生物分析技術(shù)期末考試609

1、色譜聯(lián)用第一，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用一質(zhì)譜法的特點(diǎn)：1.被分析的樣品首先要離子化。2.通過(guò)測(cè)定樣品離子質(zhì)荷比（m/z）來(lái)進(jìn)行定性定量分析。3.質(zhì)譜是分子離子及碎片離子的質(zhì)量與其相對(duì)強(qiáng)度的譜, 譜圖與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)；4.質(zhì)譜法可提供分子量, 確定分子式。5.質(zhì)譜法進(jìn)樣量少, 靈敏度高, 分析速度快；二質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)：質(zhì)譜儀是通過(guò)對(duì)樣品電離后產(chǎn)生的具有不同的 m/z 的離子來(lái)進(jìn)行分離分析的。質(zhì)譜儀包括：1進(jìn)樣系統(tǒng): 進(jìn)樣系統(tǒng)的作用是高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能引起真空度的降低。進(jìn)樣方式： 1）直接進(jìn)樣;2）儀器聯(lián)用的進(jìn)樣（GC、LC、CE）2電離系統(tǒng)：離子源的作用是使樣品分子變成離子，將離子聚焦，并

2、加速進(jìn)入質(zhì)量分析器。 質(zhì)譜檢測(cè)的是離子；離子源即為接口。離子化方式：1） 電子轟擊電離 Electron Impact Ionization EI （應(yīng)用最廣泛）a)原理: 由GC或直接進(jìn)樣桿進(jìn)入的樣品，以氣體形式進(jìn)入離子源，由燈絲發(fā)出的電子與樣品分子發(fā)生碰撞使樣品分子電離。b)特點(diǎn)： 所有的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖都是在70 eV下做出的。而一般有 機(jī)化合物的電離電位是10 eV。 有機(jī)物分子可能被打掉一個(gè)電子形成分子離子，確定 化合物分子量；也可能會(huì)發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂形成碎片 離子，得到化合物的結(jié)構(gòu)信息。 2）化學(xué)離子化 Chemical Ionization CI a) 有些化合物穩(wěn)定性差，用EI方式不

3、易得到分子離子，這時(shí)采用CI電離方式。CI源工作過(guò)程中要引進(jìn)一種反應(yīng)氣體。氣體經(jīng)過(guò)電子轟擊，產(chǎn)生離子，再與試樣相互碰撞，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子。b)特點(diǎn): 最強(qiáng)峰為準(zhǔn)分子離子； 譜圖簡(jiǎn)單； 不適用難揮發(fā)試樣。3）電噴霧電離 Electrospray Ionization ESIESI是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會(huì)在電離過(guò)程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強(qiáng)的有機(jī)化合物。ESI最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子。 可以測(cè)量大分子量的蛋白質(zhì)。 4）場(chǎng)電離，場(chǎng)解吸 Field Ionization, Field Desorption FI、FD a) 特點(diǎn)： 強(qiáng)電場(chǎng)將分子中拉出一個(gè)電子；

4、分子離子峰強(qiáng)； 碎片離子峰少； 不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。b)局限性：要求樣品分子處于氣態(tài)，靈敏度不高，應(yīng)用逐漸減少。5）快原子轟擊 Fast Atom Bombardment FAB （主要用于磁式雙聚焦質(zhì)譜儀）a)氬氣在電離室依靠放電產(chǎn)生氬離子，高能氬離子經(jīng)電荷交換得到高能氬原子流，氬原子打在樣品上產(chǎn)生樣品離子。電離過(guò)程中不必加熱氣化，因此適合于分析大分子量、難氣化、熱穩(wěn)定性差的樣品。b) 缺點(diǎn)：混合物樣品中共存物質(zhì)的干擾，它們常常會(huì)抑制分析物的離子化，造成靈敏度下降甚至根本沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生。6）基質(zhì)輔助激光解析電離 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionizat

5、ion MALDI （適用于生物大分子）MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到離子。 待測(cè)物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長(zhǎng)的脈沖式激光進(jìn)行照射時(shí)，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。7）大氣壓化學(xué)電離 Atmospheric Pressure Chemical Ionization APCIAPCI噴嘴的下游放置一個(gè)針狀放電電極，通過(guò)放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等離子，溶劑分子也會(huì)被電離，這些離子與分析物分子進(jìn)行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化。

6、 APCI主要用來(lái)分析中等極性的化合物。 APCI主要產(chǎn)生的是單電荷離子，很少有碎片離子，主要是準(zhǔn)分子離子?？梢哉J(rèn)為APCI是ESI的補(bǔ)充。 3.質(zhì)量分析系統(tǒng)：質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心, 質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開(kāi)并排列。 不同類(lèi)型的質(zhì)量分析器構(gòu)成不同類(lèi)型的質(zhì)譜儀:1） 單聚焦磁場(chǎng)分析器 離子進(jìn)入分析器后，由于磁場(chǎng)的作用，其運(yùn)動(dòng)軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運(yùn)動(dòng)。在一定的B、V下，不同m/z 的離子其R不同，由離子源產(chǎn)生的離子，經(jīng)過(guò)分析器后可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量分離。2） 四級(jí)桿質(zhì)量分析器 只有質(zhì)荷比滿(mǎn)足要求的離子才能通過(guò)四級(jí)桿到達(dá)檢測(cè)器。其它離子則撞到四級(jí)電極上而被“過(guò)濾”掉。四極桿質(zhì)譜

7、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)廉，體積小，易操作，掃描速度快， 適合于GC-MS, LC-MS，但分辨率不高。3） 離子阱質(zhì)量分析器 特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測(cè)器；4） 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 m/z小的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度快，最先通過(guò)漂移管; m/z大的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度慢，最后通過(guò)漂移管。 適合于生物大分子， 靈敏度高，掃描速度快， 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分辨率隨m/z 的增大而降低。 5）傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀FT-MS的核心為分析室，分析室由三對(duì)平行的極板構(gòu)成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋運(yùn)動(dòng)垂直于z軸，在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸方向垂

