酶工程：2 酶的微生物發(fā)酵（酶學與酶工程）2學時

1、第二章 酶的生產酶的應用領域EnzymesDiagnosticIndustrialenzymesBasic ResearchTherapeuticsAgricultureStructuralstudies 本課程講授主要針對工業(yè)酶制劑酶的生產方法 動植物天然提取但動植物原料生長周期長、成本高，又受但動植物原料生長周期長、成本高，又受地理、氣候和季節(jié)等因素影響。地理、氣候和季節(jié)等因素影響。 野生菌發(fā)酵 基因工程菌(已經成為主流方法)目前工業(yè)應用酶大多數(shù)來自微生物，這是因為目前工業(yè)應用酶大多數(shù)來自微生物，這是因為以微生物為生產原料有許多優(yōu)點以微生物為生產原料有許多優(yōu)點微生物種類繁多；微生物種類繁多

2、； 產酶微生物多；產酶微生物多；一種微生物可以產多種酶；一種微生物可以產多種酶；微生物繁殖快、生產周期短、培養(yǎng)方便；微生物繁殖快、生產周期短、培養(yǎng)方便；微生物易改造，可通過多種手段進行育種。微生物易改造，可通過多種手段進行育種。微生物發(fā)酵產酶的工藝流程微生物發(fā)酵產酶的工藝流程酶的生產菌酶的生產菌 先決條件，直接影響發(fā)酵的生產成本先決條件，直接影響發(fā)酵的生產成本. .對生產菌的要求：對生產菌的要求：產酶量高，產酶量高，最好分泌胞外酶最好分泌胞外酶；容易培養(yǎng)和管理，能容易培養(yǎng)和管理，能利用廉價原料，發(fā)酵周期短利用廉價原料，發(fā)酵周期短。生產菌穩(wěn)定，不易變異、退化、不易感染噬菌體；生產菌穩(wěn)定，不易變異

3、、退化、不易感染噬菌體；非病源菌，非病源菌，同時在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關，不產毒素同時在系統(tǒng)發(fā)育上與病原菌無關，不產毒素及其他生理活性物質及其他生理活性物質；中國國家級菌種保藏管理中心（7個） 名稱及成立年份名稱及成立年份 依依 托托 單單 位位 中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國農業(yè)科學院土壤肥料研究所中國農業(yè)科學院土壤肥料研究所 (ACCC)1980 (ACCC)1980 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 (CICC)1979 (CICC)1979 中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心中國醫(yī)

4、學微生物菌種保藏管理中心 中國藥品生物制品檢定所中國藥品生物制品檢定所 (CMCC)1979 (CMCC)1979 中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 中國獸醫(yī)藥品檢定所中國獸醫(yī)藥品檢定所 (CVCC)1979 (CVCC)1979 中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心 中國林業(yè)科學研究院中國林業(yè)科學研究院 (CFCC)1985 (CFCC)1985 中國抗菌素菌種保藏管理中心中國抗菌素菌種保藏管理中心 中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所 (CACC)1979 (CACC)1979 中國普通微生物菌種保藏管理中心中

5、國普通微生物菌種保藏管理中心 中國科學院微生物研究所中國科學院微生物研究所 (CCGMC)1979 (CCGMC)1979 國外菌種中心American Type Culture CollectionAmerican Type Culture Collection Japan Collection of Microorganisms Japan Collection of Microorganisms http:/www.jcm.riken.go.jphttp:/www.jcm.riken.go.jpThe The Un

6、ited Kingdom National Culture United Kingdom National Culture collection collection http:/www.ukncc.co.ukhttp:/www.ukncc.co.ukDeutsche Sammlung von Mikroorganismen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen und Zellkulturen http:/www.dsmz.dehttp:/www.dsmz.deATCC ATCC 美國菌種中心，最大的菌種中美國菌種中心，

7、最大的菌種中心心, ,有病毒、細菌、真菌、細胞有病毒、細菌、真菌、細胞等不同的微生物等不同的微生物JCM JCM 日本微生物菌種中心日本微生物菌種中心英國國家菌種中心，英國國家菌種中心，Over 70,000 Over 70,000 micro-organisms and cell micro-organisms and cell lines are available. lines are available. 德國微生物與細胞收集中心德國微生物與細胞收集中心主要產酶菌（野生）枯草桿菌枯草桿菌：工業(yè)上應用最廣泛的產酶菌之一，淀粉酶、：工業(yè)上應用最廣泛的產酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷

