Patchclamp膜片鉗實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)資料

1、.Patch clamp膜片鉗實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)資料Patch clamp膜片鉗實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)資料2020-06-03 10：26歷史19761981年期間，兩位德國(guó)細(xì)胞生物學(xué)家Erwin和Bert Sakmann所創(chuàng)始的膜片鉗技術(shù)patch clamp technique為細(xì)胞生理學(xué)的研究帶來(lái)了一場(chǎng)革命性的變化.兩位科學(xué)家1991年榮獲諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).膜片鉗技術(shù)是經(jīng)微弱電流信號(hào)測(cè)量為根底的，利用玻璃微電極與細(xì)胞膜封接，可測(cè)量多種膜通道電流，其值可小到pA10-12A量級(jí)，是一種典型的低噪聲測(cè)量技術(shù).應(yīng)當(dāng)注意，為測(cè)量膜通道電流，必須將膜鉗制于某一固定的電位上.理論生物電信號(hào)測(cè)量根底電路中，根本組成元件為電

2、阻器R、電感器L和電容器C.在生物系統(tǒng)中，電流的值很微弱pA,10-12AnA,10-9A.當(dāng)細(xì)胞膜Na+通道開(kāi)放時(shí)，一毫秒有104Na+跨膜，相當(dāng)于1.6pA.生物測(cè)量電路中存在兩種導(dǎo)電機(jī)構(gòu)電子和離子，需特制的電極和導(dǎo)電液體作為二者導(dǎo)電的接口.生物體中的電阻器和電容器等元件，可用歐姆定律描繪，但呈嚴(yán)重非線性特性時(shí)，用曲線描繪.幾個(gè)根本定律：歐姆定律：電流I流經(jīng)一電阻R時(shí)，將在其兩端產(chǎn)生電位差V=IR基爾霍夫電流定律KCL：電路中，任何時(shí)刻，對(duì)任一節(jié)點(diǎn)，所以支路電流的代數(shù)和恒等于零.基爾霍夫電壓定律KVL：電路中，任何時(shí)刻，沿任一回路內(nèi)所有支路或元件電壓的代數(shù)和等于零.電導(dǎo)器：電導(dǎo)是電導(dǎo)器對(duì)電

3、流導(dǎo)電性能的電學(xué)量，用符號(hào)G表示，單位為西門子S.而電阻是電路中電阻器對(duì)電流呈現(xiàn)阻力的電學(xué)量，用符號(hào)R表示，單位為歐姆W.這兩個(gè)電學(xué)量具有互補(bǔ)意義，互為倒數(shù)，即G=1/R.一個(gè)無(wú)窮大的電阻，其電導(dǎo)為零.電容器：電容是儲(chǔ)存電荷的電容器的電學(xué)量，用符號(hào)C表示，單位為法拉F.電容器的電容量與極板面積成正比，與極板之間的間隔 成反比，還與絕緣層的介電性質(zhì)有關(guān).當(dāng)電容器兩極板之間施加電壓V時(shí)，那么所存儲(chǔ)的電荷Q=CV單位：C-法拉，V-伏特，Q-庫(kù)侖.細(xì)胞膜的電容常表示為每單位面積的電容量比電容，幾乎所有的脂質(zhì)雙分子層約有1mF/cm2的電容量.在電容器兩端外接電壓時(shí)，兩極板之間將產(chǎn)生電場(chǎng).細(xì)胞膜厚度約

4、為10nm，假設(shè)電壓為100mv，那么在膜產(chǎn)生很大的電場(chǎng)強(qiáng)度105V/cm.可被電壓門控型離子通道的敏感機(jī)構(gòu)所檢測(cè).細(xì)胞膜電路參數(shù)特征表述：脂質(zhì)雙分子層的介電特性可用電容C表示，離子通道那么用電導(dǎo)G表示.可興奮細(xì)胞膜的等效電路：根據(jù)基爾霍夫電流定律KCL，可有Im=ic+Ii=CmdVm/dt+Vm-Er/Rm=CmdVm/dt+GmVm-Er其中，Vm-膜電位V；Im-總膜電流；ic-電容電流；Ii-離子通道電流A/cm2；Rm-膜的比電阻W/cm2；Gm-膜的比電導(dǎo)S/cm2；Cm-膜的比電容F/cm2；Er-靜息電位，但某一離子形成Ii時(shí)，那么Er被平衡電位Ei對(duì)應(yīng)于離子i所替代.可見(jiàn)，