8、直的兩極板上檢測(cè)信號(hào)。4.檢測(cè)系統(tǒng)：質(zhì)量分析器分離并加以聚焦的離子束，按m/z的大小依次通過(guò)狹縫，到達(dá)收集器，經(jīng)接收放大后被記錄。質(zhì)譜儀的檢測(cè)主要使用電子倍增器，也有的使用光電倍增管。 倍增器出來(lái)的電信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后可得到色譜圖，質(zhì)譜圖等信息。三氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀1.GC-MS接口技術(shù)接口的作用：1）.除去載氣；2）.將待測(cè)物毫無(wú)損失地從GC轉(zhuǎn)移至MS。評(píng)價(jià)參數(shù)：1）. 傳輸產(chǎn)率Y； 2）. 濃縮系數(shù)N; 3）. 延時(shí)t ； 4. 峰展寬系數(shù)H目前常用的GC-MS接口：1）直接導(dǎo)入型（最常用）：將毛管直接插入質(zhì)譜儀的金屬毛細(xì)管內(nèi)。毛細(xì)管色譜柱流出的載氣和待測(cè)物進(jìn)入離子源作用場(chǎng)。由于惰性氣體

9、He不發(fā)生電離，只有待測(cè)物分子形成帶電粒子，在加速電場(chǎng)作用下進(jìn)入質(zhì)量分析器。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易維護(hù)，應(yīng)用廣泛。2）開(kāi)口分流型; 特點(diǎn)：色譜柱出口常壓、接口簡(jiǎn)單 在色譜流量較大時(shí)，傳輸能力較低，不適用于填充柱條件 3）噴射式分離器特點(diǎn)：分離除去絕大部分載氣，使試樣組分濃集，同時(shí)達(dá)到低真空度。 適用于填充柱或毛細(xì)管柱與較小功率的抽真空質(zhì)譜儀聯(lián)接。 2. GC-MS總離子色譜圖總離子色譜圖的橫坐標(biāo)是出峰時(shí)間, 縱坐標(biāo)是峰高。 圖中每個(gè)峰表示樣品的一個(gè)組份,由每個(gè)峰可以得到相應(yīng)化合物的質(zhì)譜圖。 峰面積和該組份含量成正比,可用于定量。 3.GC-MS選擇離子質(zhì)譜圖 SIM主要用于定量分析。 只有特定質(zhì)量

10、數(shù)的離子被檢測(cè)。 根據(jù)目標(biāo)化合物選擇合適的檢測(cè)離子相當(dāng)重要。 靈敏度取決于所選擇的檢測(cè)離子。 四液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀1.LC-MS中存在的問(wèn)題：LC 流動(dòng)相對(duì)MS工作條件的影響 1ml溶劑氣化生成 500 1300ml的蒸氣。而 質(zhì)譜儀只能接受10 ml/min。 氣體流量有時(shí)流動(dòng)相中含難以揮發(fā)的緩沖鹽。 2. 質(zhì)譜離子源溫度、電離方式不適宜液相色譜所分析的樣品。 2.LC-MS的接口 接口作用：除去流定相，只讓組分分子進(jìn)入離子源。直接液體導(dǎo)入接口（DLI） 移動(dòng)帶技術(shù)（MB） 熱噴霧接口（TS） 粒子束接口（PB） 快原子轟擊（FAB） 基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI） 電噴霧電離（ESI）

11、大氣壓電離（API） 大氣壓化學(xué)電離（APCI） 3.識(shí)別分子離子峰必須是譜圖中最高質(zhì)量的離子。 必須是奇電子離子。 必須能夠通過(guò)合理的離子碎裂機(jī)理產(chǎn)生譜圖中的一些重要離子。 氮規(guī)則：一個(gè)化合物含有偶數(shù)個(gè)氮原子，其分子離子的質(zhì)量數(shù)一定是偶數(shù)；一個(gè)化合物含有奇數(shù)個(gè)氮原子，其分子離子的質(zhì)量一定是奇數(shù)。 五毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用1.CE-MS的接口 接口技術(shù)是實(shí)現(xiàn)CE-MS聯(lián)用的關(guān)鍵所在。近幾年來(lái)，關(guān)于CE-MS方法學(xué)的研究主要是關(guān)于新接口技術(shù)。目前主要分為： CE-ESI-MS接口技術(shù)：1）鞘液接口 ；2）無(wú)鞘液接口鞘液體接口技術(shù)：金屬接口（噴霧桿）具有三層套管結(jié)構(gòu)：內(nèi)層中插入多孔毛細(xì)管, 中間層采

12、用了液體鞘流技術(shù), 鞘液從中間層流出, 與毛細(xì)管中流出的液體混合, 解決了毛細(xì)管末端電接觸的問(wèn)題, 同時(shí)可以控制鞘液體流速以增大進(jìn)入ESI的液體量，補(bǔ)給足夠的液體基質(zhì), 形成穩(wěn)定的電噴霧。鞘液接口技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)提高樣品流速使得噴霧更加穩(wěn)定,有利于形成穩(wěn)定的電流回路,同時(shí)可改變CE運(yùn)行緩沖液的組成,使其滿(mǎn)足ESI源的檢測(cè)要求。然而鞘液的引入會(huì)稀釋樣品, 使檢測(cè)靈敏度下降。為此,有人設(shè)計(jì)了低流速鞘液接口，以降低鞘液的稀釋作用, 同時(shí)鉑絲構(gòu)成電流回路可以避免因流速低所造成的斷流。2.CE-ICP-MS接口技術(shù) ICP-MS是一種先進(jìn)的痕量多元素分析技術(shù)。CE-ICP-MS具有分離分析速度快、靈敏

13、度高、分辨率高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn), 在金屬及金屬化合物的分離分析中扮演著重要的角色。 目前主要有3種CE-ICP-MS接口技術(shù): 無(wú)鞘液接口技術(shù) 鞘液接口技術(shù) 氫化物發(fā)生接口技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：CE-MS 在線聯(lián)用具有樣品損失少、自動(dòng)化程度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),其應(yīng)用要比離線聯(lián)用廣泛。 缺點(diǎn)： a.離子源受限，僅電噴霧等幾種方法可選。 b.常不允許CE采用其最佳緩沖條件，限制其優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮。 c.CE出峰很快，沒(méi)有時(shí)間進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定。 CE-MS的局限性CE/MS的應(yīng)用報(bào)道雖然很多,但作為常規(guī)方法尚存在以下缺點(diǎn): 靈敏度低,不如LC-MS；毛細(xì)管壁涂層材料中的表面活性劑等會(huì)降低被分析物的離子化效率甚至嚴(yán)

