生化chapter+03-07+amino+acids+and+proteins-2

1、1第三章第三章氨基酸與蛋白質(zhì)氨基酸與蛋白質(zhì)教材教材 第第3-73-7章章What is the structure, chemistry, and biological function of amino acids， peptides， proteins?2結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)性質(zhì)性質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)性質(zhì)性質(zhì)分離分離純化純化測定測定氨基酸氨基酸肽肽蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)概念概念分類分類功能功能34第二章第二章 蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)1 1、蛋白質(zhì)通論、蛋白質(zhì)通論3 3、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)2 2、肽、肽4 4、一級結(jié)構(gòu)生物學(xué)意義、一級結(jié)構(gòu)生物學(xué)意義5 5、人工合成、人工合成5l蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過

2、肽鍵相連形成的高分蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物；子含氮化合物； l蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；l英文名稱英文名稱proteinprotein，是，是“最原初的最原初的” “” “第一重要第一重要的的”意思，是由意思，是由2020種種L L型型 - -氨基酸組成氨基酸組成的生物大分的生物大分子；子；l占人體干中的占人體干中的4545；最簡單的單細(xì)胞（大腸桿菌）；最簡單的單細(xì)胞（大腸桿菌）每個菌體約有每個菌體約有30003000種不同的蛋白質(zhì)；種不同的蛋白質(zhì)；l機體的新陳代謝的全部化學(xué)反應(yīng)均有蛋白質(zhì)（酶）機體的新陳代謝的全部化學(xué)反應(yīng)均有蛋白質(zhì)（酶）的參

3、與；的參與；1.1 1.1 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成蛋白質(zhì)的化學(xué)組成6l多數(shù)蛋白質(zhì)含多數(shù)蛋白質(zhì)含: : 碳碳(C)50(C)5056% 56% 氫氫(H)6(H)68% 8% 氧氧(O)19(O)1924%24% 氮氮(N)13(N)1319% 19% 硫硫(S)0(S)04%4%l有些蛋白質(zhì)含有磷，少數(shù)含鐵、銅、錳、鋅、鈷、有些蛋白質(zhì)含有磷，少數(shù)含鐵、銅、錳、鋅、鈷、鉬等，個別還含有碘鉬等，個別還含有碘l各種蛋白質(zhì)的含氮量平均為各種蛋白質(zhì)的含氮量平均為16161.1 1.1 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成蛋白質(zhì)的化學(xué)組成凱氏凱氏(Kjedahl)(Kjedahl)定氮法定氮法每克樣品含氮的克數(shù)每克樣品含氮的克數(shù)

4、6.25 6.25100100 =100 =100克樣品中蛋白質(zhì)的含量克樣品中蛋白質(zhì)的含量( (克克%)%)7幫助構(gòu)建肌肉的巨型蛋白幫助構(gòu)建肌肉的巨型蛋白titin 8l 含氮量很高，生產(chǎn)工藝簡單、成本很低，給了摻含氮量很高，生產(chǎn)工藝簡單、成本很低，給了摻假、造假者極大地利益驅(qū)動假、造假者極大地利益驅(qū)動; ;l 有人估算在植物蛋白粉和飼料中使蛋白質(zhì)增加一有人估算在植物蛋白粉和飼料中使蛋白質(zhì)增加一個百分點，用三聚氰胺的花費只有真實蛋白原料個百分點，用三聚氰胺的花費只有真實蛋白原料的的1/5;1/5;l 三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻

5、雜后不易被發(fā)現(xiàn)等也成了摻假、造假和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)等也成了摻假、造假者心存僥幸的輔助原因者心存僥幸的輔助原因; ;l 19941994年年國際化學(xué)品安全手冊國際化學(xué)品安全手冊表明表明: :長期或反復(fù)長期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響，導(dǎo)大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響，導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)石。致產(chǎn)生結(jié)石。為什么要用三聚氰胺呢？為什么要用三聚氰胺呢？1.1 1.1 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成蛋白質(zhì)的化學(xué)組成9l 根據(jù)蛋白質(zhì)分子的組成成分分類根據(jù)蛋白質(zhì)分子的組成成分分類l 根據(jù)溶解度分類根據(jù)溶解度分類l 根據(jù)分子形狀分類根據(jù)分子形狀分類l 根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類