5、離子電流Ii取決于總的膜電導(dǎo)Gm與驅(qū)動(dòng)力勢(shì)Vm-Er的乘積.一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞膜的離子電流是單個(gè)電流之和，即Ii=INa+Ik+ICl+×.每種離子產(chǎn)生的電流分量如INa=GNaVm-ENa.微電極與導(dǎo)電溶液微電極是生物測(cè)量中的傳感器.從導(dǎo)電角度來(lái)看，某些含水的離子溶液，如血液，胞漿及海水均遵守歐姆定律.電流由兩種離子運(yùn)載，即陽(yáng)離子和陰離子.當(dāng)電流流過(guò)細(xì)胞膜離子通道時(shí)，選擇性由一部分離子運(yùn)載.電極上的電子與溶液中的離子進(jìn)展變換可能會(huì)出現(xiàn)誤差.常用電極為銀/氯化銀電極.細(xì)胞膜離子通道分類電壓門控通道：膜受體門控通道：胞內(nèi)第二信使激活的通道：通道電流的記錄形式recording config

6、uration細(xì)胞貼附式：用于單通道記錄全細(xì)胞記錄式：研究胞內(nèi)第二信使時(shí)有著特殊的優(yōu)勢(shì)但破膜后細(xì)胞變形，影響記錄結(jié)果，可用穿孔膜片鉗技術(shù)膜外朝外式：用于單通道記錄膜內(nèi)朝外式：用于單通道記錄膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的組成機(jī)械部件：防震工作臺(tái)，屏蔽罩，儀器設(shè)備架光學(xué)部件：顯微鏡，視頻監(jiān)視器，單色光系統(tǒng)電子部件：膜片鉗放大器，刺激器，數(shù)據(jù)采集設(shè)備，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)微操縱器：機(jī)械式，機(jī)電式，液壓式玻璃微電極工藝玻璃毛坯管：有軟玻璃蘇打玻璃，電石玻璃和硬玻璃硼硅玻璃，鋁硅玻璃，石英玻璃之分.軟玻璃熔點(diǎn)低，易拋光，但1KHz的電導(dǎo)率是膜片記錄的主要熱噪聲源有較大的介電松弛特性硬玻璃拉制后有較窄的末梢較高的電阻；硼硅和硅硅

7、玻璃有較好的噪聲和介電松弛特性；石英玻璃特別適用于低噪聲記錄，但需激光源拉制.玻璃微電極拉制工藝：垂直式拉制儀，程度拉制儀電極熔鍛儀和優(yōu)化處理：一是為減小電極內(nèi)部與溶液之間的電容電極末梢數(shù)微米涂敷疏水材料硅酮樹(shù)脂，以阻止液膜上爬；二是為了對(duì)電極尖端作優(yōu)化處理熱拋光使電極尖端光滑，以進(jìn)步封接成功率.電極流灌：為防止灰塵污染，置有蓋容器內(nèi)并需23小時(shí)內(nèi)使用；電極內(nèi)液充灌前最好用濾紙過(guò)濾.電極夾持器：可用甲醇清洗保持清潔浴池電極：浴池電極應(yīng)該有一個(gè)穩(wěn)定的電極電位并且不擾亂浴液成分.通常裸露的Ag/AgCl絲作為一種良好的浴池電極.然而Ag+僅能為某些細(xì)胞所承受，需用瓊脂鹽橋改善.技術(shù)膜片鉗的工作形式

