一個合適的范圍，一般設(shè)在0.050.1mol/L為宜4 4、支持介質(zhì)、支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素膜的吸附作用較小。吸附作用和電滲作用吸附作用和電滲作用5 5、蒸發(fā)、蒸發(fā)二、常用電泳技術(shù)及應(yīng)用二、常用電泳技術(shù)及應(yīng)用按電泳方式分類按電泳方式分類1. 移動界面電泳2. 區(qū)帶

30、電泳3. 穩(wěn)態(tài)電泳帶電分子的移動速率通過觀察界面的移動來測定帶電荷的分子在具有滲透能力的介質(zhì)上的遷移分子顆粒的電泳遷移在一定時間后達到穩(wěn)態(tài)按電泳支持物分類按電泳支持物分類(五五) 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 (IEF)第五節(jié)第五節(jié) 基因擴增技術(shù)基因擴增技術(shù) 在在體外將微量的目的基因片段大量擴增，以得到足量體外將微量的目的基因片段大量擴增，以得到足量的的DNADNA供研究分析和檢測鑒定用的技術(shù)供研究分析和檢測鑒定用的技術(shù)一、一、PCR反應(yīng)基本原理反應(yīng)基本原理l含含Mg2+的緩沖液的緩沖液ldNTPsl耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶lTag DNA聚合酶聚合酶l特異性引物特異性引物l一對分別與待擴增一對

31、分別與待擴增DNA序列兩端互序列兩端互補的寡核苷酸片段。補的寡核苷酸片段。l模板模板DNAPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系PCR基本反應(yīng)步驟基本反應(yīng)步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C循環(huán)循環(huán)2530次次使模板使模板DNA完全變性成單鏈。完全變性成單鏈。同時引物自身和引物之間存在同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除的局部雙鏈得以消除使引物和模板使引物和模板DNA退火結(jié)合退火結(jié)合此溫度下此溫度下DNA聚聚合酶以合酶以dNTP 為為底物催化底物催化DNA鏈鏈的延長的延長三個步驟為一個循環(huán)，三個步驟為一個循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進入下一輪循環(huán)輪模板進入下一輪循環(huán)5/3/3/5/5/5/5/5/引物引物A引物引物B變性（變性（95）6075859590807065555045403530退火（退火（60）延伸（延伸（72）5/5/5/3/3/5/5/5/引物引物A引物引物B6075859590807065555045403530變性（變性（95）退火（退火（60）延伸（延伸（72）5/5/5/5/DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol5/5/5/5/5/5/5/607585