蛋白質(zhì)的分離、純化ppt課件

1、第六章第六章 蛋白質(zhì)的分別、純化和表征蛋白質(zhì)的分別、純化和表征一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)中的功能團(tuán) 末端NH2 末端COOH 側(cè)鏈基團(tuán) 所以，蛋白質(zhì)的化學(xué)物理性質(zhì)AA A蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，能和酸或堿發(fā)生作用。B蛋白質(zhì)分子的可解離基團(tuán)來自側(cè)鏈上的功能團(tuán)。C結(jié)合蛋白質(zhì) 輔基成分包含可解離蛋白質(zhì)D末端-COOH, -NH2E蛋白質(zhì)分子中可解離基團(tuán)的pK和游離AA中相應(yīng)基團(tuán)的pK值完全不一樣。在蛋白質(zhì)分子中遭到臨近電荷的影響F蛋白質(zhì)可看作一個(gè)多價(jià)離子 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)-在某一pH值，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，凈電荷為零。這一pH稱為蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 等離子點(diǎn)-沒有其他鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基

2、團(tuán)界離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子 受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH稱等離子點(diǎn)。特征常數(shù)。二蛋白質(zhì)分子的大小與外形 利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量 蛋白質(zhì)在各種介質(zhì)中PAGE電泳時(shí)，它的遷移率 這樣呵斥兩個(gè)后果：SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上一樣密度的負(fù)電荷超越蛋白質(zhì)原有的電荷量，因此掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此，一切SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時(shí)均以同樣的電荷/蛋白質(zhì)比向正極挪動(dòng)。 改動(dòng)了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。 SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長軸長度那么隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。電泳遷移率與多肽鏈分子量的對(duì)

3、數(shù)有以下關(guān)系( (七七) ) 毛細(xì)管電泳測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量毛細(xì)管電泳測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳CECE那么可以在很大那么可以在很大程度上抑制常規(guī)方法時(shí)間長、靈敏芽低程度上抑制常規(guī)方法時(shí)間長、靈敏芽低不利情況。用毛細(xì)管電泳測定蛋白質(zhì)分不利情況。用毛細(xì)管電泳測定蛋白質(zhì)分子量僅需求納克量蛋白質(zhì)，而且還可以子量僅需求納克量蛋白質(zhì)，而且還可以用積分儀或電腦聯(lián)機(jī)準(zhǔn)確定量。用積分儀或電腦聯(lián)機(jī)準(zhǔn)確定量。 ( (八八) )質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量 質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量是近年來開質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量是近年來開展的一項(xiàng)新技術(shù)，其分辨率和準(zhǔn)確度都展的一項(xiàng)新技術(shù)，其分辨率和準(zhǔn)確度都較前

4、幾項(xiàng)技術(shù)高。尤其近幾年開展起來較前幾項(xiàng)技術(shù)高。尤其近幾年開展起來的磁質(zhì)譜可準(zhǔn)確測定分子質(zhì)量的磁質(zhì)譜可準(zhǔn)確測定分子質(zhì)量2000Da2000Da以以下的多肽；而電噴霧質(zhì)譜下的多肽；而電噴霧質(zhì)譜ESIESI可以可以測測5 5萬萬DaDa的蛋白質(zhì)，而且只需求皮摩爾的蛋白質(zhì)，而且只需求皮摩爾pmolpmol量的蛋白質(zhì)，準(zhǔn)確度為量的蛋白質(zhì)，準(zhǔn)確度為0.01%0.01%。三蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀1蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液是分散系統(tǒng)：分散相是蛋白質(zhì)分子顆粒，分散介質(zhì)是水。分散程度-膠體系統(tǒng)分散相質(zhì)點(diǎn)-真溶液質(zhì)點(diǎn)是分子，均相系統(tǒng) 分散程度-以分散相質(zhì)點(diǎn)的直徑來衡量 根據(jù)分散程度： 分散相質(zhì)點(diǎn)在膠體系統(tǒng)中