8、operating mode電壓鉗形式voltage clamp,VC：電流鉗形式current clamp,CC：用恒定的或者時(shí)變的電流作用于細(xì)胞，測(cè)量作用電流引起的膜電位的變化.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作細(xì)胞活性狀態(tài)：活細(xì)胞壽命比較短溶液準(zhǔn)備：一般來(lái)說(shuō)，浴液模擬自然的胞外環(huán)境，電極內(nèi)液取代細(xì)胞溶質(zhì)胞液.胞外用浴液以公升為單位存放于冰箱，胞內(nèi)用液以小容量510ml為單位凍存，實(shí)驗(yàn)前解凍.必須注意pH值和浸透壓，亦需過(guò)濾.某些實(shí)驗(yàn)前的短時(shí)間內(nèi)，需要向小容積100500ml的電極充灌液中補(bǔ)加凍存物如ATP,GTP,熒光染料，多種第二信使等到一個(gè)Eppendorf管.實(shí)驗(yàn)步驟：兩個(gè)重要環(huán)節(jié)高阻封接：電極與細(xì)胞

9、膜形成封接的過(guò)程，可用示波器來(lái)觀測(cè)當(dāng)對(duì)電極施加一脈沖電壓時(shí)的電極電流.在電極未入液前，可觀測(cè)到一平坦的電流波形，混雜有電極和夾持器的雜散電容所形成的瞬態(tài)電流；當(dāng)電極入液后，2mV的脈沖將產(chǎn)生1mA的電流通過(guò)約2MW的電極.當(dāng)電極趨近細(xì)胞膜，并形成吉?dú)W封接，將進(jìn)一步增加電極電阻和減小電極電流.為證實(shí)吉?dú)W封接的形成，可增加放大器的增益，觀察到除脈沖電壓的首尾兩端電容性脈沖尖端電流外，電流波形仍呈平坦?fàn)?數(shù)據(jù)記錄：以全細(xì)胞記錄為例吸破膜片：負(fù)壓或高電壓脈沖參數(shù)補(bǔ)償：從電路角度觀察，當(dāng)施加脈沖電壓時(shí)，電極入口處因電極電容，入口電阻和膜電容的存在，構(gòu)成一個(gè)較復(fù)雜的RC網(wǎng)絡(luò).當(dāng)外加測(cè)試脈沖電壓或命令電壓時(shí)

10、，將產(chǎn)生瞬態(tài)電流響應(yīng)，嚴(yán)重干擾預(yù)期的測(cè)試結(jié)果.因此實(shí)驗(yàn)記錄之前需要進(jìn)展參數(shù)補(bǔ)償，以獲得實(shí)際的結(jié)果.為了消除這些參數(shù)的瞬態(tài)影響，膜片鉗放大器均設(shè)有補(bǔ)償電路.快電容補(bǔ)償：電極電容Cp極小，僅幾個(gè)pF，相應(yīng)的電路時(shí)間常數(shù)很小，故對(duì)于Cp瞬態(tài)補(bǔ)償稱之.慢電容補(bǔ)償：細(xì)胞膜電容約為1mF/cm2，此時(shí)的充電電流需流經(jīng)串聯(lián)電阻Rs約幾MW，時(shí)間常數(shù)較大約100mS，故Cm的補(bǔ)償稱為慢電容補(bǔ)償.串聯(lián)電阻補(bǔ)償：串聯(lián)電阻跨接于Cp與Cm之間，當(dāng)有電流經(jīng)過(guò)時(shí)，產(chǎn)生可觀的壓降如Rs=5MW，Ip=2mA，其導(dǎo)致鉗制電位誤差達(dá)10mV.因此需要消除這種誤差的電路措施.數(shù)據(jù)記錄：設(shè)置適當(dāng)?shù)姆糯笃鞯膸挶揪眄氈芤海涸〕睾?/p>

