熒光定量PCR技術(shù)

1、一、HBV DNA熒光定量PCR技術(shù)（一） 標本 血清、血漿（其它如組織細胞、乳汁、精子、尿液等體液）；標本應(yīng)封閉保存， 特別在夏季，如果標本暴露的過久，開蓋保存，很容易出現(xiàn)水分蒸發(fā)，檢測結(jié)果和上一次的檢測結(jié)果會有較大的差異。 環(huán)境條件影響不大， 比如保存在 -8°、 -20°、 24°、還是室溫，對高中低病毒含量的最后的檢測結(jié)果影響不是太大，只要封閉保存就可以。因此 可常溫運輸，但不可泄露。 （二） 檢測方法 國內(nèi)最常使用 PEG （ 聚乙二醇方法 ）法進行核酸提取，采用 TaqMan 探針進行熒光 PCR 擴增。擴增 40 循環(huán)進行結(jié)果分析，如下圖一所示： 典

2、型的雙 S 形的曲線圖，越早出現(xiàn)熒光曲線的病毒含量越高，越晚越低。根據(jù)不同的梯度的四個標準品進行定量。如果血清或標本里面沒有病毒，就是一個陰性直線。 最近我們在徹底解決污染問題之后采用擴增 50 個循環(huán)的方法。 優(yōu)點是讓擴增管里的反應(yīng)液充分反應(yīng)，缺點是如果實驗室存在一個潛在的污染或操作人員操作習(xí)慣不好，很容易出現(xiàn)攜帶污染，造成假陽性。對實驗室的來說不應(yīng)該通過減少擴增的循環(huán)數(shù)來解決污染問題，而應(yīng)該通過科學(xué)的管理，提高試劑的質(zhì)量，以及養(yǎng)成一個良好的操作習(xí)慣，或防污染的習(xí)慣來解決假陽性的問題。增加循環(huán)數(shù)有利于標本檢測結(jié)果的判斷，這將來可能是實驗室發(fā)展的一個趨向。 COBAS TaqMan 技術(shù)在我們

3、國家已經(jīng)有好多實驗室有這種全自動的核酸提取擴增系統(tǒng)，它的優(yōu)勢重點在于檢測病毒含量比較低的血清標本，但是對于病毒含量比較高的，往往出現(xiàn)熒光 PCR 競爭的缺點。 圖一為： PCR 擴增曲線 （三）污染的預(yù)防與排除 PCR 擴增產(chǎn)物污染是 PCR 反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，所以擴增區(qū)的儀器如槍頭等要注意。最可能造成 PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?48000 拷貝 , 因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備

4、； PCR 擴增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和 PCR 擴增；產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備 PCR 擴增 產(chǎn)物分析 產(chǎn)物處理。切記 : 產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。使用一次性吸頭，嚴禁與 PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。 （四）常用儀器 常用的 PCR 儀器： ABI 系列、羅氏系列、安捷倫系列、國產(chǎn) SLAN 等。 （五）臨床意義 檢測血清或血漿 HBV DNA 陽性有什么臨床意義？ 1. 判斷血清中是否有 HBV DNA 的存在 我們檢測到的 H

5、BV DNA 包括 完整 HBV 病毒和 DNA 片段。 目前我們用的 HBV DNA 熒光 PCR 法，還不能區(qū)分是完整病毒還是片段。只要檢測到的病毒載量在檢測線以上就可以定為標本含有 HBV DNA 。 2. 判斷抗病毒療效的評估指標 細胞內(nèi) HBV DNA 和 HBV DNA 確認方法。 病人采用各種抗病毒藥物，比如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋或替米夫定等抗病毒藥物，因為這些藥可以有效的抑制病毒復(fù)制，用藥之前或用藥之后，病人的血清里或外周血白細胞里是不是還有病毒的存在？病毒下降了多少？是不是有病毒的反彈？這是臨床醫(yī)生關(guān)心的問題。隨著抗病毒藥物用藥時間的延長，有些病人血清里面的 HBV D