14、重污染MS離子源；不是所有的CE分離模式都可方便地用于與MS相聯(lián)用； MS對(duì)CE分離緩沖液的限制較多。 第二色譜-福利葉變換紅外光譜聯(lián)用（FTIR）一GC-FTIR1.紅外光譜原理：紅外光譜根據(jù)不同的波數(shù)范圍分為三個(gè)區(qū)： 近紅外區(qū) 13,3304000 cm-1（0.752.5 m） 中紅外區(qū)4000650 cm-1（2.515.4 m） 遠(yuǎn)紅外區(qū) 65010 cm-1（151000 m）分子沿重心軸轉(zhuǎn)動(dòng)的能量為轉(zhuǎn)動(dòng)能；二個(gè)以上原子連接在一起，它們之間的鍵如同彈簧一樣振動(dòng)，所需能量為振動(dòng)能。 當(dāng)分子受到紅外光的輻射，如果分子中某個(gè)基團(tuán)的振動(dòng)頻率和它一樣，二者就會(huì)產(chǎn)生共振，此時(shí)光的能量通過(guò)分子偶

15、極距的變化而傳遞給分子，這個(gè)基團(tuán)就吸收一定頻率的紅外光，產(chǎn)生振動(dòng)躍遷，形成紅外吸收光譜。2.GC-FTIR概述u質(zhì)譜一般難于區(qū)分同分異構(gòu)體，單憑MS確定有機(jī)物結(jié)構(gòu)有時(shí)很困難，甚至不可能。 實(shí)現(xiàn)GC-IR的困難 除了工作氣壓匹配之外，其余工作條件的差異很大。尤其是散射型紅外光譜儀，掃描速度和靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于色譜。 FTIR的出現(xiàn)大大促進(jìn)了GC-IR的發(fā)展。FTIR具有光通量大、信噪比好、掃描速度快等優(yōu)點(diǎn)，與GC的匹配性大大提高。 3.GC-FTIR系統(tǒng)接口裝置：光管: GC/FTIS的關(guān)鍵部件。 用硼硅玻璃制成； 兩端裝有KBr鹽窗，紅外干涉光可以通過(guò)； 內(nèi)壁鍍金，有高的反射率，紅外干涉光在其中多

16、次反射，增加光程以提高靈敏度； 可加熱，保證GC流出物不在此冷凝、聚集； 適當(dāng)?shù)娜莘e，以獲得最佳分辨率和靈敏度。 細(xì)內(nèi)徑短光管 有助提高分辨率 長(zhǎng)光管 有助提高靈敏度 4 GC-FTIR提供的信息：（1）三維實(shí)時(shí)顯示紅外光譜圖（2）化學(xué)圖 (官能團(tuán)色譜圖 ) 指定官能團(tuán)頻率范圍對(duì)時(shí)間所作的圖； 是一個(gè)“色譜圖”，每個(gè)峰代表一個(gè)組分； 包含的信息比一般的色譜圖多，體現(xiàn)了化合物類(lèi)型或所含的官能團(tuán)； 與GC-MS中的質(zhì)量色譜圖作用相似。 （3）紅外重建色譜圖 GC-FTIR采集的數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后得到的紅外吸收信號(hào)對(duì)時(shí)間所作的圖。 積分吸收重建圖(紅外總吸光度重建圖 TIA)，相當(dāng)于GC-MS中的總

17、離子流圖(TIC)。不能實(shí)時(shí)檢查。 Gram-Schmidt重建色譜圖 扣除了載氣背景的積分重建圖。 二.LC-FTIR1.LC/FTIR接口流通池接口工作原理： 首先經(jīng)液相色譜分離的餾分隨流動(dòng)相順序進(jìn)入流通池，同時(shí)FTIR同步跟蹤，依次對(duì)流通池進(jìn)行紅外檢測(cè)，然后對(duì)獲得的流動(dòng)相與分析物的疊加譜圖作差譜處理，以扣除流動(dòng)相的干擾，獲得分析物的紅外光譜圖，進(jìn)而通過(guò)紅外數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索，對(duì)分析物進(jìn)行快速鑒定。特點(diǎn)： 裝置簡(jiǎn)單、操作方便。 局限性： a)流動(dòng)相的干擾難以徹底消除；b)不適合梯度淋洗技術(shù)；c)被測(cè)物在池內(nèi)受檢時(shí)間受色譜峰出峰時(shí)間限制而無(wú)法 采用信號(hào)平均技術(shù)提高紅外譜圖的信噪比等。 因此

18、，流動(dòng)池法的應(yīng)用受到了限制，最理想的辦法是在測(cè)定光譜前去除流動(dòng)相。2.LC/FTIR接口流動(dòng)相去除接口流動(dòng)相去除接口是在測(cè)定紅外光譜之前將通過(guò)物理或化學(xué)方法將流動(dòng)相除去以排除溶劑的干擾。目前已報(bào)道的該類(lèi)接口有許多種，最具有實(shí)際意義的有霧化接口、漫反射轉(zhuǎn)盤(pán)接口等。正相色譜：（1）漫反射轉(zhuǎn)盤(pán)接口 工作原理： 由色譜柱出來(lái)的流出物首先經(jīng)過(guò)一個(gè)加熱管，使90%的流動(dòng)相揮發(fā)除去，濃縮的樣品滴入裝有細(xì)KBr或KCl粉末的樣杯，若干個(gè)樣杯裝在一個(gè)轉(zhuǎn)盤(pán)上，由微機(jī)控制其轉(zhuǎn)動(dòng)。特點(diǎn)：靈敏度高， 但只適用于分析沸點(diǎn)高且有UV吸收的物質(zhì)。因水難去除，僅適用于正相色譜。（2）連續(xù)霧化接口 工作原理： 色譜流出物流入霧化