8、酸酯酶等的產酶菌。葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶等的產酶菌。酵母：酵母：工業(yè)上廣泛應用。工業(yè)上廣泛應用。霉菌（黑曲、米曲、青霉、木霉和黃曲酶菌等）：霉菌（黑曲、米曲、青霉、木霉和黃曲酶菌等）：糖化糖化酶、蛋白酶、果膠酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、酶、蛋白酶、果膠酶、氨基?；浮⑵咸烟茄趸?、淀粉酶、氨基?；浮⒅久傅榷喾N酶。淀粉酶、氨基?；浮⒅久傅榷喾N酶。大腸桿菌：大腸桿菌：因為其遺傳背景清楚而廣泛應用于遺傳工程因為其遺傳背景清楚而廣泛應用于遺傳工程改造微生物的宿主，被改造成表達優(yōu)良性狀的改造微生物的宿主，被改造成表達優(yōu)良性狀的“工程工程菌菌”。也常在工業(yè)生產中應用于生產谷氨酸脫羧酶、。也常

9、在工業(yè)生產中應用于生產谷氨酸脫羧酶、門冬氨酸酶、限制性核酸內切酶等。門冬氨酸酶、限制性核酸內切酶等。主要產酶菌（基因工程菌） 米曲霉（真核系統(tǒng)） 木霉（真核系統(tǒng)） 酵母（真核系統(tǒng)），畢赤酵母是高效表達系統(tǒng)。 枯草桿菌（原核系統(tǒng)） 大腸桿菌（E. coli） （原核系統(tǒng)）蛋白質的糖基化限制了原核系統(tǒng)。酶合成的調節(jié) 原核部分為重點 真核生物的僅做了解 一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則 蛋白質蛋白質翻譯翻譯轉錄轉錄逆轉錄逆轉錄復制復制復制復制DNARNA （一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-轉錄轉錄(transcription) 定義定義 以以

10、DNADNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNARNA聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成RNARNA分分子的過程。子的過程。RNARNA合成過程合成過程起始起始雙鏈雙鏈DNA局部解開局部解開磷酸二酯磷酸二酯鍵形成鍵形成終止階段終止階段解鏈區(qū)到達解鏈區(qū)到達基因終點基因終點延長階段延長階段5 3 RNA 啟動子啟動子（promotor) 終止子終止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 離開離開 定義定義 以以mRNAmRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種體上通過

11、各種tRNAtRNA、酶和輔助因子的作用，合、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。成多肽鏈的過程。（二）蛋白質的生物合成（二）蛋白質的生物合成-翻譯翻譯(translation) 蛋白質的合成過程蛋白質的合成過程 （大腸桿菌）（大腸桿菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始v 肽鏈的延伸肽鏈的延伸v 肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放氨基酸的活化與轉運氨基酸的活化與轉運反應式：反應式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 對于對于E.co

12、liE.coli而言，肽鏈合成時的第一而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。二、酶生物合成的調節(jié)二、酶生物合成的調節(jié)定義：定義：通過調節(jié)酶合成的量來控制微生物通過調節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調節(jié)機制，是在基因轉錄水平上代謝速度的調節(jié)機制，是在基因轉錄水平上進行的。進行的。意義：意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。 操縱子操縱子基因表達的協(xié)同單位基因表達的協(xié)同單位操縱子操縱子結構基因結構基因（編碼蛋白質（編碼蛋白質, , structural gene, S）控制

13、部位控制部位操縱基因操縱基因（operator gene, O）啟動子啟動子（promotor gene, P）Jacob and Monod的的） 調節(jié)基因調節(jié)基因(regulator gene)： 可產生一種組成型可產生一種組成型調節(jié)蛋白調節(jié)蛋白(regulatory protein) ，通過與效應物通過與效應物(effector) （包括誘導物或輔阻遏物）（包括誘導物或輔阻遏物）的特異結合而發(fā)生變構作用，從而改變它與操縱基的特異結合而發(fā)生變構作用，從而改變它與操縱基因的結合力。因的結合力。 調節(jié)基因常位于調控區(qū)的上游。調節(jié)基因常位于調控區(qū)的上游?；虿倏v子調節(jié)系統(tǒng)示意圖基因操縱子調節(jié)系統(tǒng)

14、示意圖 調節(jié)基因調節(jié)基因 啟動基因啟動基因 操縱基因操縱基因 結構基因結構基因 DNA 轉錄轉錄 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 轉錄轉錄 翻譯翻譯 mRNA 翻譯翻譯 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白質蛋白質 誘導劑誘導劑 控制區(qū)控制區(qū) 信息區(qū)信息區(qū)操縱子操縱子RPOSD N AC RP-cA M P復 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP復合物的作用示意圖復合物的作用示意圖 啟動基因啟動基因（promotor gene）（）（啟動子）：啟動子）： 有兩個位點：有兩個位點： （1 1）RNARNA聚合酶的結合位點聚合酶的結合位點（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的結合位點。的結合