6、NA 一直處于檢測線以下。因此目前臨床醫(yī)生有一些新的需求，就是能不能確認病人血清里究竟有沒有 HBV DNA 。不同的實驗室報告檢測低限值不一樣，有的實驗室報 <1000 IU ，有的實驗室報 <100 IU ， COBAS TaqMan<12 個， <12 個還是有病毒，血清里究竟有多少個？是臨床急需的一種 HBV DNA 確認方法。即確認血清里面究竟有沒有病毒?，F(xiàn)在已經(jīng)提出一種檢測方法。 3.HBV DNA 陽性與傳染性 感染乙肝病毒 必須達到一定的量，突破各種屏障（ 血液里的補體、細胞因子、抗體等 ），進入肝細胞復(fù)制， 才能達到傳染性的要求，因此并不是接觸到病毒都

7、會被感染 。 HBeAg 的產(chǎn)生與意義 HBeAg 與 HBV DNA 清除的不平衡帶來的異常模式 HBsAg 的包裹與剪切（完整 HBV 形成） 不同形式 HBsAg 的產(chǎn)生與意義?？?HBc 、抗 HBe 和抗 HBs 的產(chǎn)生。四， HBV DNA 定量與乙肝血清學(xué)模式不同組合的意義。 大三陽（ 表面抗原、 E 抗原和核心抗體陽性 ）并抗 HBs 陽性： HBsAg/IgM 。 E 抗原陽性說明病人體內(nèi)的乙肝病毒處于一種活躍性的復(fù)制狀態(tài)。這時有的病人合并表面抗體的陽性，是不是獲得一定的抵抗力？不是。表面抗體往往是病毒復(fù)制時誘發(fā)了機體免疫答應(yīng)而產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這個抗體是針對表面抗原的 IgM

8、 大蛋白抗體。因此它是機體對乙肝病毒復(fù)制免疫反抗的結(jié)果。這時要提高病人或保持病人的免疫功能 ；小三陽并抗 HBs 陽性：病毒活動性復(fù)制、不同型病毒的感染等 ； 抗 HBs 或抗 HBc 與 HBV DNA 同時陽性：細胞內(nèi) HBV 的釋放。 4. 血清游離和細胞內(nèi) HBV 檢測與抗病毒治療的關(guān)系 乙肝病人體內(nèi)的病毒分成兩個病毒狀態(tài)，一個是游離的病毒，一個是細胞內(nèi)的病毒，包括肝細胞和血細胞。游離的病毒意味著要被清除掉的病毒，除了個別的病毒再進入肝細胞，進行感染肝細胞。而細胞內(nèi)的病毒與抗病毒治療的效果更有直接的關(guān)系，如果要徹底清除乙肝病毒，最終檢測肝臟細胞里病毒是陰性。但是肝穿只能局限于肝穿的組織

9、，不能代表整個肝臟。近幾年對外周血 HBV DNA 的研究越來越多，外周血 HBV DNA 先消失，然后肝細胞游離的 DNA 再消失。即通過檢測外周血 HBV DNA 來間接反應(yīng)肝臟細胞里 DNA 是不是存在。雖然不能相互代替，但比血漿里面的 DNA 更進了一步。重性肝炎發(fā)生膽酶分離，檢測不到血清里的病毒，但是外周血里面的 HBV DNA 反而和膽酶分離之前的水平一致。有的臨床研究數(shù)據(jù)報道，如果外周血里的 HBV DNA 逐漸下降或消失，病人基本上得以康復(fù)。外周血 HBV DNA 的檢測對重性肝炎患者的預(yù)后判斷有重要的意義。 5. 血清 cccDNA 與肝臟組織內(nèi) cccDNA 的不同意義 最