19、器被直接噴霧在裝有金屬軸的NaCl晶體窗片上，然后溶劑立即被蒸發(fā)除去，而溶質(zhì)則以微粒結(jié)晶析出。然后以FTIR檢測(cè)窗片上的流出物。特點(diǎn)： 常溫下分離溶劑，適用于不易揮發(fā)而易熱分解的有機(jī)化合物。反相色譜：（1）連續(xù)萃取式漫反射轉(zhuǎn)盤(pán)接口 工作原理： 首先將含水流動(dòng)相與萃取劑二氯甲烷混合，經(jīng)萃取管后，流出物分為水相和有機(jī)相，密度小的水相被吸氣瓶吸去，有機(jī)相部分被導(dǎo)入樣品濃縮器，進(jìn)而滴入漫反射轉(zhuǎn)盤(pán)上的樣品杯。特點(diǎn)：常溫下分離溶劑，適用于不易揮發(fā)而易熱分解的有機(jī)化合物。（2）熱霧化接口 工作原理： 由HPLC出來(lái)的流出物被加熱霧化在光管內(nèi)壁上，用多次反射光譜法測(cè)定光管壁上附著的溶質(zhì)。此裝置有四個(gè)一樣的光管

20、，依此收集、測(cè)量、清洗和干燥。如此反復(fù)。 特點(diǎn)：能有效除去溶劑，但靈敏度不高。3.LC/FTIR兩種接口比較流動(dòng)相去除法的缺點(diǎn)：與流動(dòng)池法相比，流動(dòng)相去除法的接口裝置復(fù)雜，且操作需一定經(jīng)驗(yàn)。流動(dòng)相去除法的優(yōu)點(diǎn)：1. 無(wú)流動(dòng)相干擾，可使用多種流動(dòng)相；2. 適用于梯度淋洗，提高了樣品的分離檢測(cè)能力； 3. 當(dāng)進(jìn)行離線紅外檢測(cè)時(shí)，可使用信號(hào)平均技術(shù)，增加譜圖的信噪比，檢出限一般較流動(dòng)池接口低。第三.色譜-原子光譜聯(lián)用一.GC與原子光譜聯(lián)用技術(shù)1為什么將GC和原子光譜聯(lián)用？ 金屬元素存在不同的形態(tài)和價(jià)態(tài)，其毒性相差較大。 利用色譜將不同價(jià)態(tài)和形態(tài)的微量元素進(jìn)行分離，然后再用原子光譜進(jìn)行測(cè)定。 2聯(lián)用“

21、接口”的作用色譜與原子光譜的“接口”就是要在不降低色譜分離性能的前提下將色譜分離后的組分盡可能多的送入到原子光譜的原子化器中使之原子化，同時(shí)不降低原子化器的原子化效率。基態(tài)：在無(wú)外來(lái)作用時(shí)，原子中各電子都盡可能處于最低 能級(jí)，從而使整個(gè)原子的能量最低，原子的這種狀 態(tài)稱(chēng)為基態(tài)。 激發(fā)態(tài)：當(dāng)原子受到外來(lái)作用時(shí)，它的一個(gè)或幾個(gè)電子吸 收能量后躍遷到較高能級(jí)，從而使原子處于能量 較高的新?tīng)顟B(tài)，此狀態(tài)稱(chēng)作激發(fā)態(tài)。 激發(fā)：原子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的過(guò)程叫做激發(fā)。 退激：激發(fā)態(tài)是一種壽命極短的不穩(wěn)定狀態(tài)，原子隨即 躍遷回基態(tài)，這一過(guò)程叫做退激。原子發(fā)射光譜： 原子從某一激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)，發(fā)射出具有一定波長(zhǎng)的

22、一條光線，而從其它可能的激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)以及某些激發(fā)態(tài)之間的躍遷都可發(fā)射出波長(zhǎng)不同的光線，這些光線形成一個(gè)系列（譜），稱(chēng)為原子發(fā)射光譜，簡(jiǎn)稱(chēng)原子光譜。 原子吸收光譜： 將一束白光通過(guò)某一物質(zhì)，若該物質(zhì)中的原子吸收其中某些波長(zhǎng)的光而發(fā)生躍遷，則白光通過(guò)物質(zhì)后將出現(xiàn)一系列暗線，如此產(chǎn)生的光譜稱(chēng)為原子吸收光譜。 等離子體（Plasma）在近代物理學(xué)中，是指一種在一定程度上被電離的氣體，其中電子和陽(yáng)離子的濃度處于平衡狀態(tài)，宏觀上呈電中性的物質(zhì)。電感耦合等離子體ICP：是由高頻電流經(jīng)感應(yīng)線圈產(chǎn)生高頻電磁場(chǎng)，使工作氣體形成等離子體，并呈現(xiàn)等離子體焰炬，達(dá)到10000K的高溫，是一個(gè)具有良好的蒸發(fā)-原子化-

23、激發(fā)-電離性能的光譜光源.二. LC與原子光譜 聯(lián)用技術(shù)LC-FAAS液相-火焰原子吸收光譜最簡(jiǎn)單的聯(lián)接方法是用一根低擴(kuò)散蛇形管作為接口三.色譜-核磁共振波譜聯(lián)用1.色譜-核磁共振波譜聯(lián)用普及的原因核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段 ，由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品 ，并具有迅速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而得以迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用 ，已經(jīng)從物理學(xué)滲透到化學(xué)、生物、地質(zhì)、醫(yī)療以及材料等學(xué)科 ，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大作用 。 高效液相色譜是分析復(fù)雜有機(jī)物、藥物和生物大分子等混合物的一種重要手段，但紫外、熒光、電化學(xué)等檢測(cè)器只能得到非常有限的分子結(jié)構(gòu)信息。 NMR能夠提供大量的分子結(jié)構(gòu)信息，但NM

24、R分析方法要求樣品為純品，對(duì)于復(fù)雜的混合物，因?yàn)镹MR信號(hào)的互相覆蓋，單純靠NMR譜則顯得無(wú)能為力。 在核磁儀器前加上一級(jí)色譜分離設(shè)備把直接樣品分離后再送人NMR中掃描，就可以大大簡(jiǎn)化分析程序，提高樣品分析速度，這就是色譜分離技術(shù)與NMR波譜儀結(jié)合并且日趨普及的原因。2.HPLC-NMR聯(lián)用裝置典型的HPLC-NMR聯(lián)用裝置是由泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測(cè)器組成LC系統(tǒng)，通過(guò)一條22 .5m長(zhǎng)的特制毛細(xì)管連接到NMR液相探頭上?？梢詫MR 視為HPLC 的特殊檢測(cè)器，其化學(xué)位移、積分強(qiáng)度和譜線分裂情況能提供豐富的定量定性信息。3.NMR探頭是聯(lián)用裝置中最關(guān)鍵的部分。傳統(tǒng)的NMR探頭樣品管在一