6、1.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類10蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)功能功能 形狀形狀球蛋白：球形、易溶解。球蛋白：球形、易溶解。組成組成溶解性溶解性 纖維蛋白纖維蛋白：形似纖維、不溶于水形似纖維、不溶于水單純蛋白：只有單純蛋白：只有氨基酸，多數(shù)蛋白氨基酸，多數(shù)蛋白清蛋白（白蛋白）：溶于水清蛋白（白蛋白）：溶于水球蛋白：微溶于水，溶于稀鹽球蛋白：微溶于水，溶于稀鹽醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇綴合蛋白：與非蛋白質(zhì)物質(zhì)結(jié)合，如核蛋綴合蛋白：與非蛋白質(zhì)物質(zhì)結(jié)合，如核蛋白、糖蛋白和脂蛋白白、糖蛋白和脂蛋白活性蛋白：如酶、激素，受體、膜蛋白活性蛋白：如酶、激素，受體、膜蛋白非活性蛋白：膠原蛋

7、白、角蛋白、彈性蛋白非活性蛋白：膠原蛋白、角蛋白、彈性蛋白1.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類11Three basic classes according to shape and solubility1.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類1213l此外，還可以根據(jù)蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域或氨基酸此外，還可以根據(jù)蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)域或氨基酸模體特性分類；模體特性分類；l根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，將具有相同或類似結(jié)構(gòu)根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，將具有相同或類似結(jié)構(gòu)域或模體的蛋白質(zhì)（同源蛋白質(zhì)）歸為一大類、域或模體的蛋白質(zhì)（同源蛋白質(zhì)）歸為一大類、一類或一組，分別稱為超家族、家族或亞家族；一類或一組，分別稱

8、為超家族、家族或亞家族；1.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類141.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類151.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類161.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類171.2 1.2 蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的分類181.3 1.3 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次191.3 1.3 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次20211 1生物催化生物催化功能功能2 2結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)功能功能3 3轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)運功能功能4 4運動運動功能功能5 5營養(yǎng)和貯存營養(yǎng)和貯存功能功能6 6調(diào)控調(diào)控功能功能7 7保護和防御保護和防御功能功能8 8接受和傳遞接受和傳遞信息信息功能功能1.4 1.4 蛋白

9、質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能2223241.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能251.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能261.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能271.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能28l 西非叢林地區(qū)的黑人擅長短跑、跳遠(yuǎn)、籃球等西非叢林地區(qū)的黑人擅長短跑、跳遠(yuǎn)、籃球等需要強爆發(fā)力的項目；需要強爆發(fā)力的項目； l 合成合成輔肌動蛋白的輔肌動蛋白的ACTN3ACTN3基因的某種變異體基因的某種變異體在西非裔黑人的基因庫中頻率很高；在西非裔黑人的基因庫中頻率很高；l 這些變體所合成的肌動蛋白恰恰提高了肌肉快這些變體所合成的肌動蛋白恰恰提高了肌肉快速運動能力；速運動能力；1.4

10、 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能291.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能301.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能311.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能321.4 1.4 蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)的功能33ChymotrypsinChymotrypsin胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 with its active sitewith its active site1.5 1.5 典型蛋白質(zhì)典型蛋白質(zhì)34鉀電位門通道 1.5 1.5 典型蛋白質(zhì)典型蛋白質(zhì)35四種ATP驅(qū)動的離子泵 1.5 1.5 典型蛋白質(zhì)典型蛋白質(zhì)36Aquaporin(水通道蛋白)大腸桿菌水通道蛋白Z（AQP Z）是大腸桿