11、電極溶液浸透壓和pH值；浴液中的二價(jià)離子具有屏蔽外表膜電荷的作用；許多有機(jī)化合物不易溶于水；氯離子Cl-是水溶液和Ag/AgCl絲電極之間的主要電荷傳遞離子電子導(dǎo)電和離子導(dǎo)電的接口作用；失調(diào)電壓放大器的失調(diào)電壓，電極電位，液結(jié)電位等；電極流灌液補(bǔ)加ATP等以維持細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或某些離子電流的衰減；來(lái)自于容器，注射器，管子，針具及非高純度化學(xué)試劑的污染.電極：電極本身的AgCl涂層受損；電極與生理鹽水之間的電位問(wèn)題電極有氣泡?電極與探頭虛接?浴池電極未接通等數(shù)據(jù)采集：存在問(wèn)題有泄漏校正，保持電位的選擇和刺激方案，采樣頻率的正確選擇和濾波器設(shè)置.應(yīng)用單通道電流記錄技術(shù)細(xì)胞貼附式記錄形式：細(xì)胞貼附式是

12、最早使用的記錄形式.由于單通道電流非常微弱，因此抑制噪聲非常重要.膜片鉗系統(tǒng)中的噪聲成分除電子儀器噪聲，電極噪聲外，尚有封接噪聲.因此高阻封接或吉?dú)W封接是技術(shù)關(guān)鍵.為實(shí)現(xiàn)高阻封接，必須注意：細(xì)胞膜外表光潔，浴液干凈無(wú)雜質(zhì)和灰塵污染；電極材料宜用硬質(zhì)玻璃，最好拋光并涂硅酮樹(shù)脂以改進(jìn)介電特性，降低噪聲；詳細(xì)封接技術(shù)經(jīng)歷非常重要電極尖粘污灰塵；電極僅用一次；酶處理細(xì)胞浴液外表殘?jiān)?；電極內(nèi)液含Ca2+，那么必須用HEPES緩沖液，以防止其與磷酸鹽形成結(jié)晶；低浸透的10%電極溶液比較容易形成高阻封接.離體膜片的單通道電流記錄在細(xì)胞貼附式記錄形式根底上，派生出的膜外朝外式和膜內(nèi)朝外式，因只剩下一個(gè)微小而獨(dú)

13、立的膜片，故稱之為離體膜片cell-free patch.此時(shí)細(xì)胞內(nèi)，外環(huán)境均可人工控制，自由地對(duì)膜片上的單一離子通道進(jìn)展調(diào)控和實(shí)驗(yàn)研究.離子通道的辨識(shí)可以通過(guò)門控機(jī)制，藥物激活或阻塞來(lái)辨識(shí).單一離子電流的記錄數(shù)據(jù)所有的離子通道的開(kāi)放和關(guān)閉處于一種隨機(jī)和突變性的狀態(tài).也就是說(shuō)，通道在導(dǎo)通和非導(dǎo)通兩種狀態(tài)下隨機(jī)變化，其開(kāi)放關(guān)閉概率由跨膜電壓或配體結(jié)合所控制.從數(shù)學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，這種特性是非確定的，不能用確切的明顯的數(shù)學(xué)方程來(lái)描繪.而只有用隨機(jī)分析方法來(lái)處理閾值檢測(cè)法；直方圖-幅度直方圖和開(kāi)關(guān)持續(xù)時(shí)間直方圖.全細(xì)胞記錄技術(shù)根本實(shí)驗(yàn)步驟：進(jìn)展全細(xì)胞記錄whole-cell recording,WCR時(shí)，

14、電極內(nèi)液應(yīng)是低Ca2+的.電極尖端與細(xì)胞膜接觸并形成吉?dú)W封接使膜吸穿后，電極電位隨即變?yōu)樨?fù)值.將幅值幾毫伏的階躍電壓通過(guò)電極作用于細(xì)胞膜，立即出現(xiàn)電容暫態(tài)響應(yīng).調(diào)節(jié)C-fast以消除電極電容快電容引起的暫態(tài)誤差.對(duì)電極內(nèi)腔施加一脈沖負(fù)壓，直到細(xì)胞膜封接區(qū)吸破，以致電流大增，噪聲也加大.進(jìn)展膜電容補(bǔ)償.一旦WCR形式形成之后，可將微電極略微提升以減輕對(duì)細(xì)胞的壓力.WCR實(shí)驗(yàn)可持續(xù)至少1小時(shí)而無(wú)衰變現(xiàn)象.假設(shè)細(xì)胞緊貼培養(yǎng)皿，移開(kāi)微電極時(shí)，有可能形成膜外朝外式.可以開(kāi)拓應(yīng)用：1.此方法對(duì)所選定細(xì)胞產(chǎn)生最少的膜損傷，而到達(dá)改變細(xì)胞內(nèi)液目的；2.僅需更換微電極對(duì)某一細(xì)胞進(jìn)展連續(xù)的不同內(nèi)液的全細(xì)胞記錄；3