25、個(gè)與測(cè)量線圈相連的玻璃插件內(nèi)旋轉(zhuǎn)。 HPLC-NMR探頭由一個(gè)不旋轉(zhuǎn)的直接固定在射頻線圈上的玻璃管構(gòu)成，它處于傳統(tǒng)探頭玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管內(nèi)徑為2，3或4 mm。玻璃壁長(zhǎng)度至少超過(guò)質(zhì)子檢測(cè)線圈(18 mm)，并與之平行，同時(shí)向兩端逐漸變細(xì)。4.運(yùn)行模式（1）在流運(yùn)行模式 在流運(yùn)行模式是將HPLC的輸出直接連接到1H NMR的檢測(cè)池，連續(xù)檢測(cè)HPLC的洗脫液。 1H NMR成為HPLC的檢測(cè)器。（2）直接停留模式：（停留運(yùn)行模式 ）通過(guò)UV檢測(cè)器確定了色譜峰位置之后，準(zhǔn)確得知欲測(cè)組分到達(dá) 1H NMR檢測(cè)池的時(shí)間。一旦欲測(cè)組分到達(dá)檢測(cè)池，立即將HPLC泵停止，使色譜峰準(zhǔn)確地停留在NMR檢測(cè)池

26、中進(jìn)行檢測(cè)。 主要缺點(diǎn)是：由于色譜流動(dòng)相階段性停止，大大增加了分離時(shí)間，從而可能會(huì)使色譜峰展寬，分辨率下降。（3）環(huán)存儲(chǔ)運(yùn)行模式： （停留運(yùn)行模式）在色譜分離的過(guò)程中，將各個(gè)色譜峰的一部分轉(zhuǎn)移到不同毛細(xì)管中然后再分別進(jìn)人NMR檢測(cè)池進(jìn)行掃描分析。在整個(gè)過(guò)程中，色譜峰并沒(méi)有任何停頓，所以就解決了直接停留模式所帶來(lái)的色譜峰展寬問(wèn)題。生物色譜技術(shù)1生物色譜法（Biochromatography）是20世紀(jì)80年代中后期問(wèn)世，由生命科學(xué)與色譜分離技術(shù)交叉形成的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d色譜技術(shù)。適用條件：親和色譜固定相和研究對(duì)象都是生物大分子細(xì)胞膜色譜固定相含有生物大分子常規(guī)色譜研究對(duì)象是生物大分子2細(xì)胞

27、膜色譜Cell Membrane Chromatography, CMC將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相，利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法特點(diǎn)：分離 + 活性篩選 合二為一化學(xué)成分-效應(yīng)-作用機(jī)理適合于天然藥物活性成分的篩選及藥物作用機(jī)理的研究。3親和色譜Affinity Chromatography，AC利用生物大分子具有對(duì)某一類(lèi)生物大分子特異性識(shí)別和可逆結(jié)合的特性而建立起來(lái)的一種分離方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。親和體系 ：特異性親和體系高特異性抗原抗體荷爾蒙受體蛋白核酸互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白酶底物、產(chǎn)物、抑制劑群特異性免疫球蛋白A

28、蛋白、G蛋白酶輔酶凝集素糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體酶、蛋白質(zhì)肝素酶、蛋白質(zhì)活性色素（染料）酶、蛋白質(zhì)過(guò)渡金屬離子（銅、鋅等）酶、蛋白質(zhì)氨基酸（組氨酸等）常見(jiàn)的親和色譜名 稱(chēng)作用原理應(yīng) 用免疫AF抗體和抗原專(zhuān)一性識(shí)別抗體或抗原固定化金屬AF Cu2+、Zn2+、Ni2+等與蛋白質(zhì)表面組氨酸的特異性識(shí)別含組氨酸的蛋白質(zhì)染料AF染料和蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別激酶、脫氫酶核苷酸AF核苷酸和蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別激酶、脫氫酶凝聚素AF凝聚素和糖之間專(zhuān)一性的可逆的結(jié)合糖蛋白蛋白質(zhì)A AF對(duì)IgG類(lèi)似抗體的專(zhuān)一性免疫蛋白等親和色譜分離原理1. 找與底物專(zhuān)一可逆結(jié)合的配體,將配體通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)到載體。2. 配體與目

29、標(biāo)物吸附；3. 洗脫目標(biāo)物4. 親和柱再平衡。親和色譜分離示意圖親和色譜的固定相1載體 （support，又稱(chēng)基體matrix無(wú)機(jī)氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖等特性：親水但不溶于水，可溶脹大孔且有一定的機(jī)械強(qiáng)度化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且易于改性表面積很大但呈現(xiàn)惰性2. 配位體 （ligand，又稱(chēng)底物 substrate）專(zhuān)一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度相互作用的強(qiáng)弱決定著吸附和解吸的難易程度特異性配體生物素親和素、抗原抗體、酶抑制劑、激素受體通用性配體凝集素各種糖蛋白，核酸RNA、RNA蛋白質(zhì)3. 間隔臂 （spa

30、cer或spacer arms） 脂肪族有機(jī)物或多肽、蛋白組成； 具有雙官能團(tuán)，一端連接載體，一端偶聯(lián)配體； 長(zhǎng)度直接影響固定相的立體效應(yīng)； 可在對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)改性的時(shí)候形成； 可具有疏水性或親水性。影響親和色譜的因素離子強(qiáng)度：提高離子強(qiáng)度，親和作用減弱或完全破壞。 pH值：在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，親和作用減弱或完全破壞。離液劑：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用。 溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；但是疏水性相互作用增強(qiáng) 液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失3.體積排阻色譜原理：是按分子大小順序進(jìn)行分離