11、菌細(xì)胞的一個非常重要的水通道蛋白質(zhì)，由693個氨基酸殘基組成，與哺乳動物水通道蛋白具有30%的同源性，預(yù)測具有6個跨膜區(qū)域，通常以四聚體形式存在，并具有極強的水滲透功能，具有典型的“漏沙”水滲透機理。在1個滲透梯度條件下，它的水滲透能力是（2-10） 10-14 cm3/sec.subunit,且活化能很低（3.7kcal/mol）。以這個速率，在1個滲透梯度條件下（大概25個大氣壓），大概0.14微克大腸桿菌水通道蛋白Z就能回收一個人一天產(chǎn)生的廢水。假定水通道蛋白表面密度為10%，1.3cm2的過濾膜就可以完成一個人一天廢水的回收。由于水通道蛋白非常穩(wěn)定，對蛋白酶具有抗性，而且不被其他的生物

12、大分子抑制，所以水通道蛋白為基礎(chǔ)的水回收技術(shù)在宇宙空間飛行和多種陸地應(yīng)用等方面都具有潛在的重要應(yīng)用。 1.5 1.5 典型蛋白質(zhì)典型蛋白質(zhì)37The protein keratin is the chief structural components of hair, scales, horn, wool, nails and feathers.1.5 1.5 典型蛋白質(zhì)典型蛋白質(zhì)3839Acetylcholine receptor1.5 1.5 典型蛋白質(zhì)典型蛋白質(zhì)402.1 2.1 肽鍵肽鍵 肽鍵就是由氨基酸的肽鍵就是由氨基酸的-羧基與相鄰的氨基酸羧基與相鄰的氨基酸的的-氨基脫水縮合起來的

13、鍵。氨基脫水縮合起來的鍵。41l肽肽: :氨基酸通過肽鍵連結(jié)起來的化合物。氨基酸通過肽鍵連結(jié)起來的化合物。l二肽二肽: :兩個氨基酸形成的肽。兩個氨基酸形成的肽。l三肽三肽: :三個氨基酸形成的肽。三個氨基酸形成的肽。l多肽多肽: :許多氨基酸形成的肽。許多氨基酸形成的肽。l蛋白質(zhì)蛋白質(zhì): :多是組成氨基酸超過多是組成氨基酸超過100100個的多肽。個的多肽。l氨基酸殘基氨基酸殘基: :氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分子水，因此表現(xiàn)出其分子的不完整。子水，因此表現(xiàn)出其分子的不完整。l末端氨基和末端羧基：末端氨基和末端羧基：縮合后的氨基酸，只在肽縮合后的氨基酸，只在肽

14、的兩端有自由的的兩端有自由的-氨基和氨基和-羧基，簡稱羧基，簡稱N-N-端和端和C-C-端。端。2.2 2.2 肽肽42肽鏈的命名：肽鏈的命名：根據(jù)組成的氨基酸殘基來確定。規(guī)定根據(jù)組成的氨基酸殘基來確定。規(guī)定從肽鏈的從肽鏈的N-N-端殘基開始，依次稱為某氨基酰、氨基端殘基開始，依次稱為某氨基酰、氨基酰酰某氨基酸。如：某氨基酸。如：2.2 2.2 肽肽432.2 2.2 肽肽44反式構(gòu)型的肽鍵 2.3 2.3 肽的結(jié)構(gòu)肽的結(jié)構(gòu)45l由于肽鍵不能自由由于肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，組成肽基的旋轉(zhuǎn)，組成肽基的4 4個個原子和與之相連的原子和與之相連的2 2個個 - -碳原子都處于一個碳原子都處于一個平面內(nèi)，此