5、堅(jiān)持穩(wěn)定需三個(gè)條件：a 分散相質(zhì)點(diǎn)1-100nmb 分散相質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，相互排斥不聚成顆粒而沉淀c 分散相的質(zhì)點(diǎn)能與溶劑構(gòu)成溶劑化層蛋白質(zhì)： a. 膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍 c 丁達(dá)爾效應(yīng)d 布朗運(yùn)動(dòng)e 不能透過半透膜2蛋白質(zhì)的沉淀 沉淀蛋白質(zhì)的方法： 鹽析法： 中性鹽NH4SO4，NaSO4，Nacl等 蛋白質(zhì)脫去水化層優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白量變性 有機(jī)溶劑沉淀法：極性有機(jī)溶劑甲醇，乙醇，丙酮脫去水化層以及降低介電常數(shù)而添加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用 條件：低溫操作 縮短時(shí)間 重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液pHpI,蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷,易與重金屬離子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀用途：搶救誤服重金

6、屬鹽的病人生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑能引起生物堿沉淀的一類試劑 當(dāng)溶液pHpI 蛋白質(zhì)帶電，溶解度較大pHpI 1 不同蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同 pI時(shí)溶解度最低將蛋白質(zhì)彼此分開2蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析 中性鹽對(duì)球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響低濃度時(shí)，中性鹽可以添加蛋白質(zhì)的溶解度 鹽溶作用機(jī)理：蛋白質(zhì)吸附鹽類離子，帶電表層使蛋白質(zhì)分子被此排斥，蛋白質(zhì)與水分子的作用加強(qiáng)，溶解度提高。同樣濃度摩爾數(shù)/升的兩價(jià)離子的中性外，如MgCl2 NH42SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響效果，要比單價(jià)離子的中性鹽如NaCl,NH4Cl大得多。 鹽析當(dāng)離子強(qiáng)度添加到足夠高時(shí)，eg.飽和或半飽和程度，很多蛋白質(zhì)從水溶液中沉

7、淀出來，這種景象叫鹽析。原理大量中性鹽的參與，使水的活度降低，原來的溶液中的大部分自在水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子外表的水化層。 鹽析法分別、提純常用方法。堅(jiān)持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。NH42SO43.有機(jī)溶劑分級(jí)法作用原理：.有機(jī)溶劑的參與改動(dòng)了介質(zhì)的介電常數(shù)，添加了兩個(gè)相反電荷之間的吸引力，。蛋白質(zhì)的外表可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。.有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的構(gòu)成并沉淀。 聚乙二醇水溶性非離子聚合物可致使蛋白質(zhì)沉淀。原理：脫去蛋白質(zhì)的水化層；聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水基團(tuán)發(fā)生相互作用，并在空間上妨礙

8、蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度與鹽濃度，pH，及絕對(duì)溶解度無關(guān)。其溶解度依賴于聚乙二醇的分子量。4溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響。 0-40攝氏度 大部分球狀蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增大40-50攝氏度 大部分蛋白量變得不穩(wěn)定,開場變性大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定,蛋白質(zhì)的操作在0攝氏度或更低溫度下進(jìn)展. 糜蛋白酶糜蛋白酶, ,胰蛋白酶及其前體的制備胰蛋白酶及其前體的制備 (三)根據(jù)電荷不同的分別方法 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分別蛋根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分別蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。 1 1電泳電泳 在外

9、電場的作用下，帶電顆粒，例如在外電場的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電形狀的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電不處于等電形狀的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電性相反的電極挪動(dòng)，這種景象稱電泳性相反的電極挪動(dòng)，這種景象稱電泳(elecctropHoresis)(elecctropHoresis)或離子泳或離子泳(ionpHoresis)(ionpHoresis)。 或從方法學(xué)的角度給電泳下定義，電泳是在外電場存在下，利用分子攜帶的凈電荷不同分別分子混合物的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋曰質(zhì)、核苷酸和核酸等生物分子的分別分析和制備。 帶電顆粒在電場中的泳動(dòng)速度主要決議于它所帶的凈電荷量以及顆粒的大小和外