31、的一種色譜方法， 體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。4.離子交換色譜原理：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。分子生物學(xué)技術(shù)名詞解釋:1分子生物學(xué)(Molecular Biology)：從分子水平研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的“共同語(yǔ)言” 。通過(guò)生物的物質(zhì)基礎(chǔ)核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用等運(yùn)動(dòng)規(guī)律的研究來(lái)闡明生命分子基礎(chǔ)，從而探討生命的奧秘。2重組DNA技術(shù)（Recombinant DNA Technique）是人類(lèi)根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體

32、外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類(lèi)疾病的目的。3限制性?xún)?nèi)切核酸酶(restrictive endonucleases)，又稱(chēng)限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術(shù)刀”）。 4載體（Vector）:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。DNA克隆，亦稱(chēng)分子克隆:獲得所需的基因或特異序列，需從細(xì)胞中分離得到目的基因與載體DNA重組，并用適當(dāng)方法在宿主細(xì)胞中表達(dá)，擴(kuò)增得到大量相同的DNA片段，5表達(dá)克?。╡xpression cloning就是將目的基因與表達(dá)載體重組，導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)出相應(yīng)的基因產(chǎn)物（蛋白）

33、。6核酸分子雜交技術(shù)所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)7 DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。8 DNase足跡實(shí)驗(yàn)是一類(lèi)用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。9 Southern DNA 印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)或稱(chēng) DNA印跡雜交技術(shù)：根據(jù)毛細(xì)管作用，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的D

34、NA片段。 10諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northern blotting）：將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。11韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Western blotting）：將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)的技術(shù)。簡(jiǎn)答1 限制酶，在基因工程和基因診斷中的重要用途： 1) 不論DNA的來(lái)源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的DNA重組。如人和質(zhì)粒DNA等。 2) 用于人類(lèi)基因組的DNA分析，具特定的酶切位點(diǎn)。 3) Gene突變改變酶

35、切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長(zhǎng)度。應(yīng)用于限制性片段多態(tài)性分析。2 載體具以下特征： 1)分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖； 2)有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)； 3)被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力，并有可選擇的標(biāo)記基因（如，抗藥基因）。 常用的載體有：質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，BAC，YAC等。3 DNA重組與分子克隆化基本過(guò)程1、分離純化目的基因2、目的基因 + vector =重組DNA分子3、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在其內(nèi)增殖。4、篩選含有重組DNA的細(xì)胞細(xì)胞克?。╟ell clone），將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于瓊脂表面，以刺

36、激細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，這些細(xì)胞是由單個(gè)細(xì)胞形成的遺傳相同的細(xì)胞群體，故稱(chēng)細(xì)胞克隆。再將每個(gè)克隆移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。5、分離重組DNA克?。杭词斋@擴(kuò)增的培養(yǎng)細(xì)胞，并選擇分離重組DNA。 4重組DNA和分子克隆的幾種方法：（依目的基因的來(lái)源）1、從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆2、由特定mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行 克隆3、化學(xué)合成目的基因進(jìn)行克隆4、PCR體外擴(kuò)增目的片段進(jìn)行克隆5 Southern 印跡可用于分析基因拷貝數(shù)的變化基本過(guò)程：待測(cè)DNA樣品的制備和基因探針的標(biāo)記；待測(cè)DNA樣品的電泳分離；電泳分離的DNA經(jīng)變性、轉(zhuǎn)移、固定到合適的固相支持物；特異性核酸探針與膜上DNA片段雜

37、交，放射自顯影或顯色檢測(cè)目的DNA的存在。 應(yīng)用；研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。6 Northern 印跡可用于分析基因轉(zhuǎn)錄水平的變化：Northern blot是將RNA從凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，定性分析mRNA的常用方法原位雜交（in situ hybridization，ISH）即利用分子雜交技術(shù)來(lái)進(jìn)行基因及其表達(dá)產(chǎn)物定位分析的一種技術(shù)；應(yīng)用：可用于基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定位分析7 DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)、DNase足跡實(shí)驗(yàn)（footprinting assay）甲基化干擾實(shí)驗(yàn)(methyltion interference ass

38、ay優(yōu)缺點(diǎn)又叫DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。 DNase足跡實(shí)驗(yàn)（footprinting assay）是一類(lèi)用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過(guò)足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻

39、滯實(shí)驗(yàn)一樣，我們也可以加入非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA序列，來(lái)消除特定的“足跡”，并據(jù)此測(cè)定其核苷酸序列的特異性。 甲基化干擾實(shí)驗(yàn)(methyltion interference assay根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計(jì)出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，即甲基化干擾實(shí)驗(yàn)。這種技術(shù)可以檢測(cè)靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)之后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局限性是，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段

40、中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。8 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR） 是一種在體外特異地?cái)U(kuò)增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化； 可進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析； 可結(jié)合免疫沉淀的方法確定蛋白質(zhì)與DNA序列的相互作用。 9 DNA序列分析1、通過(guò)DNA序列分析可以鑒定基因和基因組的變異2、通過(guò)DNA序列測(cè)定分析人工重組的基因3、 通過(guò)DNA序列測(cè)定對(duì)定點(diǎn)突變進(jìn)行確認(rèn)10 什么是DNA芯片（DNA chip）1在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探針，與待測(cè)熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交；2通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢

41、測(cè)、比較和分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達(dá))； 3亦被稱(chēng)作DNA微陣列(DNA microarray)。 11利用DNA芯片技術(shù)1芯片每個(gè)探針是cDNA片段或基因的一段PCR產(chǎn)物，可以同任何具有同源序列的樣品形成雜交體，同時(shí)定量監(jiān)測(cè)大量基因的表達(dá)。2寡核苷酸芯片利用基因特異的寡核苷酸片段為探針，每個(gè)基因有1020個(gè)相對(duì)應(yīng)的探針，對(duì)低豐度基因表達(dá)水平變化的檢測(cè)具有高度靈敏性。 11 染色質(zhì)免疫共沉淀與芯片技術(shù)結(jié)合檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA相互作用 ChIP-on-chip（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）的基本原理： 染色質(zhì)免疫共沉

42、淀與芯片技術(shù)相結(jié)合 它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)，超聲波將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后用所研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體，從而特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。12 ChIP-on-chip應(yīng)用 目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選。 13 ChIP-on-chip適于DNA-核蛋白相互作用及表觀遺傳學(xué)研究： 主