15、剛性結(jié)構(gòu)平面內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)的平面稱為肽平面或的平面稱為肽平面或酰胺平面酰胺平面 2.3 2.3 肽的結(jié)構(gòu)肽的結(jié)構(gòu)4647l許多短肽的晶體，均為離子晶格，熔點很高，在水許多短肽的晶體，均為離子晶格，熔點很高，在水溶液中以偶極離子存在；溶液中以偶極離子存在；l肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離末端肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離末端 -NH-NH2 2、 -COOH-COOH以以及側(cè)鏈及側(cè)鏈R R基上可解離的基團；基上可解離的基團；l小肽的很多性質(zhì)與游離的氨基酸相似；小肽的很多性質(zhì)與游離的氨基酸相似；l每一種肽也有其等電點，其中小肽的計算方法與氨每一種肽也有其等電點，其中小肽的計算方法與氨基酸相同；基酸相同；l肽的

16、游離肽的游離 -NH-NH2 2、 -COOH-COOH以及側(cè)鏈以及側(cè)鏈R R基也可以發(fā)生與基也可以發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的基團類似的反應(yīng)。氨基酸中相應(yīng)的基團類似的反應(yīng)。2.4 2.4 肽的理化性質(zhì)肽的理化性質(zhì)4849谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSHGSH）：）： 多肽類激素：催產(chǎn)素（多肽類激素：催產(chǎn)素（ OxytocinOxytocin ）等）等腦啡肽（腦啡肽（enkephalinenkephalin ）：）： 多肽類抗生素：短桿菌肽多肽類抗生素：短桿菌肽S S（Gramicidin SGramicidin S ）等）等肽類毒素：肽類毒素： - -鵝膏蕈堿（鵝膏蕈堿（ - - amanitinaman

17、itin ） GSHGSHOxytocin Oxytocin Enkephalin Enkephalin Gramicidin S Gramicidin S - - amanitinamanitin2.5 2.5 天然存在的活性肽天然存在的活性肽50l蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘就是蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，又被稱為基的排列順序，又被稱為氨基酸序列；氨基酸序列；l在有二硫鍵的蛋白質(zhì)中，一級結(jié)構(gòu)也包括二硫鍵在有二硫鍵的蛋白質(zhì)中，一級結(jié)構(gòu)也包括二硫鍵和其配對方式。和其配對方式。3.1 3.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)51 A鏈鏈 Gly.Tle.Va

18、l.Glu.Gln.Cys.Cys.Aln.Ser.Val.Cys.Ser.Leu.Tyr.Gln.Leu.Glu.Asn.Tyr.Cys.Asn OH 1 2 6 7 11 20 B鏈鏈Phe.Val.Asn.Gln.His.Leu.Cys.Gly.Ser.His.Leu.Val.Glu.Ala.Leu.Tyr.Leu.Val.Cys.Gly.Glu.Arg. 1 2 7 19 Gly.Phe.Phe.Tyr.Thr.Pro.Lys.Ala OH 30 牛牛胰胰島島素素的的化化學(xué)學(xué)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)SSSSSS3.1 3.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)52我國我國19651965年在世界上第年在

19、世界上第一個用化學(xué)方法人工合一個用化學(xué)方法人工合成的蛋白質(zhì)就是這種牛成的蛋白質(zhì)就是這種牛胰島素。胰島素。3.1 3.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)531 1測定氨基酸的組成測定氨基酸的組成2 2蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的N-N-末端和末端和C-C-末端的測定末端的測定3 3二硫鍵的拆開和肽鏈的分離二硫鍵的拆開和肽鏈的分離4 4肽鏈的部分水解和肽段的分離肽鏈的部分水解和肽段的分離5 5肽段氨基酸順序的測定肽段氨基酸順序的測定6 6二硫鍵位置的確定二硫鍵位置的確定3.2 3.2 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)測定54l確定蛋白質(zhì)所含氨基酸確定蛋白質(zhì)所含氨基酸的種類，并明確每種氨的種類，并明確每種