15、.借助此方法可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得宏觀的和單通道的數(shù)據(jù).全細(xì)胞記錄形式中的電極充灌：標(biāo)準(zhǔn)的電極內(nèi)液：pH緩沖液10mMHEPES，調(diào)節(jié)pH2.4；Ca緩沖液10mM EGTA+1mM Ca，給定Cai 10nM；MgATP2mM；使ATP酶保持活性；自由Mg2+1mM，在許多胞液過(guò)程中，作為一種輔助因子；GTP0.1mM用于涉及研究G蛋白的實(shí)驗(yàn).ATP和GTP是不穩(wěn)定的.電極內(nèi)液含有核苷酸時(shí)應(yīng)將其保持在冰凍狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，融化了液體必須置于冰塊上.對(duì)于長(zhǎng)程記錄30min，應(yīng)使用ATP再生式系統(tǒng)，以防止ATP在電極中衰減.細(xì)胞通常含有谷胱甘肽，K+和Na+通道的失活依賴于電極內(nèi)液的氧化復(fù)原電位，

16、應(yīng)當(dāng)灌注5mM谷胱甘肽以防止產(chǎn)生異?，F(xiàn)象.谷氨酸鹽，MOPS和羥乙磺酸鹽可替代胞內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)陰離子Cl-以保持負(fù)平衡電位.F-也可作為胞內(nèi)陰離子，也穿透Cl-可通透的通道.F-優(yōu)于Cl-地方在于形成封接和記錄的穩(wěn)定性.F-與Al3+形成AlF4，它是一種G蛋白有效激活劑；F-也是一種Ca2+緩沖劑，干預(yù)Ca依賴性過(guò)程.因此對(duì)于涉及G蛋白和胞內(nèi)信使的過(guò)程，使用F-是不適宜的.穿孔膜片鉗技術(shù)：為抑制某未知因子進(jìn)入電極而使細(xì)胞功能被沖洗的缺點(diǎn)，在細(xì)胞貼附形式下，應(yīng)用穿孔劑而形成穿孔膜片鉗perforated patch clamp.胞內(nèi)的關(guān)鍵擴(kuò)散分子不能跨越膜上生成的孔道以防止沖洗現(xiàn)象的發(fā)生.常用穿孔劑：

17、制霉菌素Nystatin和兩性霉素Amphotericin BNystatin是一種多烯抗生素類藥物.Nystatin孔道具有特殊的性質(zhì).Nystatin對(duì)細(xì)胞封接的抑制作用封接時(shí)電極尖端不能有穿孔劑.Nystatin不溶于水，對(duì)光線敏感溶液必須進(jìn)展超聲處理和光屏蔽.全細(xì)胞記錄技術(shù)的應(yīng)用：離子通道宏觀性質(zhì)的分析離子通道的性質(zhì)和分類-電壓門控通道，膜受體激活通道，配體門控通道，胞內(nèi)第二信使激活通道等；離子通道微觀性質(zhì)分析單一離子通道活動(dòng)的測(cè)定，離子通道的構(gòu)造，分布和機(jī)能分布等；膜電容的測(cè)量及其對(duì)細(xì)胞分泌活動(dòng)的研究；胞內(nèi)鈣離子濃度和鈣通道電流的同時(shí)定量檢測(cè)；組織切片的全細(xì)胞記錄；植物細(xì)胞的電生理研