10、形。顆粒在電場中發(fā)生泳動(dòng)時(shí)，將遭到兩種方向相反的力的作用：F(電場力)=qE(=qU/s)Ff(摩擦力)=fv這里，q顆粒所帶的電量E電場強(qiáng)度或電勢梯度U/qU兩電極間的電勢差(以伏特表示)S= 兩電板之間間隔(以厘米表示)f摩擦系數(shù)(與顆粒的外形，大小和介質(zhì)的粘度有關(guān))v顆粒泳動(dòng)速度(以厘米秒表示 當(dāng)顆粒以恒穩(wěn)速度挪動(dòng)時(shí)，那么F-Ff=0，因此，qE=Fv，即，v/E=q/f 在一定的介質(zhì)中對(duì)其一種蛋白質(zhì)禾說，q/F是一個(gè)定值，因此v/E月也是定值，它被稱為遷移率或泳動(dòng)度：u=v/Eu值可以經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測得，蛋白質(zhì)的u值為0.1*10-4 -1.0*10-4 厘米2伏特-1秒-1。蛋白質(zhì)的泳動(dòng)度

11、以及pH和離子強(qiáng)度對(duì)泳動(dòng)度的影響都反映某一特定蛋白質(zhì)的特性。因此電泳不僅是分別蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純廈的重要手段而且也是研討蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的一種物理化學(xué)方法。電泳根底：自在電泳挪動(dòng)界面電泳 a.先在u-形管內(nèi)使蛋白質(zhì)溶液和緩沖液之間構(gòu)成明晰的界面b.加電場c.由于界面處存在濃度梯度，因此產(chǎn)生折射率梯度。利用光學(xué)系統(tǒng)可以察看到界面的挪動(dòng)。每個(gè)挪動(dòng)界面相當(dāng)于一個(gè)特定蛋白質(zhì)。 區(qū)帶電泳 是由于在支持物上電泳時(shí)各組分因遷移數(shù)度不同分布成區(qū)帶而得名。按支持物介質(zhì)的物理性狀：四類區(qū)帶電泳：1.濾紙電泳.薄膜電泳(醋酸纖維薄膜電泳, 薄膜電泳)2.粉末電泳:淀粉.纖維層.硅膠粉3.細(xì)絲電泳:尼龍絲,人

12、造絲4.凝膠電泳:聚丙烯酰胺.瓊脂糖凝膠盤狀電泳 在區(qū)帶電泳根底上開展起來的。支 持 物聚丙烯酰胺凝膠 三種物理效應(yīng)：1。樣品的濃縮效應(yīng)2。凝膠對(duì)分子的挑選效應(yīng)3。電泳分別的電荷效應(yīng) 樣品分別效果好、分辨率等。 等電聚焦電聚焦 蛋白質(zhì)混合物的分別是在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)展的。用聚丙烯酰胺替代蔗糖溶液介質(zhì)固體化、操作方便、分別快蛋白質(zhì)聚焦在等于其等電點(diǎn)的pH點(diǎn)處，構(gòu)成一個(gè)很窄的區(qū)帶。 雙向電泳-AA混合物一次電泳不能完全分開,將第一次電泳分開的斑點(diǎn)經(jīng)過支持介質(zhì)間的接觸吸印轉(zhuǎn)移到第二個(gè)支持介質(zhì)上,旋轉(zhuǎn)90進(jìn)展第二次電泳,稱雙向電泳.優(yōu)點(diǎn):設(shè)備簡單.操作方便,樣品用量少 1975 1975年，年，

13、O OFarrell Farrell 首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分別出腸桿菌總蛋白分別出11001100多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來此技術(shù)不多個(gè)蛋白點(diǎn)。后來此技術(shù)不斷用于原核生物和真核生物總蛋白的分別。目前，隨斷用于原核生物和真核生物總蛋白的分別。目前，隨著蛋白組工程的開展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用著蛋白組工程的開展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。 雙向電泳由第一向等電聚焦雙向電泳由第一向等電聚焦(IEF)(IEF)電泳和第二向電泳和第二向SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)組成，第一向

14、使組成，第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分別，第二向使分子量不同的等電點(diǎn)不同的蛋白得到分別，第二向使分子量不同的蛋白得到分別，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。蛋白得到分別，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。2 離子交換層析原理：根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差別將不同蛋白質(zhì)分開。原理：根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差別將不同蛋白質(zhì)分開。離子交換介質(zhì)：離子交換介質(zhì)： (1)(1)離子交換樹脂離子交換樹脂 (2)(2)離子交換纖維素離子交換纖維素 (3)Sepharose Fast Flow:(3)Sepharose Fast Flow: (4)Sepharose High Performance (4)Sepharose