20、氨基酸有多少。基酸有多少。l目前較為成功的是將蛋目前較為成功的是將蛋白質(zhì)經(jīng)白質(zhì)經(jīng)6 mol/L HCl6 mol/L HCl在在110110下水解下水解24 h24 h后，用后，用氨基酸自動分析儀進行氨基酸自動分析儀進行測定。測定。 3.2.1 3.2.1 氨基酸組成氨基酸組成5556O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸l SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-N-端端的游離氨基作用，生成二硝基苯

21、衍生物（的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。l 在酸性條件下水解，得到黃色在酸性條件下水解，得到黃色DNP-DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的醚抽提分離。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。氨基酸可以用色譜法進行鑒定。2,4-2,4-二硝基氟苯法二硝基氟苯法 3.2.2 N-3.2.2 N-末端氨基酸測定末端氨基酸測定57氰酸鹽法氰酸鹽法 此法最大優(yōu)點是除去此法最大優(yōu)點是除去N N末端氨基酸后剩下的肽鏈部分仍是完末端氨基酸后剩下的肽鏈部分仍是完整的。因此，可以用來一步步地測定多肽鏈整的。因此，可以用來一步步地測定多肽鏈N N

22、末端的氨基酸末端的氨基酸順序。氨基酸分析儀就是根據(jù)此原理制成的。順序。氨基酸分析儀就是根據(jù)此原理制成的。3.2.2 N-3.2.2 N-末端氨基酸測定末端氨基酸測定58丹磺酰氯法丹磺酰氯法 N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸l在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。l此法的優(yōu)點是丹磺酰此法的優(yōu)點是丹磺酰-

23、 -氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到敏度可以達到1 1 1010-9-9molmol。3.2.2 N-3.2.2 N-末端氨基酸測定末端氨基酸測定59氨肽酶法氨肽酶法 l 從多肽鏈的從多肽鏈的N-N-端逐個的向里水解端逐個的向里水解。l 可根據(jù)可根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的N-N-末端末端殘基順序殘基順序。l 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為酸殘基為N-N-末端的肽鍵速度最大末端的肽鍵速度

24、最大。3.2.2 N-3.2.2 N-末端氨基酸測定末端氨基酸測定60H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸多肽與肼在無水條件下加熱，多肽與肼在無水條件下加熱，C-C-端氨基酸即從肽鏈端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-C-端氨基端氨基酸分離。酸分離。肼解法肼解法 3.2.3 C-3.2.3 C-末端氨基酸測定末端氨

25、基酸測定61羧肽酶水解法羧肽酶水解法 l 能從多肽鏈的能從多肽鏈的C-C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)端逐個的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的從而知道蛋白質(zhì)的C-C-末端殘基順序末端殘基順序。l 目前常用的羧肽酶有四種：目前常用的羧肽酶有四種：A,B,CA,B,C和和Y Y。A A和和B B來自來自胰臟；胰臟；C C來自柑桔葉；來自柑桔葉；Y Y來自面包酵母來自面包酵母。l 羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端末端氨基酸殘基；氨基酸殘

26、基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys為為C-C-末端殘基的末端殘基的肽鍵肽鍵。l 但實際有時相連的氨基酸以相近的速度釋放，結(jié)但實際有時相連的氨基酸以相近的速度釋放，結(jié)果不好分析。果不好分析。3.2.3 C-3.2.3 C-末端氨基酸測定末端氨基酸測定62羧肽酶水解法羧肽酶水解法 3.2.3 C-3.2.3 C-末端氨基酸測定末端氨基酸測定63氨基酸的釋放氨基酸的釋放量（摩爾數(shù)）量（摩爾數(shù)）反應(yīng)時間反應(yīng)時間GlySerVal判斷序列判斷序列 -Val-Ser-Gly-COOH羧肽酶水解法羧肽酶水解法 3.2.3 C-3.2.3 C-末端氨基酸測定末端氨基酸測定64l最普遍的方法