15、位點。CAPCAP：分解代謝產物基因活化蛋白：分解代謝產物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP復合物結合到啟動子的位點上，復合物結合到啟動子的位點上，RNARNA聚合酶才能結合到其在啟動子的位點上，酶的合成才聚合酶才能結合到其在啟動子的位點上，酶的合成才能開始。能開始。 操縱基因操縱基因（Operater gene）: : 位于啟動基因和結構基因之間的一段堿位于啟動基因和結構基因之間的一段堿基順序，能特

16、異性地與調節(jié)基因產生的變構基順序，能特異性地與調節(jié)基因產生的變構蛋白結合，操縱酶合成的時機與速度。蛋白結合，操縱酶合成的時機與速度。結構基因結構基因（Structural gene）: : 決定某一多肽的決定某一多肽的DNADNA模板，與酶有各自的模板，與酶有各自的對應關系，其中的遺傳信息可轉錄為對應關系，其中的遺傳信息可轉錄為mRNAmRNA，再翻譯為蛋白質。再翻譯為蛋白質。( (二二) ) 酶合成調節(jié)的類型酶合成調節(jié)的類型 1.1.誘導誘導 (induction) 組成酶：細胞固有的酶類。組成酶：細胞固有的酶類。 誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構

17、類似 物而臨時合成的一類酶。物而臨時合成的一類酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression) 反饋阻遏反饋阻遏(feedback repression) 酶合成誘導的現(xiàn)象：酶合成誘導的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： - -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； 透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實驗：實驗：（1 1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內無）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時，細胞內無上述三種酶合成；上述三種酶合成；（2 2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內有上述

18、三種）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時，細胞內有上述三種酶合成；酶合成； 表明菌體生物合成的經濟原則：表明菌體生物合成的經濟原則：需要時才合成需要時才合成。調節(jié)調節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結構基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 關關 閉閉啟啟動動子子ORPLacZLacYLaca調節(jié)調節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結構基因乳糖結構基因啟啟動動子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（無活性）（無活性） 基基 因因 表表達達mRNAA、乳糖操縱子的結構、乳糖操縱子的結構B、乳糖酶的誘導、乳糖酶的誘導 乳糖乳糖 阻遏蛋

19、白阻遏蛋白（有活性）（有活性） 2. 2.末端產物阻遏末端產物阻遏 由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現(xiàn)象：酶合成阻遏的現(xiàn)象： 實驗：實驗： （1 1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時， 檢測檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在；到細胞內有色氨酸合成酶的存在； （2 2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內色氨酸）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細胞內色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。合成酶的活性降低，直至消失。 表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌表明色氨酸的存

20、在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經濟原則體生長的經濟原則: :不需要就不合成不需要就不合成。 色氨酸操縱子色氨酸操縱子酶的阻遏酶的阻遏調節(jié)基因調節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達結構基因表達調節(jié)基因調節(jié)基因操縱基因操縱基因結構基因結構基因輔阻遏物輔阻遏物代謝產物與阻遏蛋白結代謝產物與阻遏蛋白結合，使之構象發(fā)生變化合，使之構象發(fā)生變化與操縱基因結合，結構與操縱基因結合，結構基基因不能表達因不能表達酶酶的的誘誘導導和和阻阻遏遏操操縱縱子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加誘導劑有活性阻遏蛋白加

21、誘導劑A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因操縱基因啟動基因啟動基因調節(jié)基因調節(jié)基因結構基因結構基因 阻遏蛋阻遏蛋白白(有活性有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表達結構基因不表達誘導物誘導物誘導物與阻遏蛋白結合誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達結構基因可以表達酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合阻遏蛋白不能跟操縱基因結合, 結構基因可以表達結構基因可以表達阻遏蛋白阻遏蛋白(無活性無活性)酶蛋白酶蛋白

22、mRNA代謝產物與阻遏蛋白結合代謝產物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達結構基因不表達代謝產物代謝產物調控方式調控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 與操縱基與操縱基因結合因結合阻遏效應阻遏效應舉例舉例酶的誘導酶的誘導有活性有活性不轉錄，不轉錄，繼而不翻譯繼而不翻譯誘導物誘導物轉錄，轉錄，繼而翻譯繼而翻譯乳糖操乳糖操縱子縱子酶的阻遏酶的阻遏無活性無活性阻遏物阻遏物不轉錄，不轉錄，繼而不翻譯繼而不翻譯色氨酸色氨酸操縱子操縱子酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調控作用對比酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調控作用對比3.3.分解代謝物阻遏分解代謝物阻