43、要集中在兩個(gè)領(lǐng)域： 第一，確定轉(zhuǎn)錄因子及其作用位點(diǎn)：能夠?qū)⒅苯优c蛋白結(jié)合的基因作為靶點(diǎn)，數(shù)據(jù)可以直接用于生物信息學(xué)分析，更直接地識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。 第二，確定基因表觀遺傳修飾，應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)研究。 表觀遺傳學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容包括甲基化，組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等。 ChIP-on-chip技術(shù)可提供基因編碼區(qū)中組蛋白甲基化分布模式的信息：CpG島表達(dá)序列標(biāo)簽芯片，可以顯示基因組內(nèi)CpG甲基化和組蛋白修飾之間的聯(lián)系。14 酵母雙雜交技術(shù)(一）酵母雙雜交系統(tǒng)利用報(bào)告基因的表達(dá)探測(cè)蛋白-蛋白的相互作用（二）酵母雙雜交可通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用鑒定/分離新的相互作用蛋白及其編碼基因（三）哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)

44、是在酵母雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展的電泳技術(shù)一名詞解釋1. 電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。2. 遷移率：是指帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下泳動(dòng)的速度3. 電場(chǎng)強(qiáng)度：也稱(chēng)電位梯度，是指單位長(zhǎng)度(每1cm)支持物體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)度起著十分重要的作用。 4. 凝膠原理5. SDS作用與變性、非變性6. 連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液的離子成分、PH、凝膠濃度、電位梯度都相同，帶電顆粒電泳時(shí)僅具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。7. 不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度、電位梯度不連續(xù)，帶電顆粒電泳時(shí)具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。8. 等電點(diǎn)：在某一PH下，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，即靜電

45、荷為零，則此PH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。9. SDS: 是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合形式存在。這種陰離子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原劑打開(kāi)并不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合從而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。10. Cell Membrane Chromatography, CMC：以含受體的細(xì)胞膜為固定相，利用溶質(zhì)分子與相應(yīng)受體大分子間特異性分子間作用力的不同進(jìn)行分離測(cè)定的液相色譜方法。二簡(jiǎn)答1.電荷的來(lái)源膠體顆粒表面的電荷來(lái)源是：吸附液體中的某離子，因而帶電，液體失去該離子而帶相反的電荷

46、。作為膠體組成成分的相反符號(hào)的離子不等量的進(jìn)入溶液而帶電。固體表面吸附液體分子，然后這些分子解離，因而帶電。 2.影響電泳遷移率的因素可以分為以下三大類(lèi)：(a)與泳動(dòng)離子(或粒子)本身的特性有關(guān)的因子，如電荷符號(hào)和大小、本身的大小和形狀、水化程度、解離趨勢(shì)、兩性性質(zhì)等。(b)環(huán)境因素，如緩沖液濃度、離子強(qiáng)度、介電性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)、pH、溫度、粘度、有無(wú)極性分子存在(因?yàn)樗梢杂绊懻扯然蚪殡娦?等。在有支持物的情況下，影響因素更多，如支持物的吸附作用，不均一性、離子交換能力、電滲現(xiàn)象、虹吸作用、熱和蒸發(fā)作用等。(c)所加電場(chǎng)的特性，如強(qiáng)度和純度(是否雜有交流電)。這些因素在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要充分注意，盡

47、量保持條件恒定不變，以便獲得可重復(fù)的結(jié)果。3.電泳的分類(lèi)（一）按分離的原理區(qū)分電泳按分離的原理可分為4種，即:a.區(qū)帶電泳(zone EP，ZEP)：不同的離子成分在均一的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，可以用染色等方法顯示出來(lái)，如果用光密度計(jì)掃描可得出個(gè)個(gè)互相分離的峰。b.移界電泳(moving boundary EP，MBEP)：它只能起到部分分離的作用，如將濃度對(duì)距離作圖，則得出一個(gè)個(gè)臺(tái)階狀的圖形c.等速電泳(isotachophoresis，ITP)：在電泳達(dá)成平衡后，各區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，以等速移動(dòng)。按濃度對(duì)距離作圖也是臺(tái)階狀，但不同于上述移界電泳，它的區(qū)帶沒(méi)有重疊，而是分別保持

48、。d.等電聚焦(isoelectric cusing，IEF): 由多種具有不同等電點(diǎn)的載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中自動(dòng)形成pH梯度。被分離物則各自移動(dòng)到其等電點(diǎn)而聚成很窄的區(qū)帶，分辨率很高。（二）按有無(wú)固體支持物區(qū)分根據(jù)電泳是在溶液中進(jìn)行還是在固體支持物上進(jìn)行，又可以分為自由電泳和支持物電泳兩大類(lèi)。自由電泳又可分為：顯微鏡電泳(也稱(chēng)細(xì)胞電泳) ；移界電泳；柱電泳；自由流動(dòng)幕電泳；等速電泳； 4.電泳技術(shù)的特點(diǎn)凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分離，并可進(jìn)行定性或定量分析；樣品用量極少；設(shè)備簡(jiǎn)單；可在常溫進(jìn)行；操作簡(jiǎn)便省時(shí)；分辨率高。5.常用的電泳技術(shù)一、Tiselius移界電泳法Tiselius

49、的移界電泳法具有重要的歷史意義，它的成功在于巧妙地解決了幾個(gè)問(wèn)題：能夠形成清晰的起始界面；靠密度梯度能夠穩(wěn)定界面；能良好的散熱；在泳動(dòng)過(guò)程中可用光學(xué)方法顯示其組分。二、區(qū)帶電泳1）、濾紙及醋酸纖維素薄膜電泳它具有簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)：電泳區(qū)帶界限清晰；通電時(shí)間較短(20min至1 h)；對(duì)各種蛋白質(zhì)基本無(wú)吸附，因此無(wú)拖尾現(xiàn)象；不吸附染料，顯示電泳區(qū)帶背景干凈。操作簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)。已經(jīng)廣泛用于血清蛋白，血紅蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋 白，甲胎蛋白，類(lèi)固醇及同工酶等的分離分析中2）、高壓電泳 高壓電泳適用于分離低分子物質(zhì)，如氨基酸、肽、抗生素及其他有機(jī)和無(wú)機(jī)物。因?yàn)榈头肿游镔|(zhì)易擴(kuò)散，高電壓可使其移動(dòng)快

