細(xì)胞增殖檢測(cè)(08碩)

1、細(xì)胞增殖活性與凋亡的形態(tài)學(xué)檢細(xì)胞增殖活性與凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法測(cè)方法華中科技大學(xué)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院病理研究所同濟(jì)醫(yī)院病理研究所 阮秋蓉阮秋蓉n細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖n細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞增殖檢測(cè)細(xì)胞增殖檢測(cè)Methods for studying cell proliferation and viability in cell populations細(xì)胞周期細(xì)胞周期 細(xì)胞周期（細(xì)胞周期（cell cycle)是指細(xì)胞從前是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程，分為間期與分裂為止的活動(dòng)過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。期兩個(gè)階段。n（一）（一） 間期：分

2、為三期、即間期：分為三期、即DNA合成前期合成前期（G1）、）、DNA合成期（合成期（S）與）與DNA合成后合成后期（期（G2）。）。n（二）分裂期（二）分裂期 ：細(xì)胞的有絲分裂（：細(xì)胞的有絲分裂（M）需）需經(jīng)前、中、后，末期，是一個(gè)連續(xù)變化過經(jīng)前、中、后，末期，是一個(gè)連續(xù)變化過程，由一個(gè)母細(xì)胞分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。程，由一個(gè)母細(xì)胞分裂成為兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞增殖檢測(cè)方法細(xì)胞增殖檢測(cè)方法 目前主要有兩種檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的方法。目前主要有兩種檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的方法。n直接方法直接方法: 通過直接測(cè)定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來通過直接測(cè)定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。（評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。（DNA sy

3、nthesis）n間接方法間接方法: 細(xì)胞活力檢測(cè)方法，通過檢測(cè)樣品細(xì)胞活力檢測(cè)方法，通過檢測(cè)樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。中健康細(xì)胞的數(shù)目來評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。（ metabolic activity）n直接方法直接方法: 胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法）滲入法 Brdu檢測(cè)法檢測(cè)法n間接方法：間接方法： MTT檢測(cè)法檢測(cè)法 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測(cè)法檢測(cè)法(一一)胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法）滲入法n胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，是DNA合成的必需物質(zhì)。n用同位素3H標(biāo)記Td

4、R即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DAN的代謝及細(xì)胞增殖情況。n但是具有放射性。(二二) Brdu檢測(cè)法檢測(cè)法n為常用的方法。為常用的方法。n用用BrdU（ 5-溴脫氧尿嘧啶核苷）預(yù)處理的細(xì)溴脫氧尿嘧啶核苷）預(yù)處理的細(xì)胞中，胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的可代替胸腺嘧啶核苷插入復(fù)制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并 帶到子代細(xì)胞中。帶到子代細(xì)胞中。n細(xì)胞經(jīng)過固定和變性處理后，可用免疫學(xué)方法細(xì)胞經(jīng)過固定和變性處理后，可用免疫學(xué)方法檢測(cè)檢測(cè)DNA中中BrdU的含量（如采用鼠抗的

5、含量（如采用鼠抗BrdU單單克隆抗體特異識(shí)別克隆抗體特異識(shí)別BrdU,再采用辣根過氧再采用辣根過氧 化酶化酶標(biāo)記的山羊抗鼠標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗標(biāo)記，最后用比色法二抗標(biāo)記，最后用比色法或熒光的方法進(jìn)行定量測(cè)定），從而判斷細(xì)胞或熒光的方法進(jìn)行定量測(cè)定），從而判斷細(xì)胞的增殖能力。的增殖能力。間接方法間接方法n在一些情況下，細(xì)胞活力的檢測(cè)相當(dāng)于細(xì)胞增殖能力的測(cè)定。n主要采用特殊的試劑MTT MTT及其他四唑鹽來測(cè)定細(xì)胞的代謝活力，通過檢測(cè)細(xì)胞的氧化還原活性來檢測(cè)細(xì)胞增殖能力.(三三)MTT檢測(cè)法檢測(cè)法nMTT檢測(cè)法主要反映細(xì)胞的能量代謝，是檢測(cè)細(xì)胞增殖活力的一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的方法。n其原理是在活細(xì)胞生

6、長(zhǎng)和增殖過程中，線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲臜（Formazan），生成的甲臜量的多少與細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞的活力成正比 (四四)羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測(cè)法）檢測(cè)法n羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團(tuán)和具有非酶促水解作用的羥基熒 光素二醋酸鹽基團(tuán)，使CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。nCFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。n當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子 代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。n在一個(gè)

7、增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè) 通道可對(duì)其進(jìn)行分析。細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法n細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。n細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系 列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程。區(qū)別點(diǎn)細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死起因生理或病理性病理性變化或劇烈損傷范圍單個(gè)散在細(xì)胞大片組織或成群細(xì)胞細(xì)胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體破損染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀呈絮狀細(xì)胞器無明顯變化腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解細(xì)胞體積

8、固縮變小腫脹變大凋亡小體有，被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬無，細(xì)胞自溶，殘余碎片被巨噬細(xì)胞吞噬基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀隨機(jī)降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質(zhì)合成有無調(diào)節(jié)過程受基因調(diào)控被動(dòng)進(jìn)行炎癥反應(yīng)無，不釋放細(xì)胞內(nèi)容物有，釋放內(nèi)容物。 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征n1形態(tài)學(xué)變化n2生物化學(xué)變化1）DNA的片段化 2） 大分子合成（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)n 1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡n 2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡n 3 透射電子顯微鏡觀察n 4 TUNEL法 DNA片斷化檢測(cè)片斷化檢測(cè) n細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA

9、在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。 TUNEL法法 n細(xì)胞凋亡中細(xì)胞凋亡中, 染色體染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)末端

10、，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物過氧化物 酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到到DNA的的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法標(biāo)記法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL（TdT mediated dUTP nick end labeling）。由）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因的斷裂，因而沒有而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。形成，很少能夠被染色。nTUNEL是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合 的研究的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化