15、 High Performance：分辨率較：分辨率較F.F.F.F.高高 (5)Mono: HPLC(5)Mono: HPLCI I 分類：分類： 陰離子交換陰離子交換 強(qiáng)度強(qiáng)度 功能功能基團(tuán)基團(tuán) + + DEAE DEAE 中等中等 OCH2CH2NH(CH2CH3)2OCH2CH2NH(CH2CH3)2 + + QAE QAE 強(qiáng)強(qiáng) OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 陽離子交換陽離子交換 強(qiáng)度強(qiáng)度 功能功能基團(tuán)基團(tuán) CM CM 弱弱 OCH2COO-OCH2COO- SP SP 強(qiáng)強(qiáng) CH2CH2CH2SO3-CH2CH2C

16、H2SO3-II II 選擇：選擇： i i 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)選擇介質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)選擇介質(zhì) ii ii 根據(jù)分別目的選擇介質(zhì)根據(jù)分別目的選擇介質(zhì)例如：例如： 離子交換纖維素離子交換纖維素纖維素為交換基纖維素為交換基質(zhì)質(zhì)原理：具有松散的親水性網(wǎng)狀構(gòu)造，原理：具有松散的親水性網(wǎng)狀構(gòu)造，吸較大的外表積，大分子可以自在吸較大的外表積，大分子可以自在經(jīng)過經(jīng)過優(yōu)點(diǎn)：交換容量大優(yōu)點(diǎn)：交換容量大洗脫條件溫暖洗脫條件溫暖回收率高回收率高種類多，選擇范圍廣種類多，選擇范圍廣 離子交換葡聚糖基質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖優(yōu)點(diǎn)：交換容量比離子交換纖維素大34倍。能根據(jù)凈電荷分子大小分別 蛋白質(zhì)混合物的分別由 溶液中的鹽離子

17、強(qiáng)度pH 來完成結(jié)合力小蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來洗脫時(shí)堅(jiān)持洗脫劑成分不改動(dòng)改動(dòng)洗脫劑的鹽濃度、PH值 騰躍式分段改動(dòng)分段洗脫 漸進(jìn)式延續(xù)改動(dòng)梯度洗脫梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：分別效果好分辨率高適宜：交換容量小，對(duì)鹽敏感的離子交換劑 兩種混合器: 簡單型混合器 復(fù)合型混合器 留意的問題：留意的問題： (1) (1) 緩沖液的選擇：緩沖液的選擇： 陽離子：陽離子：TrisTris 陰離子：磷酸鹽，檸檬酸鹽陰離子：磷酸鹽，檸檬酸鹽 (2) (2) 介質(zhì)處置：介質(zhì)處置： 陽離子：陽離子： Na+ Na+ 型型 陰離子：陰離子： Cl- Cl- 型型 (3) (3) 洗脫：洗脫：原理：原理：i i改動(dòng)鹽濃度改動(dòng)鹽

18、濃度 iiii改動(dòng)改動(dòng)pHpH值值方式：方式：i i分步洗脫分步洗脫 iiii梯度洗脫梯度洗脫 (4) (4) 介質(zhì)再生介質(zhì)再生四蛋白質(zhì)的選擇吸附分別 吸附層析-利用吸附力的強(qiáng)弱不同而到達(dá)分別的目的。吸附劑-結(jié)晶磷酸鈣及羥基磷灰石蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電荷的基團(tuán)，與羥基磷灰石的鈣離子結(jié)合。用磷酸緩沖液羥基磷灰石-分別核酸：病毒?；钚訡 硅酸 AL2O3磷酸鈣-吸附層析五根據(jù)對(duì)配基的生物學(xué)特異性的分別方法-親和層析 根底： 基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。它與另一種稱配基的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合配基：能被生物大分子所識(shí)別并于之結(jié)合的原子，原子團(tuán)，和分子：酶-底物;激素-受體；抗原：抗體。原理 先把待