27、是用過量的巰基乙醇處理，然后最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護還原時生成的半胱氨酸巰基，以防用碘乙酸保護還原時生成的半胱氨酸巰基，以防它重新被氧化。它重新被氧化。l二硫鍵拆開后形成的個別肽鏈，可能用紙層析、二硫鍵拆開后形成的個別肽鏈，可能用紙層析、離子交換柱層析、逆流分溶、區(qū)帶電泳等方法進離子交換柱層析、逆流分溶、區(qū)帶電泳等方法進行分離。行分離。3.2.4 3.2.4 二硫鍵拆開和肽鏈分離二硫鍵拆開和肽鏈分離65SH +SHS SHOCH2CH2SHICH2COOH 涉及反應(yīng)涉及反應(yīng)pH8.09.0,室溫室溫S CH2COO3.2.4 3.2.4 二硫鍵拆開和肽鏈分離二硫鍵拆

28、開和肽鏈分離66化學(xué)法化學(xué)法 l有溴化氰法、部分酸水解法、羥胺法和有溴化氰法、部分酸水解法、羥胺法和N-N-溴代溴代琥珀酰亞胺法等。琥珀酰亞胺法等。酶解法酶解法 l有較強專一性，水解產(chǎn)率也較高。有較強專一性，水解產(chǎn)率也較高。l常用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白常用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶等。酶和嗜熱菌蛋白酶等。l處理后得到的肽段，主要通過凝膠過濾法分離，處理后得到的肽段，主要通過凝膠過濾法分離，常輔以離子交換層析法。常輔以離子交換層析法。3.2.5 3.2.5 肽鏈部分水解和分離肽鏈部分水解和分離676869主要是主要是EdmanEdman降解法。降解法。P.

29、 P. EdmanEdman于于19501950年首先提出。年首先提出。lEdmanEdman降解試劑（降解試劑（PITCPITC）與多肽鏈的游離末端氨基與多肽鏈的游離末端氨基作用，降解反應(yīng)分偶聯(lián)、作用，降解反應(yīng)分偶聯(lián)、環(huán)化斷裂和轉(zhuǎn)化三個步驟。環(huán)化斷裂和轉(zhuǎn)化三個步驟。3.2.6 3.2.6 肽段氨基酸順序測定肽段氨基酸順序測定70酶解法酶解法l主要是肽譜重迭法，是在化學(xué)法所得結(jié)果的前主要是肽譜重迭法，是在化學(xué)法所得結(jié)果的前期下進行的氨基酸序列分析。期下進行的氨基酸序列分析。 l 測定多肽鏈中分離出來的各個小肽段，可以測定多肽鏈中分離出來的各個小肽段，可以應(yīng)用化學(xué)方法或酶學(xué)方法測出其中的氨基酸順

30、序。應(yīng)用化學(xué)方法或酶學(xué)方法測出其中的氨基酸順序。然后比較用不同方法獲得的幾套肽段的氨基酸順然后比較用不同方法獲得的幾套肽段的氨基酸順序，根據(jù)它們彼此有重疊的部分，確定每個肽段序，根據(jù)它們彼此有重疊的部分，確定每個肽段的適當(dāng)位置。拼湊出整個肽鏈的氨基酸順序。的適當(dāng)位置。拼湊出整個肽鏈的氨基酸順序。 3.2.6 3.2.6 肽段氨基酸順序測定肽段氨基酸順序測定7172肽肽順序順序A A1 1 B B1 1A A2 2B B2 2 A A3 3B B3 3 A A4 4Ala.Phe(Ala.Phe(丙丙- -苯丙苯丙) )Ala.Phe.Gly.Lys(Ala.Phe.Gly.Lys(甘甘- -賴