18、究.重要概念小結(jié)：全細(xì)胞記錄技術(shù)是四種記錄形式中應(yīng)用最廣泛的一種.建立全細(xì)胞形式的電路模型，可以對(duì)其功能進(jìn)展電學(xué)分析，包括暫態(tài)分析，其時(shí)間常數(shù)近似為t=RsCm.對(duì)于復(fù)雜的神經(jīng)細(xì)胞分析，可以采用分段建模的概念來(lái)解決.在全細(xì)胞記錄形式中，電極內(nèi)液與胞液之間的物質(zhì)擴(kuò)散與平衡，同樣可以用分段建模的化學(xué)方法來(lái)分析.穿孔膜片鉗是全細(xì)胞記錄的派生形式，可以防止細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的流失而影響其功能.腦切片膜片鉗技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需酶處理；應(yīng)用高分辨率的記錄技術(shù)在可分辨的神經(jīng)元進(jìn)展試驗(yàn)組織構(gòu)造相對(duì)完好；可與其它方法結(jié)合胞內(nèi)離子熒光測(cè)量，常規(guī)熒光成像，共聚焦激光掃描成象，多光子激光掃描成像腦切片腦切片的制備與維護(hù)斷頭開(kāi)顱切腦

19、區(qū)置冰冷充氧鹽水1min組織冷卻10min修剪組織粘貼到切片臺(tái)，并冰液覆蓋振動(dòng)切片60400mm,10min切片孵育備用25以下，10h以內(nèi)，實(shí)驗(yàn)用3237孵育約30min也可37孵育約30min后轉(zhuǎn)入25備用腦組織的不同部位制備切片原那么-保持神經(jīng)元活性和樹(shù)突不受損傷；根據(jù)所要研究的神經(jīng)細(xì)胞確定切片的定位方向動(dòng)物的品種與年齡新生動(dòng)物-顱骨軟，方便快速取出腦組織；腦組織小，置入冰冷生理鹽水冷卻快成年動(dòng)物-腦組織堅(jiān)韌，對(duì)缺氧敏感；組織髓鞘質(zhì)多易致切片損傷腦切片膜片鉗記錄技術(shù)儀器設(shè)備樣品器皿，記錄腔，鉑金絲，顯微鏡差分干預(yù)比照度顯微鏡DIC differential interference co

20、ntrast或亮場(chǎng)光學(xué)顯微鏡BFO bright-field optics采用長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外線可進(jìn)步分辨率電極內(nèi)液和外液的配制標(biāo)準(zhǔn)電極外液：mM,NaCl 125,KCl 2.5,CaCl2 2,MgCl2 1,NaH2PO4 1.25,NaHCO3 26,葡萄糖20標(biāo)準(zhǔn)電極內(nèi)液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膍M,KCl 140,MgCl2 2,CaCl2 1,EGTA 10,ATP 2,HEPES 10切片上神經(jīng)元和神經(jīng)蝕質(zhì)細(xì)胞的辨識(shí)視覺(jué)辨識(shí)：淺表細(xì)胞-顯微鏡下直接辨識(shí)；深層細(xì)胞-IR-DIC顯微鏡觀察也局限于4-050mm熒光染料標(biāo)記：染料從全細(xì)胞記錄微電極注入；也可細(xì)胞浴液滲入.記錄前的準(zhǔn)備工作細(xì)胞清洗：對(duì)較深在的細(xì)胞，可用流體沖洗方法.選擇細(xì)胞：好的細(xì)胞外表光滑，比照度好.記錄用電極：電極相對(duì)細(xì)長(zhǎng)以防止與物鏡相觸.電極阻值過(guò)大難于破膜，入口電阻串聯(lián)電阻Rs大，也限制電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)部之間的物質(zhì)交換.幾種記錄形式舉例細(xì)胞貼附式：全細(xì)胞記錄：膜外朝外式：雙電極記錄：腦切片膜片鉗技術(shù)與其它方法的結(jié)合常規(guī)成像技術(shù)紫外光源UV照射到切片的某一區(qū)域.細(xì)胞載入熒光染料Fura-2后，其反射光特性發(fā)生變化.檢測(cè)器可用CCD攝像機(jī)或光電倍增管PMT，均可測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，熒光強(qiáng)度與鈣通道電流.CCD的優(yōu)點(diǎn)在于可以獲得被測(cè)細(xì)胞神經(jīng)元各個(gè)部分的圖像