50、，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到分離，減少擴(kuò)散的影響。3）、連續(xù)電泳用一張垂直懸掛的濾紙作支持物，由上方連續(xù)加樣，緩沖液連續(xù)由上方流下來(lái)，電極加在左右兩方，電場(chǎng)方向與液流方向垂直。分離的成分由下方分別以試管收集 4）、凝膠電泳（1）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是從海藻中提取出來(lái)的一種線狀高聚物，是由D半乳糖和3、6脫水L半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖 影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素：遷移速率由DNA的分子大小、瓊脂糖濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓、電場(chǎng)方向、堿基組成與溫度、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等許多參數(shù)確定。實(shí)驗(yàn)步驟：制膠，加緩沖液，拔梳子，點(diǎn)樣，電泳，紫外（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳(polya

51、crylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 WeintraubL建立。1964年，此法進(jìn)一步從理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上得到改進(jìn)并推廣應(yīng)用。由于具有較高的分辨率和靈活性，目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離和分析。 實(shí)驗(yàn)步驟：安裝玻璃板，灌注分離膠，灌注濃縮膠，根據(jù)需要插入不同的梳子，30min左右加電泳緩沖液，再拔梳子，點(diǎn)樣，電泳染 色： 蛋白質(zhì)電泳中SDS凝膠檢測(cè)常采用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)、硝酸銀染色、熒光染色法硝酸銀染色銀染的機(jī)制:來(lái)源于攝影銀染技術(shù),是將蛋白分子結(jié)合的銀離子還原作成金屬銀。優(yōu)點(diǎn):檢測(cè)靈敏度高,較普通考馬斯亮藍(lán)染

52、色靈敏度要高50-100倍,可在蛋白質(zhì)中找到含量較低的蛋白,而且所需的上樣量較少(每點(diǎn)僅需0.1)。缺點(diǎn):可重復(fù)性差 耗費(fèi)人力 質(zhì)譜測(cè)定有一定的干擾硝酸銀染色染色方法：化學(xué)顯色（雙胺染色）：是利用氨水同硝酸銀進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生銀-雙胺絡(luò)合物,將固定后的凝膠浸泡其中,再通過(guò)酸化使其顯色。（非雙胺染色）：是將固定好的凝膠浸泡于酸性的硝酸銀中,在硝酸銀和蛋白質(zhì)發(fā)生作用后在堿性條件下,用甲醛還原使其顯色。光顯色：是使用光能還原銀離子成金屬銀。因?yàn)楣饽軌蛟谒嵝訮H還原銀,所以一旦凝膠被固定,光顯色能使用單一染色溶液,而不像化學(xué)染色程序那樣通常需要兩種溶液。6.聚丙烯酰胺凝膠的主要優(yōu)點(diǎn)：分辨率高。具有三種效應(yīng)：

53、濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，電荷效應(yīng)；長(zhǎng)度僅僅相差0.2(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分開(kāi)；（例）所能裝載的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高?？筛鶕?jù)被分離物質(zhì)的分子大小控制凝膠濃度制成不同孔徑的凝膠。丙烯酰胺較穩(wěn)定，無(wú)色透明，機(jī)械強(qiáng)度好，易觀察，可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。 7.等電聚焦： 優(yōu)點(diǎn)：分辨率很高；樣品可混入膠中或加在任何位置，在電場(chǎng)中隨著電泳的進(jìn)行區(qū)帶越來(lái)越窄，克服了一般電泳的擴(kuò)散作用。電泳結(jié)束后，可直接測(cè)定蛋白質(zhì)pI。 分離速度快，蛋白質(zhì)可保持原有生物活性缺點(diǎn)： 電泳中應(yīng)使用無(wú)鹽樣品溶液，否則高壓中電流太大而發(fā)熱。但無(wú)鹽時(shí)有些蛋白質(zhì)溶解性能差易發(fā)生

54、沉淀，可在樣品中多加些兩性電解質(zhì)。許多蛋白質(zhì)在pI附近易沉淀而影響分離效果，可加些脲或非離子去垢劑解決。8.雙向電泳第一向根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同在PH梯度膠中等點(diǎn)聚焦。第二向根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小不同在垂直方向或水平方向進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)9.蛋白質(zhì)印跡 蛋白質(zhì)印跡方法將高分辨率的電泳技術(shù)與靈敏的、專(zhuān)一的免疫探測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái),用針對(duì)蛋白特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針進(jìn)行檢測(cè).對(duì)于蛋白質(zhì),通常使用的探針是抗體,它與附著于固定基質(zhì)上的靶蛋白發(fā)生特異性反應(yīng).10、免疫電泳：a、抗原抗體特異性反應(yīng)。b、抗原在pH8.6時(shí)通常帶強(qiáng)負(fù)電，而抗體不帶電。c、抗原在含

55、有抗體的凝膠中電泳時(shí)發(fā)生免疫反應(yīng)，抗原過(guò)量，僅產(chǎn)生可溶性的免疫復(fù)合物與抗原一起向陽(yáng)極移動(dòng)。d、抗原與抗體濃度達(dá)到當(dāng)量點(diǎn)時(shí)，形成免疫沉淀帶免疫電泳(immunoelectrophoresis，IEP)是將區(qū)帶電泳與雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化學(xué)分析技術(shù)。先將蛋白質(zhì)抗原在瓊脂平板上進(jìn)行電泳，使不同的抗原成分因所帶電荷、分子量及構(gòu)型不同，電泳遷移率各異而彼此分離。然后在與電泳方向平行的瓊脂槽內(nèi)加入相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫分散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應(yīng)抗體在瓊脂中擴(kuò)散后相遇，在二者比例合適處形成肉眼可見(jiàn)的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，與已知的標(biāo)準(zhǔn)(或正常)抗原抗體形成的沉淀線比較，即可對(duì)樣品中所含成分及其性質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定。 對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的技術(shù)。在pH8.6的緩沖液中，抗原向正極泳動(dòng)；而抗體大部分屬于Ig，由于分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng) (電滲使液體向負(fù)極泳動(dòng)) 在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。由于電場(chǎng)的作用，限制了抗原、