19、提純的某一蛋白質(zhì)的特異配基，經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反響共價(jià)的銜接到像瓊脂糖凝膠一類的載體外表的功能基上，在配基與多糖基質(zhì)間遷入一個(gè)銜接臂使配基于凝膠之間堅(jiān)持足夠的間隔，不改動(dòng)載體外表的空間位阻妨礙等待分別的大分子與其配基的結(jié)合。 待提純的蛋白質(zhì)樣品+多糖資料待提純的蛋白質(zhì)樣品與配體結(jié)合，吸附，在瓊質(zhì)糖顆粒上結(jié)合在柱上的蛋白其它蛋白可以用自在配體的分子溶液脫下來1 原理：利用蛋白質(zhì)特異性進(jìn)展分別。2 介質(zhì)預(yù)備： 載體選擇：Sepharose 4BSepharose CL4B,Sepharose Fast Flow,Sepharose High Performance 空間臂：偶聯(lián)小分子時(shí)需求空間臂，常為

20、雙功能基團(tuán)，如己二氨或氨基己酸。 3 3 配基選擇：配基選擇： 抗原抗原抗體，酶抗體，酶抑制劑，抑制劑，酶酶底物，激素底物，激素受體，金屬結(jié)合蛋受體，金屬結(jié)合蛋白白螯和劑，螯和劑， 含巰基蛋白含巰基蛋白HgHg或含或含巰基分子，凝集素巰基分子，凝集素糖蛋白糖蛋白4 4 偶聯(lián)：偶聯(lián)： I I 溴化氰法：與溴化氰法：與氨基或氨基或氨氨基偶聯(lián)?；悸?lián)。 效率高，反響時(shí)間短，條件溫暖，適效率高，反響時(shí)間短，條件溫暖，適于多種蛋白。于多種蛋白。 II II 環(huán)氧氯丙烷法：與環(huán)氧氯丙烷法：與NH2, OH, NH2, OH, SH SH 偶聯(lián)偶聯(lián) 偶聯(lián)時(shí)需劇烈條件，如偶聯(lián)時(shí)需劇烈條件，如pH11pH11，

21、40405050，適于特別穩(wěn)定的蛋白，適于特別穩(wěn)定的蛋白六蛋白質(zhì)含量的測定與純度的鑒定六蛋白質(zhì)含量的測定與純度的鑒定 分析任務(wù)： 一測定蛋白質(zhì)的總量；二測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量；三鑒定最后制品的純度。 四活性測定一濃度一濃度/ /含量測定含量測定 1 1 紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨基紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸在酸在280nm 280nm 有吸收。有吸收。 2 Lowry2 Lowry法：蛋白質(zhì)在堿性溶液中法：蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅構(gòu)成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族與銅構(gòu)成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族氨基酸復(fù)原磷鉬酸磷鎢酸試劑產(chǎn)生氨基酸復(fù)原磷鉬酸磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍(lán)色。藍(lán)色。 3 Bradfor

22、d3 Bradford法：蛋白質(zhì)與考馬斯法：蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染料的結(jié)合量。亮藍(lán)染料的結(jié)合量。 4 4 凱氏定氮法凱氏定氮法 5 5 雙縮脲法雙縮脲法二測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定二測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)的含量-具有高度特異性的生物學(xué)方法酶活性激素活性抗原-抗體三蛋白質(zhì)制品純度的鑒定 1 1 電泳法：電泳法： SDSSDSPAGEPAGE， IEFIEF 2 2 化學(xué)法：化學(xué)法： N N端測定，端測定， C C端測定端測定 3 3 儀器法：儀器法： HPLCHPLC，質(zhì)譜，氨基酸組成分析，質(zhì)譜，氨基酸組成分析 4 4 物理方法：物理方法： 沉降分析沉降分析 分散分析分散分析 四活性測定四活性測定 1 激酶：標(biāo)志ATP 2 磷酸化酶：定磷 3 利用靶酶活性 4 氧化復(fù)原酶 5 ELISA溶菌酶：溶菌酶： 分子量為分子量為14KD14KD， 等電點(diǎn)為等電點(diǎn)為1111，耐熱，耐熱，可以水解革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁，雞可以水解革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁，雞蛋清中含量豐富。蛋清中含量豐富。舉例：從雞蛋殼膜中制備溶菌酶舉例：從雞蛋殼膜中制備溶菌酶