10、早的觀點認為 cccDNA 是雙價閉環(huán)環(huán)狀 DNA ，它只在肝細胞里存在。后來越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)，血清里不但有 cccDNA ，而且也有肝組織內(nèi)的 cccDNA 。因為血清里的 cccDNA 是從壞死的肝細胞釋放出來的，并且它是環(huán)狀的，不易被蛋白結(jié)合，也不易被消化，因此與肝組織內(nèi)的 HBV DNA 有著不同的意義。目前認為血清里的 cccDNA 存在是病毒啟動復(fù)制的標志，即病毒正處在復(fù)制的上升期，而肝組織內(nèi)的 cccDNA 是病毒慢性化的標志。如果判斷抗病毒藥物效果，檢測血清里的 cccDNA 沒有太多的意義，而肝組織內(nèi)的 cccDNA 反而有意義。即如果外周血 HBV DNA 已經(jīng)轉(zhuǎn)移到檢

11、測線以下，判斷病毒是不是徹底清除？我們要檢測肝組織內(nèi)的 cccDNA 。血清 cccDNA 陽性代表病毒復(fù)制處在上升期。 （六）生物暴露與措施 1. 無損傷暴露 部位的清洗方法不同， 如果血清濺到衣服上，通過有效的消毒液進行浸泡、清洗，一般浸泡的時間不能低于半個小時；如果濺到皮膚上，直接用洗滌液來洗，不要用力搓，要輕搓，然后用流水沖掉；如果濺到眼睛上，最忌諱的是用力來揉搓眼睛，用清水沖洗，一般病毒很難通過皮膚黏膜。也要對濺到你眼睛的血漿里做一個鑒定，看看它是不是含有病毒，病毒含量高低 。 2.  創(chuàng)傷暴露 確定污染源 HBV 含量狀態(tài)， 如果高于 104 以上，感染的可能性很大，如果

12、低于 104 以下，感染的可能性非常小。要在最短時間內(nèi)要注射有效的高效價免疫球蛋白。 3. 特殊人群的討論 孕婦和兒童。 如果孕婦在懷孕以前是乙肝，盡可能建議孕婦通過干擾素或核苷類似物把體內(nèi)的病毒降到檢測線以下，停藥 3 個月再懷孕。有的孕婦懷孕 7 、 8 個月發(fā)現(xiàn)自己感染了乙肝，這時不主張終止妊娠，應(yīng)該保持自身良好的免疫狀態(tài)和良好的精神狀態(tài)，在孩子出生以后要第一時間使孩子和母親的血液脫離，同時對孩子注射高效價免疫球蛋白?？梢詫δ氀M行檢測，臍血里 HBV DNA 是陰性，孩子就沒被感染。 1、HCV RNA(+)和抗HCV()是（ B ） A 既往感染 B 感染的初期 C 慢性化感染的過程

13、 D 肝癌的早期2、COBAS TaqMAN技術(shù)的優(yōu)勢是（C ） A 重復(fù)性好 B 靈敏度高 C 檢測病毒含量比較低的血清標本 D 檢測病毒含量比較高的血清標本3、關(guān)于HCV RNA核酸提取的注意事項說法錯誤的是(D ) A 核酸裂解時間不應(yīng)太長，避免72溫育處理 B 過柱離心時間和速度應(yīng)均一 C 洗脫液應(yīng)加到層析柱中間 D 配置好的試劑劇烈震蕩混均4、下列哪種疾病屬于慢性病毒感染（ D ） A HAV B HEV C SARS D HCV5、國內(nèi)最常使用的HCV核酸提取方法是（ D ） A PEG B 煮沸法 C 磁珠吸附法 D 層析柱法6、PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題是（A ） A PCR擴增產(chǎn)物污染 B 標本交叉污染 C 大片段核酸的污染 D 反應(yīng)液污染7、如果抗HBS抗體水平和抗HBV DNA同時很高，應(yīng)考慮是( A ) A 不同HBsAg亞型病毒的雙重感染 B 機體免疫清除的重要信息 C 血清轉(zhuǎn)換的標記 D HBV感染急性期8、大三陽并抗HBs陽性說明（ D ） A 細胞內(nèi)HBV的釋放 B 病毒活動性復(fù)制 C 不同型病毒的感染 D