31、賴) ) Gly.Lys.Asn.Tyr(- Gly.Lys.Asn.Tyr(-天冬酰天冬酰- -酪酪) ) Asn.Tyr.Arg(-Asn.Tyr.Arg(-精精) ) Arg.Trp(- Arg.Trp(-色色) ) Trp.His(-Trp.His(-組組) ) His.Val(- His.Val(-纈纈) )十肽十肽順序順序Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Trp.His.Val Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Trp.His.Val 3.2.6 3.2.6 肽段氨基酸順序測定肽段氨基酸順序測定7374l一般可用蛋白酶或酸直接水解原來的蛋

32、白質(zhì)，從部分一般可用蛋白酶或酸直接水解原來的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離出含有二硫鍵的肽段，所得到的肽段水解產(chǎn)物中分離出含有二硫鍵的肽段，所得到的肽段混合物可用混合物可用BrownBrown及及HarltayHarltay的對角線電泳技術(shù)進行分的對角線電泳技術(shù)進行分離，確定二硫鍵位置。離，確定二硫鍵位置。l一般用胃蛋白酶水解原來的含二硫鏈的蛋白質(zhì)。因為一般用胃蛋白酶水解原來的含二硫鏈的蛋白質(zhì)。因為胃蛋白酶專一性較低，切點多，這樣生成的肽段（包胃蛋白酶專一性較低，切點多，這樣生成的肽段（包括含有二硫橋的肽段）都比較小，后面的分離、鑒定括含有二硫橋的肽段）都比較小，后面的分離、鑒定工作均比較容易進

33、行。其次是胃蛋白酶的工作均比較容易進行。其次是胃蛋白酶的pHpH在酸性范在酸性范圍（圍（1 12 2），有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)而造成），有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)而造成麻煩。麻煩。3.2.7 3.2.7 二硫鍵位置測定二硫鍵位置測定753.2.7 3.2.7 二硫鍵位置測定二硫鍵位置測定76BrownBrown和和HartlayHartlay對角線電泳圖解對角線電泳圖解+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab bpH6.5pH6.5圖中圖中a a、b b兩個斑點是兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段。生的肽段。3.2.7 3.2.7 二硫鍵位置測定二硫

34、鍵位置測定77784.1 4.1 一級結(jié)構(gòu)的生物學(xué)意義一級結(jié)構(gòu)的生物學(xué)意義79808182l生物形態(tài)與分子結(jié)構(gòu)在進化過程中是向著多樣化生物形態(tài)與分子結(jié)構(gòu)在進化過程中是向著多樣化和專一化方向發(fā)展的。和專一化方向發(fā)展的。l蛋白質(zhì)的合成是受核酸控制的，但是隨著生物環(huán)蛋白質(zhì)的合成是受核酸控制的，但是隨著生物環(huán)境的變化，境的變化，DNADNA也會發(fā)生偶然的突變，這將必然影也會發(fā)生偶然的突變，這將必然影響蛋白質(zhì)的生物合成，引起蛋白質(zhì)某些氨基酸的變響蛋白質(zhì)的生物合成，引起蛋白質(zhì)某些氨基酸的變化?；?。l氨基酸的改變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能喪失氨基酸的改變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能喪失或更加完善。或更加完善。4.2 4.2 一級結(jié)構(gòu)的進化一級結(jié)構(gòu)的進化83l半乳糖苷酶是一種催化半乳糖水解為單糖的水半乳糖苷酶是一種催化半乳糖水解為單糖的水解酶蛋白，在細(xì)菌、真菌、動物和人體內(nèi)均被發(fā)現(xiàn)。解酶蛋白，在細(xì)菌、真菌、動物和人體內(nèi)均被發(fā)現(xiàn)。l來源于細(xì)菌中的來源于細(xì)菌中的半乳糖苷酶為四聚體。半乳糖苷酶為四聚體。l每個亞基又有五個不同的結(jié)構(gòu)域組成。每個亞基又有五個不同的結(jié)構(gòu)域組成。l在第三個結(jié)構(gòu)域中