23、遏 指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現(xiàn)象。遏利用慢的底物的有關酶合成的現(xiàn)象。 分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 實驗：實驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利

24、用葡細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產生了兩個對數(shù)生長萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產生了兩個對數(shù)生長期中間隔開一個生長延滯期的期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現(xiàn)象二次生長現(xiàn)象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。02468020406080 細胞 濃 度(OD)時 間(h) 這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應，產生這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應，產生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。解乳糖酶系的合成。此調節(jié)基因的產此調節(jié)基因的產物是環(huán)腺

25、苷酸受體蛋白（物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRPCRP）, ,亦稱亦稱降解物基因活化蛋白（降解物基因活化蛋白（CAPCAP）。）。分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表達達CAP基因基因結構基因結構基因TCAPOCAP結結合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代謝產物謝產物腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與cAMP的關系的關系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene ac

26、tivation protein）降低降低cAMP濃度濃度使使CAP呈失活狀態(tài)呈失活狀態(tài)酶生產發(fā)酵工藝菌種篩選菌種篩選搖瓶試驗搖瓶試驗發(fā)酵罐試驗發(fā)酵罐試驗酶生產發(fā)酵工藝 培養(yǎng)基組成碳源、氮源、碳氮比、無機鹽、生長因子 pH值 溫度 溶解氧 誘導方式 阻遏解除 其它添加劑 發(fā)酵工藝的優(yōu)化 培養(yǎng)基：碳源、氮源、無機鹽和生長因子等； pH值：與細胞生長繁殖及發(fā)酵產酶都有密切關系，并且在細胞生長繁殖和代謝物產生過程中往往會發(fā)生變化，所以必須進行必要的調控。還可以此改變各種酶產量比。 溫度： 是影響細胞生長繁殖和發(fā)酵產酶的重要因素，不同細菌有各自不同的最適生長溫度，在發(fā)酵的不同階段培養(yǎng)基溫度變化明顯；產

27、酶最適溫度和細胞最適生長溫度不同 ，故必須經常及時地進行溫度調控。 溶解氧：根據(jù)細胞對溶解氧的需要量進行 連續(xù)不斷的無菌空氣供給，以使 培養(yǎng)基中的溶解氧維持在一定水 平，保證碳源有氧降解。發(fā)酵周期：作生長曲線和產酶曲線，確定放 罐時間，避免自溶。 總之，總之，優(yōu)良菌種的篩選、適宜條件的確定是獲優(yōu)良菌種的篩選、適宜條件的確定是獲得高產酶的重要措施，能較大幅度提高酶產量，盡得高產酶的重要措施，能較大幅度提高酶產量，盡量挖掘微生物的產酶潛力。但是措施是有限的，并量挖掘微生物的產酶潛力。但是措施是有限的，并且是經驗的，隨機性大，單靠這些措施很不夠。為且是經驗的，隨機性大，單靠這些措施很不夠。為了使酶產

28、量有一個飛躍，要采取另外一些有效措施。了使酶產量有一個飛躍，要采取另外一些有效措施。 2、采用添加誘導物、解除阻遏物、流加等技術 誘導酶：對于誘導酶的發(fā)酵生產，添加適量誘導物可使酶產量顯著提高；許多工業(yè)用酶都屬誘導酶。 誘導物：原理是，加入效應物與阻遏蛋白結合，阻止其與操縱基因結合，使結構基因得以表達；實際工作中，關鍵是選擇一個恰當?shù)恼T導物、確定誘導濃度及誘導時間。 誘導物一般有以下幾類： 難于被利用的底物，底物類似物或底物修飾物； 誘導物的前體； 胞外酶的作用產物； 誘導物添加的量和時間要通過實驗確定。 降低阻遏濃度 引起阻遏的原因有兩種： 尾產物阻遏：可去除尾產物或使其盡量少形成，如添加尾產 物類似物或抑制劑；采用營養(yǎng)缺陷型菌株并限 制其生長必需因子的供應。 分解代謝產物阻遏： A)、盡量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源； B)、流加。 表面活性劑促進分泌到胞外 細胞內酶含量提高到一定程度，會被胞內蛋白酶分解，加入表面活性劑之類促進分泌劑，可使胞內酶未被分解即被釋放到胞外。因為表面活性劑有助于改善細胞通透性，因而也可打破細胞內酶合成的“反饋平衡”。 常用：Tween-80、Triton x-100等。3