LAMP試驗(yàn)簡(jiǎn)介

1、通過(guò) LAMP 實(shí)現(xiàn) DNA 的線性擴(kuò)增、LAMP 原理60-65C雙鏈 DNA 復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA 在 65c 左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA 在此溫度下合成是可能的。利用 4 種特異引物依靠一種高活性鏈置換 DNA 聚合酶。使得鏈置換 DNA 合成在不停地自我循環(huán)。擴(kuò)增分兩個(gè)階段。第 1 階段為起始階段，任何一個(gè)引物向雙鏈 DNA 的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物 FIP 的 F2 序列首先與模板F2c 結(jié)合，在鏈置換型 DNA 聚合酶的作用下向前延伸啟動(dòng)鏈置換合成。外部引物F3 與模板 F3c 結(jié)合并延伸，置換出完整的 FIP 連接的互

2、補(bǔ)單鏈。FIP 上的 F1c 與此單鏈上的 Fl 為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板。下游引物 BIP 與 B3 先后啟動(dòng)類似于 FIP 和 F3 的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3末端的 Fl 區(qū)段為起點(diǎn)。以自身為模板，進(jìn)行 DNA 合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是 LAMP 基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。第 2 階段是擴(kuò)增循環(huán)階段。 以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板， FIP 與莖環(huán)的 F2c 區(qū)結(jié)合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以 3末端的 B1 區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板。進(jìn)行 DNA 合成延伸及鏈置換.形成長(zhǎng)短不一的 2 條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA,BIP 引

3、物上的 B2 與其雜交。啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。且產(chǎn)物 DNA 長(zhǎng)度增加一倍。 在反應(yīng)體系中添加 2 條環(huán)狀引物 LF 和 LB,它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，周而復(fù)始。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度 DNA 的混合物。且產(chǎn)物 DNA 為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列。A.ILRtaTHnnmRtRrtdiImnriiininnstsnIILEloratorandr9cydinste)嶼、實(shí)驗(yàn)流程、階段實(shí)驗(yàn)及需要解決的問(wèn)題（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段1、引物設(shè)計(jì)2、模板中引入合適的酶切位點(diǎn)3、不同梯度拷貝數(shù)模板的準(zhǔn)備4、反應(yīng)儀器的準(zhǔn)備5、具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶的選擇6、擴(kuò)增產(chǎn)

4、物的檢測(cè)方法7、擴(kuò)增產(chǎn)物量的檢測(cè)（二）實(shí)驗(yàn)階段1、反應(yīng)體系的確定2、模板濃度的優(yōu)化3、反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化4、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)5、以 PCR 的擴(kuò)增作為對(duì)照、具體實(shí)驗(yàn)方案（一）引物的設(shè)計(jì)LAMP 引物設(shè)計(jì)的在線網(wǎng)站（http:/primerexplorer.jp/eZ）,只要導(dǎo)入靶基因就能自動(dòng)生成成組引物。1、LAMP 引物的設(shè)計(jì)主要是針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因 3,端的 F3c、F2c 和 Flc 區(qū)以及 5端的 Bl、B2 和 B3 區(qū)等 6 個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì) 4 種引物。2、引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)設(shè)計(jì)合適的引物是進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)的關(guān)鍵，通過(guò)考慮堿基組成，GC含量，二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，Tm 值等

5、。在進(jìn)行 LAMEP 引物設(shè)計(jì)的時(shí)候有以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)需要考慮：引物之間的距離F2 區(qū)段的 5端到 B2 區(qū)段的 5端（LAMP 反應(yīng)擴(kuò)增的區(qū)域）之間的距離建議是 120180bp。F3 區(qū)段的 3端到 F2 區(qū)段的 5端之間的距離是 020bp（同理 B2 和 B3 之間的距離是 020bp）。F2 區(qū)段的 5端到 F1 區(qū)段的 5f 端（形成環(huán)的部分）之間的距離是 4060bp。引物的 Tm 值一般情況下，根據(jù)引物與模板結(jié)合的先后順序，其 Tm 值表現(xiàn)為：F1c、B1cF2、B2,這樣鏈置換后形成的單鏈會(huì)易于結(jié)合成 loopF2、B2F3、B3,確保內(nèi)引物會(huì)先于外引物結(jié)合到模板上進(jìn)行擴(kuò)增3、

6、引物設(shè)計(jì)結(jié)果HP-F:CGCGAGGTACCG.GCTCGTAAAACGA 儂顧砌 GTF:M13-47.HP-RGGCCTGCATGCAAGCTTGCAGCTATGACCATGATTACGCM13-48.M13-47100.0MM13Forward(-iO)1收EMRI4Q1CGCCAGGGTT4Q1CGCCAGGGTTTTCCCAGTCATTCCCAGTCACGACGHGTACGACGHGTAJULACGACGGCCAGTGAIITCJULACGACGGCCAGTGAIITCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGAGC

7、ATCTAGATATCGGAGCGGTGCGGT：CCAkAASGGTAGTGCT2CAACCAkAASGGTAGTGCT2CAAH H：.二一工.二二二二奈二二二二奈二二二二二二一九工人CGTAGATCTATAGCCTCGTAGATCTATAGCCTP州Hindlll501501ACTGCAGAGGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTT6GCGTCCTGCATGCAAGCTT6GCGTAATCATGGTCAATCATGGTCMAGCTETMAGCTETCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTACACA

8、CACTGACGKTTGACGKT二二二二匚藁.二二支二二二二二二L L二二二二AAAGGACACACTTTAACAATA&SCGAGTGTTAAAAAGGACACACTTTAACAATA&SCGAGTGTTAA期GTGGTG”箍說(shuō)，3UII/I（二）引入合適的酶切位點(diǎn)方便擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后長(zhǎng)度單一化。（三）聚合酶和反應(yīng)溫度的選擇用 Bst 聚合酶在 60、63 和 65 三個(gè)梯度溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，用 Phi29 聚合酶在 37 進(jìn)行擴(kuò)增，在其他因素相同的條件下，比較兩種酶的擴(kuò)增效率，選取最優(yōu)的聚合酶以及該聚合酶最佳的反應(yīng)溫度。（四）最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇同樣的條件下設(shè)置幾個(gè)平行反應(yīng)，分

9、別在 15min、30min、45min、60min、75min后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。(五)延伸反應(yīng)1、反應(yīng)體系(1)反應(yīng)體系的配制(25ul)FIP0.8uMBIP0.8uMF30.1uMB30.1uMEachdNTP400uMbetain1MTris-HCL20mmKCL10mm(NH4)2SO410mmMgSO44mmTritonX-1000.1%TargetDNA(2)變性退火將上述反應(yīng)體系(除酶外)在 95c 力口熱 5min 后，冷去|3,再力口入 8UPhi29DNA 聚合酶(3)等溫延伸參 63c 保溫延伸一定時(shí)間(4)終止反應(yīng)在高于 80c 的

10、溫度下加溫 2min,終止反應(yīng)。(六)PCR表 1PCRMix 配制加入量10PCRbuffer5uldNTP1ulM13-47(10um)1ulM13-48(10um)1ul模板 230bp0.5ulTaqPolymerase0.5ulH2O111ulTotal50ul（七）通過(guò)觀察白色沉淀的量來(lái)檢測(cè) LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物L(fēng)AMP 反應(yīng)階段，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，dNTP 會(huì)釋放出焦磷酸根離子，焦磷酸根離子遇到 Mg2+會(huì)生成焦磷酸鎂白色沉淀，一般情況下，生成的白色沉淀與反應(yīng)液中雙鏈 DNA 的量是成正比的，因此可以通過(guò)濁度儀檢測(cè)白色沉淀的量來(lái)定性反應(yīng)的進(jìn)行程度。只有當(dāng)反應(yīng)體系中 dNTP 的量達(dá)到

11、0.5M 時(shí)才有可能肉眼觀測(cè)到沉淀。另外，PCR 過(guò)程中不斷的 95c 熱變性也阻礙了焦磷酸鎂這一白色沉淀的生成。（八）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，SYBRGreenI 染色擴(kuò)增結(jié)束后，其最后的產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的 DNAt 段混合物，電泳后在凝膠上顯示不同大小區(qū)帶的階梯式圖譜。四、LAMP 優(yōu)點(diǎn)1、快速、高效因?yàn)椴恍枰A(yù)先的雙鏈 DNA 的熱變性，避免了溫度循環(huán)而造成的時(shí)間損失。 核酸擴(kuò)增在 1h 內(nèi)均可完成， 添加環(huán)狀引物后時(shí)間還可以節(jié)省 1/2 左右， 在 20-30min內(nèi)就可檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，1h 內(nèi)可擴(kuò)增出 109個(gè)靶序列拷貝，且產(chǎn)物可以達(dá)到 0.5mg/ml.2、高靈敏度對(duì)某些病毒的擴(kuò)增，模板可達(dá)幾個(gè)拷貝數(shù)即可，比 PCR 高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。3、高特異性因?yàn)槭轻槍?duì)靶序列的 6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的 4 種特異性引物，6 個(gè)區(qū)域中任何一處與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。4、產(chǎn)物檢測(cè)方便LAMP 在合成 DNA 的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的焦磷酸跟離子，它們能與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，因此可以根據(jù)反應(yīng)體系中是否生成白色沉淀來(lái)判斷反應(yīng)的進(jìn)行情況。5、操作簡(jiǎn)單LAMP 反應(yīng)只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫器，水浴鍋、金屬浴均可完成此操作